DEL 1 Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight Extract förbättrar bakbensprestanda och dämpar Myosin Heavy Chain IId / IIx-uttryck i gjutna immobiliserade möss

För mer information, vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan 2Institutionen för japansk orientalisk medicin, Graduate School of Medicine and Pharmaceutical Sciences, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan

Korrespondens bör adresseras till Chihiro Tohda; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Mottaget den 14 juni 2019; Reviderad den 13 september 2019; Godkänd 17 september 2019; Publicerat 22 oktober 2019

Akademisk redaktör: Wen-yi Kang

Copyright © 2019 Yoshiyuki Kimbara et al. Detta är en open access-artikel som distribueras under Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att originalverket citeras korrekt.

Skelettmuskelatrofi förekommer vid många kliniska tillstånd, men en farmakologisk behandling har ännu inte fastställts.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight är en örtmedicin som används i traditionell japansk och kinesisk medicin. I den aktuella studien undersökte vi effekten avC. tubulosa extrakt(CTE) på atrofierad muskel in vivo. Vi undersökte också bakbensgjuten immobilisering hos möss och utarbetade en ny typ av bakbens-immobiliserande gjutning, bestående av svampliknande tejp och ett tunt plaströr. Med hjälp av denna metod blev 3 av 4 grupper av möss (n 11 för varje grupp) gjutna immobiliserade i bakbenen och administrerades CTE eller ve vehicle i 13 dagar. En bluffprocedur utfördes hos mössen i den fjärde gruppen som fordonet administrerades till. Därefter skars triceps suraemusklerna (TS) ut. För att analysera effekten av det nya gjutna systemet och CTE-administrering på muskelatrofi utvärderade vi TS våtvikt och myofibertvärsnittsarea (CSA). Vi bestämde också MyHC IId / IIx-uttrycksnivåer genom västerländsk blotting, eftersom deras ökning är ett kännetecken för disuse muskelatrofi, vilket tyder på en långsam till snabb myofibertypförskjutning. Dessutom utförde vi två tester av bakbenets prestanda. Den nya gjutna immobiliseringsmetoden minskade signifikant TS våtvikt och myofiber CSA. Detta åtföljdes av försämring av bakbensfunktionen och en ökning av MyHC IId / IIx-uttrycket. CTE-administrering förändrade inte TS våtvikt eller myofiber CSA; Det visade emellertid en trend av förbättring av förlusten av bakbensfunktionen och undertryckandet av det ökade MyHC IId / IIx-uttrycket hos gjutna immobiliserade möss. Vår nya bakbensgjutna immobiliseringsmetod inducerade effektivt muskelatrofi. CTE påverkade inte muskelmassan men undertryckte övergången från långsam till snabb myofibertyp hos gjutna immobiliserade möss, vilket försämrade bakbensfunktionen.

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

1. Inledning

De patofysiologiska tillstånd som är förknippade med skelettmuskelatrofi inkluderar sarkopeni [1], kakexi [2] och glukokortikoidinducerad skelettmuskelatrofi [3]. Skelettmuskelatrofi orsakas också av långvarig användning [4], vilket kan bero på sängläge [5], applicering av gips för behandling av frakturer eller ligamentskador [6] eller rymdflygning [7]. Eftersom olika sjukdomar kan orsaka detta tillstånd påverkar det en stor andel av befolkningen.

Adekvat motion och näringsterapi är avgörande för att behandla muskelatrofi [8]. Dessutom har vissa studier rapporterat att farmakologiska motåtgärder, inklusive selektiva androgenreceptormodulatorer, humana monoklonala antikroppar mot myostatin och selektiva ghrelinreceptoragonister, är effektiva [9]; Dessa tillvägagångssätt är dock ännu inte etablerade.

De ovan beskrivna muskelatrofiska tillstånden åtföljs av ett skifte i myofibertypprofilen och en minskning av muskelmassan. Muskelnedanvändning orsakad av förlust av neuralt inflytande och mekanisk lossning inducerar en långsam till snabb myofibertypförskjutning och en förändring i myosin heavy chain (MyHC) isoformprofil [10], signalerad av ökningen av MyHC IId / IIx-uttrycksnivåer [11, 12]. En snabb till långsam myofibertypförskjutning induceras istället av glukokortikoidadministrering, kakexi, sepsis och andra faktorer [10].

Cistancheär en örtmedicin som härrör frånCistanche deserticolaY. C. Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, eller C. salsa (C. A. Mey) Beck, enligt den japanska farmakopén [13]. I traditionell japansk (Kampo) och kinesisk medicin används den för att behandla "njurdeficenssyndrom", kännetecknat av infertilitet, systemisk muskelsvaghet (särskilt i rygg och nedre extremiteter) och bensvaghet [14, 15]. Det är känt att det innehåller olika beståndsdelar, inklusive akteosid, echinacosid och isoakteosid [16]. Extraktet av denna ört, eller dess kemiska beståndsdelar, har visat hjärt-, hepato- och neuroprotektiva effekter; antiaging, antifatigue, vasodilatatoriska och afrodisiakum effekter; antioxidant och antiinflammatorisk aktivitet; och förmågan att förbättra minne och lärande [15, 16]. Emellertid, effekten av denna ört för att förebygga eller behandla muskelförtröttande sjukdomar har inte bekräftats. Därför undersökte vi i den aktuella studien effekterna avC. tubulosaextrakt (CTE) som en behandling för muskelatrofi.

För detta ändamål använde vi bakbensgjuten immobilisering för att inducera muskelatrofi hos möss, med särskilt fokus på de material som används i gjutningen. En mängd olika gjutna system har rapporterats, inklusive gips av Paris-gjutningar [17], glasfibergjutningar [18], polypropenmikrocentrifugrör [19], fasthållningsdräktliknande anordningar av bomulls- och stålnät [20], plastpipetter med proximal svampvaddering [21], gjutningar av icke-elastisk bandagetejp och vinylbelagd ståltråd [22], trådinsättning i kombination med metallplattor [23], och användningen av en kirurgisk häftapparat [24]. En idealisk gjutning bör vara minimalt invasiv och icke-terumatisk för att undvika inflammatoriska förändringar eftersom inflammation kan inducera muskelatrofi [25]. Dessutom bör bakbensprestandatester med gjutningen vara möjliga i experimentets slutskede. Dessutom bör rollbesättningen vara lätt att hantera utan speciella kunskaper eller färdigheter; det ska vara lätt, billigt, lätt att köpa och bör inte kräva speciella enheter för applicering och borttagning.

Olika djurmodeller av muskelförtätning har rapporterats. Bakbenslossning har använts ofta [11, 12] men har flera problem, inklusive svansnekros, som kan inducera systemisk inflammation [25]; avvikelse av kroppsvätskor till den kaudala sidan, vilket resulterar i abnormiteter i bakbenets blodkärl [26]; extraordinär mikrogravitation på bakbenet, vilket starkt kan påverka proteinuttrycket, inklusive mitokondriella enzymer [27]. Alla dessa faktorer kan påverka förloppet av muskelförtröttande. En annan metod inducerar muskelatrofi genom att beröva muskeln neuronala ingångar (till exempel via ischiasnervtranssektion) [28]; eftersom muskler är föremål för trofiska faktorer från terminala neuroner [29], kan denna metod, som leder till en ovanlig nästan total denerverad status, förändra processen med muskelatrofi. Djur som utsätts för systemiska störningar som framkallar muskelatrofi, såsom diabetes mellitus [30], njursvikt [31], kortikosteroidadministrering [32] och åldrande eller accelererad åldrande [33, 34], kan användas som modeller av mänskliga sjukdomar; Dessa systemiska tillstånd kan emellertid också störa processen med muskelatrofi.

Således valde vi bakbensgjuten immobilisering för att inducera muskelatrofi, och vi försökte skapa en ny metod för att utföra den hos möss, genom vilken vi undersökte effekterna av CTE på muskelatrofi.

CistancheKosttillskott behandlarNjureSjukdomochÖkarStyrka

2. Material och metoder

2.1 Växtmaterial och extraktion.

CTE förvärvades från Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Japan).

C. tubulosa köttiga stjälkar samlades in från Shinjang Uyghur Aptonom Rayon, Folkrepubliken Kina. Totalt 193 kg blandade pulver av C. tubulosa nedsänktes i 1 883 l 30% etanol. Blandningen återflödes i 2 timmar vid 55–64 °C. Extraktutbytet var 7,2% och innehöll 3,36% akteosid och 12,72% echinacosid.

2.2. Möss.

Vuxna ddY (12 veckor gamla) hanmöss (Japan SLC, Shizuoka, Japan) inrymdes separat i plastburar och hölls vid en 12-timmars ljus / mörk cykel i ett temperaturreglerat (25 ± 2 ° C) vivarium. Alla djur tilläts ad libitum tillgång till vatten och chow (Labo MR-bestånd; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japan).

Alla djurförsök och protokoll utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur på Sugitani Campus vid University of Toyama. Godkännandenumret för djurförsöken är A2016INM-3. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som användes.

2.3 Induktion av muskelatrofi i bakben och CTE-administrering.

Möss delades in i fyra grupper (n 11 per grupp): vid dag 2 bedövades alla möss och deras hår avlägsnades från låret till fotleden med en hårborttagningskräm (Epilat-kräm; Kracie, Tokyo, Japan). Därefter var 3 av 4 grupper gjutna (+) grupper gjutna immobiliserade enligt följande procedur, som visas i figurerna 1 a–1 g:

Steg 1. Skär en EPDM-tätningstejp av gummiskum (Cemedine Corporation, Tokyo, Japan) i en 12 8 25 mm remsa (figur 1 a).

Steg 2. Håll en bakben i fotledens plantarläge och linda den mycket försiktigt vid fotleden med en tätningstejp (figur 1 b).

Steg 3. Skär ett mjukt PVC-isoleringslock TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Japan) och täck över tätningstejpmanschetten. Använd dubbelsidig tejp (PRO SELF praktiskt skuren dubbelsidig tejp J-1300; Nitoms Inc., Tokyo, Japan) för att få dem att följa (figur 1 (c)).

Steg 4. Samla de skurna ändarna på locket; skära vattentät högpresterande tejp (krafttejp; Asahipen Corporation, Osaka, Japan) till ca 4 48 mm storlek och fixa de samlade ändarna (figur 1 (d)).

Steg 5. Lägg en liten bit (ca 5 30 mm) aluminiumfolietejp (AL-30; Nichiban Corporation, Tokyo, Japan) på framsidan av lockets övre ände (figur 1 e).

Steg 6. Skär plasttejpen (vinyl elektrisk isoleringstejp nr 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Japan) till ca 19 × 40 mm och linda locket (figur 1 f).

Steg 7. Utför samma procedur på det kontralaterala bakbenet (figur 1 g).

Immobiliseringsperioden som användes i den aktuella studien var 13 dagar och gjutningar ersattes om ett eller flera av följande tillstånd inträffade: allvarligt pedalödem, bakbensnekros, allvarliga hudsår, lossning av gjutningen på grund av förstörelse eller gjutförskjutning från fotleden. På den återstående gruppen utfördes endast depilering (skenprocedur) och fordon (fysiologisk saltlösning) administrerades i 13 dagar från dagen efter depilering (dag 2). Bland de 3 gjutningsgrupperna (+) administrerades 2 CTE (50 och 100 mg/kg/dag; gjuten (+)/CTE-50-grupp och gjuten (+)/CTE-100-grupp), och en administrerades fordon (gjuten (+)/fordonsgrupp), även från dag 2. CTE löstes upp i fysiologisk saltlösning och administrerades dagligen via oral gavage i 13 dagar.

2.4 Utvärdering av bakbensfunktionen och bakbenets muskelstyrka.

På dag 14 bedövades mössen i den gjutna (+) gruppen igen efter CTE-administrering, och gjutningarna avlägsnades. Nästa dag (dag 15) testades alla möss för bakbensfunktion och muskelstyrka med hjälp av följande två tester:

2.4.1 Mätning av gånghastighet.

En 15 mm bred fyrkantig träplattform hölls horisontellt ca 50 cm från marken. Musen placerades sedan på plattformen, och gånghastigheten bedömdes när djuret korsade plattformen genom att manuellt registrera med hjälp av ett stoppur tiden för att gå ett avstånd på 50 cm. I förväg hade varje mus vant sig vid plattformen genom att korsa den två gånger som ett träningspass.

2.4.2 Provning av fotfel.

För att utvärdera muskelstyrkan i bakbenet utförde vi "fotfelstestet", där varje mus placerades på plattformen igen och antalet bakbensglidningar från plattformen tabellerades. Detta test är en modifierad version av det statiska stavtestet, där flygstavar fixeras med hjälp av en G-klämma och möss görs för att korsa dem [35]. Fotfelstest utfördes tre gånger, och det genomsnittliga antalet fotfall under de tre sessionerna registrerades. Det var ett vilointervall på minst 15 minuter mellan sessionerna.

2.5 Histologiska och morfometriska analyser av Triceps Surae-muskeln.

Efter utvärderingen av bakbensfunktionen bedövades möss djupt och avlivades genom fysiologisk saltlösningsperfusion. Därefter skars triceps surae (TS) musklerna ut från båda sidor av bakbenen; prover från vänster bakben fixerades i 4% paraformaldehyd i PBS-lösning i 24 timmar, överfördes sedan till 30% sackaroslösning i PBS och inkuberades för kryoprotektion och kryosektion. Efter detta skars 12 μm tjocka sektioner längs den mindre axeln från mitten av magen i varje muskel med hjälp av en kryostat (Leica 3050S; Leica systems, Nußloch, Tyskland). Sju till tio sekventiella sektioner monterades på antistripbelagda glasrutschbanor (MAS-GP Type A, Matsunami Glass Industry, Osaka, Japan), torkades omedelbart med en hårtork, lagrades vid 30 ° C och färgades med hematoxylin-eosinfärgning (H-E-färgning, ScyTek Laboratories, Logan, Utah, USA). En representativ sektion per djur, där den korta axelskivan av varje myofiber var tydligt synlig, valdes och dess tvärsnittsarea (CSA) mättes med hjälp av bild J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).

2.6. Västra Blotting.

Totalt protein från höger TS extraherades med följande metod. Rätt TS maldes med sax och snäppfrystes omedelbart i flytande kväve, lagrades vid 30 ° C och homogeniserades senare för att göra en vävnadslysat. Upptinade muskler inkuberades iskallt i 30 min i 2 ml M-PER däggdjursproteinextraktlösning (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA) och homogeniserades sedan. Homogenater centrifugerades sedan vid 4 ° C och 4000 g i 10 minuter och supernatanter samlades in.

10 μg totalt protein i varje muskellysat laddades och separerades av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), följt av elektrotransfer till ett nitrocellulosamembran (0,2 μm, #1620112, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA). Icke-specifik bindning blockerades med 5% fettfri torrmjölk (skummjölkspulver, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) i Tris-buffrad saltlösning med 0,05% Tween 20 (TBS-T). Membranen inkuberades sedan över natten vid 4 ° C med en primär antikropp upplöst i Can Get Signal immunoreaction enhancer solution 1 (Toyobo, Osaka, Japan). Efter omrörning och sköljning med TBS-T inkuberades membranen i 1 timme vid rumstemperatur med pepparrotsperoxidas- (HRP-) konjugerad sekundär antikropp utspädd i Can Get Signal immunoreaction enhancer solution 2 (Toyobo, Osaka, Japan). Signaler på membranen detekterades via elektrokemiluminescens med användning av luminol. Densitometrisk analys utfördes sedan med hjälp av CS Analyzer-programvaran (Atto, Tokyo, Japan). Antikropparna valdes och späddes ut enligt följande: mus anti-MyHC IId/IIx monoklonal antikropp (1: 1000, klon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA), mus anti-GAPDH laddningskontroll monoklonal antikropp (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Kanada) och HRP-konjugerad getantimous IgG polyklonal sekundär antikropp H & L (1: 2000, Abcam, Cam- bridge, Storbritannien).

2.7 Statistiska analyser.

Alla resultat uttrycks som medelvärde ± standardfel i medelvärdet (SEM). Den statistiska signifikansen av jämförelserna mellan grupper verifierades av envägs ANOVA och post hoc Dunnetts tester eller Tukeys HSD-test; Kruskal–Wallis-testet och post hoc Dunns tester; eller tvåvägs ANOVA med upprepade åtgärder och post hoc Dunnetts test. Smirnov–Grubbs test användes för att utesluta avvikande värden. För alla statistiska utvärderingar ansågs p-värden mindre än 0,05 vara statistiskt signifikanta, och alla analyser utfördes med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornien, USA).

CistancheKosttillskott anti-aging och ökar styrkan

3. Resultat

3.1 Djurhälsa och effekt av CTE på kroppsvikt.

I visuellt utseende var bakbenen hos gjutna immobiliserade möss alla atrofiska, jämfört med de hos de gjutna ( )/fordonsgruppsmössen. Gjuten immobilisering resulterade i betydande förluster av kroppsvikt i slutet av studiefasen. Däremot var kroppsviktsförändringar inte signifikanta hos mössen i gipset ( )/fordonsgruppen. De två gjutningarna (+)/CTE-grupperna uppvisade inga signifikanta förändringar i kroppsvikt jämfört med den gjutna (+)/fordonsgruppen (figur 2).

Allvarliga komplikationer i bakbenen hos immobiliserade möss, såsom hudnekros eller kallbrand, observerades inte och inte heller onormalt beteende i vivarium. Milda komplikationer, inklusive fotödem, ytliga hudsår och rubor i bakbenen, sågs emellertid hos alla gjutna immobiliserade möss (figur 1 (h)). Lossning och förskjutning av gjutningen, vilket ledde till gjutbyte, observerades också i de flesta fall.

3.2. Effekt av CTE på muskelstyrka och muskelprestanda.

Den gjutna (+)/fordonsgruppen uppvisade signifikant ökat antal bakbensglidningar i fotfelsprovningen (figur 3 a), och gånghastigheten var betydligt långsammare än i den gjutna ( )/fordonsgruppen (figur 3 b).

CTE-behandling resulterade i en dosberoende tendens till minskade bakbensglidningar. I den gjutna (+)/CTE-100-gruppen tenderade behandlingen att minska (p 0,0604) bakbensglidningar jämfört med den gjutna (+)/fordonsgruppen (figur 3(a)). När det gäller gånghastighet uppvisade både gjutna (+)/CTE-50 och gjutna (+)/CTE-100-grupper inga signifikanta skillnader i gånghastighet jämfört med den gjutna (+)/fordonsgruppen, även om det fanns en liten, obetydlig dosberoende trend mot snabbare hastighet (figur 3 b).

3.3. Våtvikt för TS och Myofiber CSA.

TS våtvikt minskade signifikant med gjuten immobilisering jämfört med gruppen gjuten ( )/fordon (figur 4 a). CTE-administrering påverkade inte TS våtvikt.

Den genomsnittliga myofiber CSA i varje grupp analyserades också. I gruppen gjutna (+)/fordon hittades en signifikant minskning av CSA för myofiber jämfört med gruppen gjutna ( )/fordon (figur 4 b). Myofiber CSA klassificerades vidare och analyserades genom frekvensfördelning, vilket visas i figur 4 (c). Den vanligaste CSA-klassen i gjutna ( )/fordonsgruppen var större än den i gjutna (+)/fordonsgruppen; Procentandelen myofibrer i CSA-klassen 1350-2250 μm2 var, eller tenderade att vara, signifikant högre i gruppen gjutna ( )/fordon än i den gjutna (+)/fordonsgruppen, och den motsatta trenden var uppenbar i CSA-klass 0 900 μm2-grupperna (figur 4 c). CSA-fördelningen påverkades inte av CTE-administrering i de två gjutningarna (+)/CTE-grupperna, jämfört med den gjutna (+)/fordonsgruppen (figur 4 c). Representativa myofiberbilder visas i figur 4 d.

3.4. Effekt av CTE på MyHC IId/IIx-uttrycksnivåer i TS.

Western blotting utfördes i sex representativa prover från varje grupp (figur 5(a)). Dessa prover valdes ut baserat på deras härledning från djur som uppvisade fotfelstestprestanda närmast medelvärdena för sina respektive grupper.

I gjutgruppen (+)/fordonsgruppen ökade MyHC IId/IIx kraftigt jämfört med gjutgruppen ( )/fordonsgruppen. Denna ökning undertrycktes dosberoende av CTE-administrering. I gruppen cast (+)/CTE-100 tenderade MyHC IId/IIx-uttrycket att minska jämfört med den gjutna (+)/fordonsgruppen (p 0,0810) (figur 5 b). GAPDH-uttrycket, som användes som intern kontroll, skilde sig inte signifikant mellan grupper (figur 5 c).

Cistanchetubulosa har många effekter