Del 1: Echinakosid inducerar apoptotisk cancercellsdöd genom att hämma Nukleotidpoolen Sanitizing Enzyme MTh1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakt:Hämning av nukleotidpoolens saneringsenzymet MTH1 orsakar omfattande oxidativa DNA-skador och apoptos i cancerceller och kan därför användas som en anticancerstrategi. Eftersom naturliga produkter har varit en rik källa till läkemedelskemikalier använde vi i denna studie den MTH1-katalyserade enzymatiska reaktionen som en hög genomströmning i en vitro-screeningsanalys för att söka efter naturliga föreningar som kan hämma MTH1.Echinacoside, en förening som härrör från medicinalväxternaCistancheoch Echinacea, hämmade effektivt den katalytiska aktiviteten av MTH1 i en in vitro-analys. Behandling av olika humana cancercellinjer medEchinacosideresulterade i en signifikant ökning av den cellulära nivån av oxiderat guanin (8-oxoguanin), medan nivån av cellulära reaktiva syreämnen förblev oförändrad, vilket indikerar attEchinacosidehämmade också aktiviteten av cellulär MTH1. Följaktligen inducerade Echinacoside-behandling en omedelbar och dramatisk ökning av DNA-skademarkörer och uppreglering av G1/S-CDK-hämmaren p21, som följdes av markant apoptotisk celldöd och cellcykelstopp i cancer men inte i icke-cancerceller. Sammantaget identifierade dessa studier en naturlig förening som en MTH1-hämmare och tyder på att naturliga produkter kan vara en viktig källa till anticancermedel.

Nyckelord: Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, DNA-skada, apoptos, cellcykelstopp

Cistancheextrakt haranti-cancerhälsofördelar

Klicka här för del 2

Introduktion

Den cellulära och mitokondriella nukleosidtrifosfat (NTP) och deoxinukleosidtrifosfat (dNTP) poolen är ett betydande mål för olika reaktiva syrearter (ROS).1–3 Eftersom specificiteten för DNA-polymeraser är mindre än perfekt, kan 4,5 oxiderade dNTPs vara införlivas i nysyntetiserat DNA för att orsaka genetiska avvikelser om de inte fixeras.6 Till exempel kan den huvudsakliga oxiderade basen i nukleotidpoolen, 8-oxoguanin (8-oxoG), basparas med cytosin och adenin. När det sätts in i motsatt adenin under DNA-replikering, kan det potentiellt orsaka T: A=G: C-transversion,7 vilket är en av de vanligaste mutationerna som finns i humana cancerformer.8,9 Även om de flesta av de oxiderade fria dNTP:erna avlägsnas av nukleotidpoolsaneringsenzymer, har tidigare studier visat att nukleotidpoolen fortfarande är en viktig källa till oxiderade baser i DNA-molekyler och en betydande bidragande orsak till oxidativa DNA-skador.3,10 det viktigaste enzymet för sanering av nukleotid pooler.15 Icke desto mindre, även under övervakning av nukleotidpoolens saneringsenzymer, inkorporeras en betydande del av oxiderade dNTPs i DNA, och baser i DNA-molekyler kan också oxideras direkt av ROS.6 Celler förlitar sig sedan på mer utarbetade strategier som involverar olika DNA-glykosylaser, såsom OGG1 och MUTYH, och DNA-reparationsprocesser, inklusive basexcisionsreparation (BER) och felmatchningsreparation (MMR), för att fixa problematiska baser i DNA-molekyler.10,16,17 BER a nd MMR reparerar normalt många oxiderade baser i DNA per dag och spelar därför viktiga roller för att skydda genomets integritet och stabilitet.

I celler som är under förhöjd oxidativ stress kan ökad inkorporering av oxiderade nukleotider i DNA överväldiga den cellulära reparationskapaciteten och utlösa DNA-skadarespons (DDR).18 Ihållande DDR-signalering kommer att leda till cellcykelstopp, för tidig cellulär åldrande, ellerapoptos, vilket sätter en barriär för tumörbildning.19 Ändå, även om cancerceller uppvisar starkt ökad oxidativ spänning och genererar en potentiellt dödlig börda av oxiderade nukleotider,20 kan de överleva den DDR-associerade senescensen ellerapoptos.21 Ett stort antal studier har visat att MTH1, genom att effektivt ta bort det farligt rikliga 8-oxodGTP och 2-OH-dATP i tumörceller, spelar en nyckelroll i utvecklingen av cancer.22 MTH1 var visade sig vara överuttryckt i olika typer av cancer, 23–25 och 8-oxoG-nivåer, och omfattningen av oxidativa DNA-lesioner var lägre i tumörer än i de omgivande normala vävnaderna.26–28 Funktionellt minskade överuttrycket av MTH1 signifikant. antalet DNA-mutationer som setts i MMR-defekta musembryonala fibroblaster10 och tillät celler att övervinna onkogen Ras-inducerad för tidig cellulär senescens och apoptos;29 medan undertryckandet av MTH1 förhindrade utvecklingen av cancer i OGG-{18}}bristade möss30 och främjade ROS-inducerad DDR och cellulär senescens i Ras-transformerade celler.3,29,31 Således, även om MTH1 spelar en skyddande roll genom att förhindra ROS-inducerade mutationer i friska celler, fann dessa studier att MTH1 är särskilt nödvändigt för uppkomst och överlevnad av cancerceller. Nyligen genomförda studier har gett fler bevis för att stödja MTH1:s roll i cancerutveckling.31–34 Undertryckande av MTH1 av RNAi eller små molekylhämmare i olika cancercellinjer resulterade i markant ökad inkorporering av 8-oxo dG i genomiskt DNA , vilket ledde till omfattande DNA-skador, apoptotisk celldöd och minskad cancercellöverlevnad.32,33 I musxenotransplantatstudier undertryckte hämning av MTH1 effektivt tillväxten av cancerexplantat. Viktigt är att undertryckandet av MTH1 inte påverkade tillväxten och överlevnaden av normala celler, förmodligen för att normala celler har lägre ROS och därför är mindre beroende av MTH1 för överlevnad.32,33 Dessa fynd tyder på att hämning av MTH1 är en lovande ny strategi för att bekämpa cancer.

Naturliga produkter har varit en rik källa till medicinska föreningar.35 Många moderna läkemedel, inklusive anticancerläkemedel, har härletts från växtbaserade eller botaniska preparat.36–39 Ändå föreslog ett stort antal traditionella örter att ha olika terapeutiska egenskaper för att förbli att karakteriseras, till stor del på grund av svårigheter att kontrollera deras sammansättningar för att entydigt definiera deras effektivitet och verkningsmekanismer.40 Nya tillvägagångssätt som möjliggör detektering av aktiva föreningar och analys av molekylära mekanismer behövs. I detta avseende kan målstyrd in vitro-screening med hög genomströmning vara avgörande för att hitta mekanistiskt definierade medicinska föreningar från naturresurser. I den aktuella studien använde vi den MTH1-katalyserade enzymatiska reaktionen som en in vitro-analys med hög genomströmning för att söka efter naturliga föreningar som kan hämma MTH1. Överraskande nog avslöjade visningen detEchinacoside, en naturlig produkt som är mest känd för sin potenta antioxidativa aktivitet, kan hämma MTH1.

Echinacosidei cistanche kananti-apoptos

Material och metoder

Material

Naturliga örtföreningar köptes från Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Folkrepubliken Kina. Namn, katalognummer, Chemical Abstracts Service (CAS) registernummer och renhet för varje förening anges i Tabell S1. Stamlösningar av föreningarna framställdes i 100 procent dimetylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), och arbetslösningar framställdes i analysbuffert eller komplett cellodlingsmedium. Samma lösning utan testföreningen men innehållande samma mängd DMSO användes som vehikelkontroll. (S)-crizotinib köptes från Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

in vitro-screening

Den enzymatiska analysen in vitro som användes för att screena naturliga växtbaserade föreningar följde procedurerna beskrivna av Gad et al.32 Kortfattat framställdes serieutspädningar av individuella föreningar i analysbufferten bestående av 100 mM Tris- acetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg-acetat, 0,005 procent Tween 20 och 1 mM DTT. Därefter tillsattes 0,5 nM rekombinant humanMTH1 (Abcam, Cambridge, Storbritannien), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) och 0,2 U/mL oorganiska pyrofosfataser (Thermo Fisher Scientific) och plattorna inkuberades på en tallrikskakare i 1 timme vid rumstemperatur. Den slutliga reaktionsvolymen var 100 μL i en 96-brunnsplatta. Vid slutet av reaktionen tillsattes malakitgrönt (J&K Scientific, Peking, Kina)41, och plattorna inkuberades vid rumstemperatur i ytterligare 15 minuter. Absorbans vid 630 nm mättes med en BioRad 680 mikroplattläsare (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Värden för hämmande koncentration (IC50) bestämdes genom ickelinjär regressionsanalys med användning av programvaran GraphPad Prism.

cell kultur

Humant MG-63 osteosarkom, SK-HEP-1hepatokarcinom, MCF7 bröstcancer, SW480 kolorektal cancer, HEK293 embryonal njure och NIH/3T3 fibroblastcellinjer från mus kom från American Type Culture Collection och den mänskliga normala levercellinjen L-O2 köptes från KenGen Biotech, Nanjing, Folkrepubliken Kina. Dessa celler hölls vid 37 grader i en fuktad atmosfär med 5 procent CO2, enligt instruktioner från leverantörerna. Inget etiskt uttalande krävdes från den institutionella granskningsnämnden för användningen av dessa cellinjer.

Mätning av intracellulära {{0}}oxo Intracellulära 8-oxoG-nivåer mättes genom färgning med Cy3-konjugerat avidin.42 Totalt 1×104 celler var sådd på ett runt täckglas i 12-brunnsplattor. Nästa dag behandlades cellerna med 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar och fixerades sedan med is -kall metanol i 20 minuter, följt av inkubation i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 0,1 procent Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 15 minuter. Proverna blockerades i TBS med 0,1 procent Triton X-100 och 15 procent fetalt bovint serum i 1 timme vid rumstemperatur och färgades sedan med Cy3-konjugerat avidin (0,5 ug/ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) i blockeringslösning i 1 timme vid 37 grader. Efter tvätt i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) 3 gånger i 5 minuter, förseglades täckglasen på insektsskydd av glasglas, monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA , USA). Bilder togs och analyserades med ett Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop.

Mätning av intracellulära ROS-nivåer Intracellulära ROS-nivåer mättes med flödescytometri med användning av ett cellbaserat ROS-analyskit (Beyotime Biotechnology, Haimen, Folkrepubliken Kina). Celler odlade i plattor med sex brunnar behandlades med 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar, tvättades två gånger med PBS och inkuberades med 10 μM diklorfluoresceindiacetat i 30 minuter vid 37 grader. Cellerna trypsiniserades sedan och analyserades med FACSCaliber flödescytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Intracellulära ROS-nivåer uttrycktes som den genomsnittliga diklordihydrofluoresceinfluorescensintensiteten hos cellerna. De visade siffrorna var medelvärden av tre oberoende experiment.

Immunfluorescerande färgning

Celler odlade på täckglas behandlades med {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar och tvättades sedan en gång med PBS, fixerad med 4 procent paraformaldehyd i PBS i 20 minuter och blockerad i TBS med 0,1 procent Triton X-100 och 15 procent fetalt bovint serum i 1 timme vid rumstemperatur. Fixerade celler färgades under 2 timmar vid rumstemperatur med en primär antikropp mot 8-oxoG (mus monoklonal anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (kanin anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA), eller aktivt kaspas-3 (kanin-anti-kaspas-3, Bioss, Beijing, Folkrepubliken Kina), följt av färgning med en Alexa 488-konjugerad åsneantimus ( Abcam) eller Cy3-konjugerad get-anti-kanin (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) sekundär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur. Efter tvätt i PBS 3 gånger under 5 minuter förseglades täckglasen på glasskivor i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories). Bilderna togs med ett Zeiss LCM 510 konfokalmikroskop.

kolonibildningsanalys

Dagen före behandling såddes celler i en platta med sex brunnar i en koncentration av 1×104 celler per brunn. De behandlades sedan med 0 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 7 dagar. Efter tvättning med PBS fixerades cellerna med iskall metanol och färgades med kristallviolett lösning (Sigma-Aldrich) (0,5 procent i 25 procent metanol). Bilder fotograferades efter torkning av plattorna över natten. De kristallvioletta kristallerna löstes upp genom tillsats av 70 procent etanol, och absorbansen vid 595 nm mättes med en BioRad 680 mikroplattläsare. Data analyserades med hjälp av programvaran GraphPad Prism.

MTT-analys

En dag före behandling såddes celler i 96-brunnsplattor i en koncentration av 1×104 celler per brunn, följt av behandling med serieutspädningar av Echinacoside i 24 timmar eller 48 timmar, eller med 60 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar , eller 24 timmar. Mediet avlägsnades och cellerna tvättades med PBS och sedan 20 μL 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,{{15} }difenyltetrazoliumbromid (MTT)-lösning (5 mg/ml i PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) sattes till varje brunn. Plattorna inkuberades vid 37 grader i ytterligare 4 timmar. Till slut togs MTT-lösningen bort och 150 μL DMSO sattes till varje brunn. Plattorna inkuberades på en plattskakare under 10 minuter och absorbansen vid 570 nm mättes med en BioRad 680 mikroplattläsare. Varje experiment utfördes två gånger i tre exemplar. Data analyserades med hjälp av programvaran GraphPad Prism. IC50-värden bestämdes med användning av icke-linjär regressionsanalys.

cellcykelanalys

Celler i plattor med sex brunnar behandlades med 0 μM, 6{{10}} μM eller 80 μM Echinacoside under 24 timmar, skördade med trypsin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tvättades två gånger med PBS och fixerades sedan med iskall etanol (70 procent) i 2 timmar vid -20 grader. Fixerade celler tvättades två gånger i kall PBS och återsuspenderades i 300 μL nyberedd PBS med 0,1 procent Triton X-100, 0,2 mg/ml DNasfritt RNas A (Sigma-Aldrich), 10 ug/ml propidiumjodid ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Schweiz). Efter inkubation vid 37 grader i mörker under 20 minuter filtrerades cellerna genom ett Falcon-nylonnät (BD Biosciences), laddades på FAC-SCalibur-flödescytometern och analyserades med hjälp av ModFit-mjukvaran (BD Biosciences).

DNA-fragmenteringsanalys

Celler odlade i plattor med sex brunnar behandlades med 0 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 24 timmar och fixerades i iskall 4 procent paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) i 20 minuter. Efter tvättning med PBS förseglades cellerna i VECTASHIELD monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories). Kärnmorfologi fotograferades med ett Olympus fluorescerande mikroskop. För att detektera DNA-fragmentering på agarosgeler extraherades DNA med användning av QIAamp DNA-mikrokit (Qiagen NV, Venlo, Nederländerna), och elektrofores utfördes på 2 procent agarosgeler innehållande 0,1 ug/ml etidiumbromid.

Analys av apoptos med flödescytometri Apoptotiska celler undersöktes med användning av ett Annexin V-FITC Apoptos-detektionskit (Bestbio, Shanghai, Folkrepubliken Kina), enligt tillverkarens instruktioner. Celler odlade i 96-brunnsplattor behandlades med 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM eller 160 μM Echinacoside i 2 timmar, 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar, tvättades två gånger med PBS och återsuspenderades sedan i en bindningsbuffert. Därefter tillsattes 5 μL annexin V-FITC och 5 μL PI (Roche) sekventiellt och cellerna inkuberades i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur. Cellerna laddades på FACSCalibur-flödescytometern (BD Biosciences), och data analyserades med hjälp av Cell Quest-mjukvaran (BD Biosciences).

Western blot-analys

Celler odlade i plattor med sex brunnar behandlades med 0 μM, 6{{10}} μM eller 80 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar, tvättades två gånger med PBS och skrapades av plattan med 100 μL radioimmunoutfällningsbuffert (150 mM NaCl, 1,0 procent IGEPAL CA-630, 0,5 procent natriumdeoxicholat, 0,1 procent natriumdodecylsulfat och 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) innehållande 1 mM fenylmetansulfonylfluorid. Prover centrifugerades vid 12,000× g i 20 minuter vid 4 grader. Proteinkoncentrationer i supernatanterna bestämdes med Bradford-reagenset (Dingguo, Changchun, Folkrepubliken Kina). Prover denaturerades vid 95 grader i 10 minuter och separerades på 12 procent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforesgel. Efter elektrofores överfördes proteiner till polyvinylidenfluoridmembran (Millipore), följt av blockering i Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 % Tween 20) innehållande 5 % (vikt/volym) fettfri mjölk i 1 timme vid rumstemperatur. Blottar undersöktes med primära antikroppar mot p21 (Abcam), poly (ADP-ribos) polymeras (Bioss) eller aktiverat kaspas -3 (Bioss), följt av pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signaler utvecklades med hjälp av det förbättrade kemiluminescens Western blotting-detektionskit (Transgen Biotech, Changchun, Folkrepubliken Kina). Experimenten upprepades tre gånger.

Echinacosidei cistanche kananti-apoptosochantioxidation

Mätning av mitokondrie

membranpotential

Mitokondriell membranpotential mättes med JC{{0}}-färgämnet (bioteknologi), enligt tillverkarens instruktioner. Celler odlade i plattor med sex brunnar behandlades med 0 μM, 60 μM eller 80 μM Echinacoside i 5 timmar, 12 timmar eller 24 timmar, tvättades två gånger i PBS och inkuberades sedan med JC -1 i 20 minuter. Bilderna togs med ett Olympus fluorescerande mikroskop.

Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med användning av GraphPad Prism Software. Signifikans beräknades med en enkelriktad variansanalys och P0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Resultaten uttrycktes som medel ± standardavvikelse.

Echinacosidei cistanche kananti-apoptosoch förbättra immuniteten