DEL 1 Echinacosid inducerar råtta lungartär vasorelaxation genom att öppna NO-cGMP-PKG-BKCa-kanalerna och minska intracellulära Ca2 + -nivåer

Hur inducerar echinacosid venös avslappning?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri-li GE1, 2, * 1 Institutionen för farmakologi, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Kina; 2 Forskningscenter för höghöjdsmedicin, Medical College of Qinghai University, Xining 810001, Kina; 3 School of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, Kina; 4 Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810001, Kina

Sikta:Ihållande pulmonell vasokonstriktion som upplevs på hög höjd kan leda till pulmonell hypertension (PH). Huvudsyftet med denna studie är att undersöka den vasorelaxanta effekten avechinacosid(ECH), en fenyletanoidglykosid från den tibetanska örten Lagotis brevituba Maxim ochCistanche tubulosa, på lungartären och dess potentiella mekanism.

Metoder:Lungartärringar erhållna från manliga Wistar-råttor suspenderades i organkammare fyllda med Krebs-Henseleit-lösning, och isometrisk spänning mättes med hjälp av en kraftgivare. Intracellulära Ca2+-nivåer mättes i odlade råttpulmonella arteriella glattmuskelceller (PASMC) med fluo 4-AM.

Resultat: ECH(30–300 μmol/L) avslappnade lungartärer hos råtta på förhand som kontrakterats av noradrenalin (NE) på ett koncentrationsberoende sätt, och denna effekt kunde observeras i både intakta endotel- och endoteldenuderade ringar, men med ett signifikant lägre maximalt svar och ett högre EC50 i endoteldenuderade ringar. Denna effekt blockerades signifikant av L-NAME, TEA och BaCl2. IMT, 4-AP och Gli hämmade dock inteECH-inducerad avslappning. Under extracellulära Ca2+-fria förhållanden reducerades den maximala sammandragningen till 24,54 % ±2,97 % respektive 10,60 % ±2,07 % i ringar behandlade med 100 respektive 300 μmol/L ECH. Under extracellulära kalciuminflödesbetingelser reducerades den maximala sammandragningen till 112,42% ±7,30%, 100,29% ±8,66% och 74,74% ±4,95% i ringar behandlade med 30, 100 respektive 300 μmol / L ECH. Efter att cellerna laddats med Fluo 4-AM var den genomsnittliga fluorescensintensiteten lägre i celler som behandlades medECH(100 μmol/L) än med NE.

Slutsats: ECHundertrycker NE-inducerad sammandragning av råttpulmonellartär genom att minska intracellulära Ca2 + -nivåer och inducerar dess avslappning genom NO-cGMP-vägen och öppningen av K + -kanaler (BKCa och KIR).

Nyckelord:Tibetansk ört;echinacosid; pulmonell hypertension; hög höjd; vasorelaxation; NEJ; BKCa; KIR; artärring; pulmonella arteriella glatta muskelceller.

För mer information, vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Införandet

Ihållande pulmonell vasokonstriktion som upplevs på hög höjd kan leda till pulmonell hypertension (PH) och medial hypertrofi[1], som har identifierats som den främsta orsaken till högerkammarhypertrofi och hjärtsvikt[2]. Individer som lever på hög höjd, antingen tillfälligt eller permanent, kan uppvisa mild till måttlig pulmonell hypertension, och de med större mottaglighet för hypoxi kan ha överdriven pulmonell vasokonstriktion, vilket leder till olika höghöjdssjukdomar som är förknippade med signifikant sjuklighet och dödlighet, såsom lungödem på hög höjd och hjärtsjukdomar[3].Echinacosid(Europakonventionen) (Figur 1) är enfenyletanoidglykosidfinns i en mängd olika kinesiska örter som den tibetanska örten Lagotis brevituba Maxim ochCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim ingår i släktet Lagos och familjen Scrophulariaceae.ECHhar olika önskvärda farmakologiska egenskaper, såsom antioxidativa, antiinflammatoriska, neuroprotektiva, hepatoprotektiva och kväveoxid (NO) radikalrensande egenskaper[6]. Det kan också framkalla endotelberoende avslappning i råttans bröstkorgs aortaringar och bota hjärt-kärlsjukdomar[7]. Såvitt vi vet har det dock inte gjorts någon studie som undersökt dess effekter på kärltonen i lungartärerna. Syftet med denna studie är följande: (1) att undersöka om ECH inducerar vasorelaxation in vitro i råttpulmonellartärer som är förkontrakterade med noradrenalin (NE), och om denna effekt, om någon, är endotelberoende eller verkar direkt på vaskulär glatt muskulatur; 2) undersöka effekten av ECH på extracellulärt kalciuminflöde och intracellulär kalciumfrisättning i råttpulmonella arteriella glattmuskelceller (PASMC), och (3) att identifiera möjliga vägar och K + -kanaler som är involverade i ECH-inducerad avkoppling.

Material och metoder

Reagenser

ECH tillhandahölls vänligen av Dr. Peng-fei TU från Peking University (Peking, Kina), med en renhet på mer än 98% som bestäms av högpresterande vätskekromatografi. Dimetylsulfoxid (DMSO) köptes från Solar Science & Technology Co, Ltd (Peking, Kina); NE, acetylkolin (ACh, ≥99%), indometacin (IMT), Nω-Nitro-L-argininmetylesterhydroklorid (L-NAME), tetraetylammoniumklorid (TEA), bariumklorid (BaCl2), 4-aminopyridin (4-AP) och glibenklamid (Gli) från Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA); Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), fetalt bovint serum (FBS) och trypsin från Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, USA); mus anti-råtta primär α glatt muskelaktin (α-SMA) antikropp och get anti-mus sekundär antikropp från Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Kina); Fluo calcium indicators (Fluo 4-AM) från Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, USA); och alla oorganiska salter från Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Peking, Kina). IMT löstes i DMSO och 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM och ECH löstes i DMSO, och alla andra reagenser löstes i Krebs-Henseleit (KH) eller PBS-lösning. Preliminära experiment visade att DMSO vid mindre än 0,1% (v / v) inte hade någon effekt på spänningsutvecklingen hos isolerade lungarteriella ringar.

Försöksdjur

Alla procedurer och protokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid Medical College of Qinghai University. Manliga Wistar-råttor, 6-8 veckor gamla, 250-300 g kroppsvikt, köptes från Animal Center of Lanzhou University (Lanzhou, Kina) och upprätthölls på en standard laboratoriediet och kranvatten ad libitum vid en omgivningstemperatur på 22±2 ° C och relativ fuktighet på 45% -55% under experimenten.

In vitro lungartärperfusion

Framställning av råtta lungarteriella ringar

Råttor som vägde 250–300 g bedövades genom intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (40 mg/kg), och därefter avlägsnades deras hjärtan och lungor och nedsänktes omedelbart i iskall KH-lösning innehållande (i mmol/L): 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 och 11,1 glukos (pH 7,4). De intrapulmonära artärerna (0,7–1,5 mm i diameter) dissekerades fria från omgivande bindväv och adventitia och skars sedan i ringar med en längd på cirka 2–3 mm. Ringarna suspenderades i orgelkammare fyllda med 10 ml KH-lösning vid 37 ° C och gasades med 95% O2-5% CO2 [8], och isometrisk spänning mättes med hjälp av en kraftgivare (JH-2, Space Medico-Engineering Institute, Peking, Kina)

Bedömning av fartygsringaktivitet och endotelfunktionsbedömning

Kärlringar fick jämvikta i 2 timmar under en basalspänning på 400 mg, under vilken tid KH-lösningen byttes var 15: e minut; sedan tillsattes 1 μmol / L NE i kammaren för att bedöma aktiviteten hos varje ring genom att detektera sammandragningsprocent. Före och efter experimentprotokollet mättes sammandragningsprocenten (figur 2A och 2B). Endotel avlägsnades i vissa ringar genom att försiktigt gnugga den intima ytan med en fin ståltråd, och integriteten bedömdes kvalitativt av graden av avslappning orsakad av ACh (10 μmol / L) i procentandelen kontraktil ton inducerad av NE (1 μmol / L). Om avslappningen med ACh var större än 80%, förblev endotelet i gott skick; om avslappningen var mindre än 30 % förstördes endotelet (figur 2A och 2B)[9].

Isolering och kultur av råtta PASMC

Distala lungartärer isolerades från lunglober hos råttor, och endotelet och adventitia avlägsnades försiktigt. Efter att vävnaderna malets i 2 mm bitar tillsattes de omedelbart till kolvarna, hölls vid 37 °C och 5 % CO2 i en fuktad inkubator i cirka fyra timmar och odlades sedan med DMEM med hög glukoshalt kompletterad med 20 % FBS, 100 U/ml penicillin och 100 U/ml streptomycin i cirka fem dagar. Hälften av odlingsmedierna ersattes med färska medier när celler uppstod. När cellerna nådde 80% sammanflöde skördades de med 0,125% trypsin och såddes i kolvarna (1: 2-förhållande) innehållande HÖGGLUKOS DMEM kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 U / ml streptomycin. Celler med tre till åtta passager användes för alla experiment.

Identifiering av PASMC genom immunohistokemi

PASMC var positiva för immunokemisk färgning när typiska "kulle och dal" -egenskaper observerades. Cellerna såddes i 6-brunnsplattor med glasöverdrag. När cellerna nådde 80% sammanflöde fixerades de i 4% paraformaldehyd, blockerades med 3% väteperoxid i 15 minuter och inkuberades sedan med mus anti-råtta primär α-SMA-antikropp över natten vid 4 ° C. Efter att ha tvättats tre gånger i PBS i 10 minuter inkuberades cellerna med getantimus sekundär antikropp vid rumstemperatur i 45 minuter, tvättades igen tre gånger i PBS i 10 minuter och visualiserades med diaminobenzidin.

Detektion av den intracellulära kalciumkoncentrationen hos pasmc från råtta

PASMC såddes i 6-brunnsplattor med glasöverdrag. När cellerna nådde 80% sammanflöde ersattes odlingsmediet med serumfritt DMEM. Tjugofyra timmar senare laddades cellerna med 7 μmol / L Fluo 4-AM vid 37 ° C i 30 min i en fuktig atmosfär med 5% CO2. Restfärgämnet tvättades med Hanks HBSS-lösning (Balanced Salt Solution) innehållande följande (i mmol/L): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 och 5,56 D-glukos, utan fenolrött. Celler laddade med Fluo 4-AM utsattes för ett av tre behandlingsbetingelser: (1) kontrollgruppen (con-gruppen), där celler inkuberades med serumfritt DMEM; (2) NE-gruppen, i vilken cellerna inkuberades med serumfritt DMEM kompletterat med 1 μmol/L NE under 10 minuter; och (3) NE+ECH-gruppen (100 μmol/L) (NE+ECH100-gruppen), där cellerna inkuberades med serumfritt DMEM kompletterat med 1 μmol/L NE i 10 min och 100 μmol/L ECH i 20 minuter. Fluorescensintensiteten observerades och fotograferades med fluorescensmikroskopi (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)[11]. Sex synfält (200×) samlades in för varje prov. Intracellulär kalciumkoncentration kvantifierades genom att mäta genomsnittlig fluorescensintensitet med hjälp av Programvaran Image Pro-Plus 6.0.

Statistisk analys

Data uttrycktes som medelvärdet±SD. När en lämplig, signifikant skillnad bedömdes av Dunnetts test eller Student-Newman-Keuls-testet för flera jämförelser efter envägsanalys av varians (ANOVA). En sannolikhetsnivå på P<0.05 was="" considered="">

Resultat Vasorelaxant effekter av ECH på isolerad lungartär

I början av experimentet hade den kumulativa tillsatsen av ECH från 30 till 300 μmol / L ingen signifikant effekt på lungartärens basalspänning. Efter att den NE-inducerade vasokonstriktionen nått en platå tillsattes ECH kumulativt (30–300 μmol/L) till det intakta endotelet (E+, figur 2C) eller endoteldenuderade ringarna (E–, figur 2C). I intakta endotelringar utvidgade kumulativ tillsats av ECH kärlen på ett koncentrationsberoende sätt, med en maxi-

mamma avslappningsprocent på 89,22% ±0,32% vid 300 μmol / L och en EC50 på 51,60±0,57 μmol / L (figur 2A och 2C). På samma sätt utvidgade ECH i endoteldenuderade ringar också kärlen på ett koncentrationsberoende sätt, men med ett signifikant lägre maximalt svar på 67,72% ±1,69% (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Effekter av ECH på intracellulär kalciumfrisättning och extracellulär kalciumtillströmning

De endoteldenuderade ringarna utsattes för 1 μmol /L NE tills maximal sammandragning uppnåddes. Under extracellulära Ca2+-fria förhållanden jämviktades ringarna i Ca2+-fri KH-lösning innehållande 0,2 mmol/L EGTA innan experimenten inleddes. Efter tre tvättar med Ca2+- och EGTA-fri KH-lösning förinkuberades ringarna med ECH (30, 100 och 300 μmol/L) i 20 minuter och exponerades sedan på nytt till 1 μmol/L NE. Ringarna producerade

oavslutade sammandragningar som snabbt återgick till baslinjen, jämfört med de initiala sammandragningarna inducerade av NE, som fungerade som referens. Den maximala sammandragningen av kontrollen var 33,27 % ±2,94 % (figur 3A och 3E) men reducerades signifikant till 24,54 % ±2,97 % respektive 10,60 % ± 2,07 % i ringar som förbehandlades med 100 respektive 300 μmol/L ECH (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Roller av olika hämmare i ECH-inducerad råtta lungartär vasorelaxation

ECH-inducerad råttpulmonell artärvasorelaxation undersöktes i närvaro eller frånvaro av följande hämmare: L-NAME (eNOS-hämmare), IMT (cyklooxygenashämmare), TEA (ca2+-aktiverad K+-kanalhämmare med stor konduktans), BaCl2 (inåtgående likriktare K+-kanalhämmare), 4-AP (spänningsberoende K+-kanalhämmare) och Gli (ATP-känslig K+-kanalhämmare). Ringarna kontraherades maximalt med 1 μmol/L NE, och sedan tillsattes L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L), BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) respektive Gli (10 μmol/L). När en ny platå nåddes tillsattes ECH på ett kumulativt sätt från 30 till 300 μmol / L. Koncentrations-responskurvorna i närvaro av olika hämmare visas i figur 4. Den vasorelaxanta effekten av ECH på lungartärringar kontraherade med 1 μmol / L NE blockerades signifikant av L-NAME (100 μmol / L), TEA (1 mmol / L) och BaCl2 (1 mmol / L), med maximala avslappningar på 64,41% ±3,20%, 84,38% ±0,70% respektive 75,27% ±0,93% (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identifiering av pasmc för råtta

Vid låg förstoring var spindelceller tätt packade och nästan alla celler färgades positivt för PASMC (PASMC-renheten var >95%) (Figur 6A). Brunfärgade myofilament observerades tydligt i cytoplasman vid hög förstoring (figur 6B).

Cistancheechinacosidkan motståapoptos

Effekt av ECH på den intracellulära kalciumkoncentrationen hos råtta PASMC

NE (1 μmol/L) ökade signifikant den intracellulära kalciumkoncentrationen (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">