Del 1|Genetisk variation implicerar plasmaangiopoietin-2 i utvecklingen av subfenotyper för akuta njurskador

Pavan K. Bhatraju1,2*, Max Cohen1, Ryan J. Nagao3,4, Eric D. Morrell1, Susanna Kosamo1, Xin-Ya Chai1, Robin Nance5, Victoria Dmyterko1, Joseph Delaney5, Jason D. Christie6, Kathleen D. Liu7, Carmen Mikacenic1, Sina A. Gharib1, W. Conrad Liles8, Ying Zheng3,4, David C. Christiani9,10, Jonathan Himmelfarb2 och Mark M. Wurfel1,2

Abstrakt

Bakgrund:Vi har tidigare identifierat tvåakutnjureskada(AKI) subfenotyper (AKI-SP1 och AKI-SP2) med olika risker för dåliga kliniska resultat och svar på vasopressorterapi. Plasmabiomarkörer för endotelial dysfunktion (tumörnekrosfaktorreceptor-1, angiopoietin-1 och 2) differentierade AKI-subfenotyperna.

Det är dock okänt om dessa biomarkörer helt enkelt är markörer eller kausala mediatorer i utvecklingen av AKI-subfenotyper.

Metoder:Vi testade för associationer mellan enkelnukleotidpolymorfismer inomAngiopoietin-1, Angiopoietin-2,ochTumörnekrosfaktorreceptor 1Agener och AKI-SP2 i 421 kritiskt sjuka ämnen av europeisk härkomst. Topppresterande enkelnukleotidpolymorfismer (FDR < 0.05)="" testades="" för="" cis-biomarköruttryck="" och="" om="" genetisk="" risk="" för="" aki-sp2="" medieras="" genom="" cirkulerande="" biomarkörer.="" vi="" slutförde="" också="" in="" vitro-studier="" med="" humana="" njure="" mikrovaskulära="" endotelceller.="" slutligen="" beräknade="" vi="" renal="" clearance="" av="" plasmabiomarkörer="" med="" hjälp="" av="" 20="" olika="" tidsinställda="">

Resultat:En genetisk variant, rs2920656C > T, näraANGPT2var associerad med minskad risk för AKI-SP2 (oddskvot, 0.45; 95 procent CI, 0.31–0.66; justerad FDR=0.003 ) och minskat plasmaangiopoietin-2 (p = 0.002). Kausal slutledningsanalys visade att för varje mindre allel (T) minskar risken att utveckla AKI-SP2 med 16 procent. Plasmaangiopoietin-2 medierade 41,5 procent av den rs2920656-relaterade risken för AKI-SP2. Mikrovaskulära endotelceller från mänskliga njurar som bär T-allelen av rs2920656 producerade numeriskt lägre nivåer av angiopoietin-2 även om detta inte var statistiskt signifikant (p = 0.07). Slutligen visade analyser att angiopoietin-2 är minimalt verkligen elimineras hos kritiskt sjuka försökspersoner.

Slutsats:Genetisk medlingsanalys ger stödjande bevis för att angiopoietin-2 spelar en orsaksroll i risken för AKI-SP2.

Nyckelord: Akut njurskadaGenetik, Endotel

För mer information vänligen kontakta:emily.li@wecistanche.com

Cistanche deserticola förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Bakgrund

Akutnjureskada(AKI) drabbar 40–60 procent av patienterna inlagda på intensivvårdsavdelningen (ICU) och bidrar till dåliga kort- och långtidsutfall. Genetiska studier har hittills fokuserat på samband mellan genetiska varianter och risken för att AKI jämför fall (AKI) med kontroller (ingen AKI). Detta ramverk kan dock vara begränsat på grund av fall avAkutnjureskadaär mycket heterogena med olika utfällningsmedel och biologiska profiler. Att kombinera sådana AKI-patienter för att maximera provstorleken kan resultera i utspädning av genetiska statistiska signaler som kanske bara finns i en patofysiologiskt distinkt undergrupp av AKI-populationen. En annan begränsning är att AKI i kritiskt sjuka populationer ofta är en komplikation av allvarliga förolämpningar, såsom sepsis, operation, chock, lunginflammation och trauma. Användningen av kontroller utan utveckling avAkutnjureskadakan vara problematisk. Kontroller som bär en högrisk genetisk variant kanske inte utvecklar AKI om de inte också upplever en liknande akut förolämpning som fall, och skulle därför klassificeras som icke-fall, vilket dämpar alla potentiella associationssignaler. Användningen av biologiskt distinkta AKI-subfenotyper i genetiska associationsstudier övervinner tidigare begränsningar i fenotypning av AKI genom att specifikt fokusera på AKI-populationen och genom att jämföra två biologiskt distinkta subfenotyper.

Vi har nyligen identifierat två AKI-subfenotyper (AKI-SP1 och AKI-SP2) genom att tillämpa latent klassanalysmetodologi på en panel av 29 kliniska och biomarkörvariabler i två oberoende kritiskt sjuka AKI-populationer. Noterbart var att AKI-SP2 associerades med sämre sjukhusresultat (t.ex. dödlighet, ny dialys och 7-dagars utebliven njure) jämfört med AKI-SP1. Vi identifierade sedan dessa AKI-subfenotyper i en tidigare avslutad multicenter randomiserad kontrollstudie, Vasopressin kontra Norepinephrin Infusion in Patients with Septic Shock (VASST). VASST-studien studerade om valet av vasopressorterapi förbättrade dödligheten hos personer med septisk chock. Medan AKI-populationen i den kliniska prövningen inte hade någon skillnad i mortalitet från vasopressorterapi, hade AKI-SP1 en mortalitetsfördel med vasopressin jämfört med AKI-SP2 utan någon mortalitetsskillnad. Såvitt vi vet är detta det första exemplet på att identifiera behandlingskänsliga AKI-undergrupper hos kritiskt sjuka.

Noterbart var ingen enskild variabel statistiskt bättre än de andra variablerna för att identifiera AKI-SP2 (tabell 1). Däremot en trevariabel modell som använder plasmaangiopoietin-2 (ANG-2), angiopoietin-1 (ANG-1) och löslig tumörnekrosfaktorreceptor{{8 }} (sTNFR-1), hade den optimala prediktiva prestandan att särskiljaAkutnjureskadasubfenotyper (C-statistik 0.93). Lägre ANG-2, lägre sTNFR-1 och högre ANG-1 var associerade med en lägre risk för AKI-SP2. Studier i djurmodeller av AKI har visat att dessa plasmabiomarkörer är involverade i

patofysiologi och svårighetsgrad av AKI. Det är dock okänt om dessa plasmabiomarkörer spelar en orsaksroll i utvecklingen av kliniskaAkutnjureskadasubfenotyper. Identifieringen av orsaksmarkörer skulle kunna informera mål för läkemedelsutveckling för att förebygga eller behandla utvecklingen avAkutnjureskadahos kritiskt sjuka och skulle kunna hjälpa till vid riskstratifiering av patienter.

Genetisk mediationsanalys är en av flera kausala slutledningsmetoder som kan identifiera den potentiella mekanismen genom vilken en oberoende variabel (t.ex. genetisk variant) påverkar resultatet (t.ex. AKI-subfenotyper) via en förklarande mediator (t.ex. biomarkör för endoteldysfunktion) . Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning i kliniska data för att förstå orsaksmekanismer för sjukdom. Vi antog att cis-kvantitativa egenskaper loci (QTLs) iANGPT1, ANGPT2 och TNFRSF1Agener påverkar utvecklingen av AKI-subfenotyper genom att reglera cirkulerande nivåer av deras respektive biomarkörer (ANG-1, ANG-2 eller sTNFR-1).

Metoder

Studiepopulationer

Vi har tidigare rapporterat identifieringen av AKI-subfenotyper med hjälp av en prospektivt insamlad ICU-kohort: identifiering av Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) som predisponerar för förändrad akut lungskaderisk (iSPAAR). iSPAAR-populationen är en genomomfattande fallkontrollstudie av risken för akut andnödsyndrom (ARDS) som inkluderade patienter med och utan ARDS. iSPAAR-populationen inkluderade försökspersoner från tidigare genomförda randomiserade kontrollstudier och från en prospektivt inskriven ICU-kohort. Detaljer om studiedesignen för varje population som är inskriven i iSPAAR har beskrivits tidigare; Albuterol for the Treatment of Acute Lung Injury (ALTA), Fluid and Catheter Treatment Trial (FACTT), enteral omega-3 fettsyra, gamma-linolensyra och antioxidanttillskott vid akut lungskada (OMEGA)

och Molecular Epidemiology of Acute Respiratory Distress (MEA) vid Massachusetts General Hospital. Inom iSPAAR skedde studieregistrering 48 timmar efter intensivvårdsinläggning. Vid studieregistreringen samlades DNA och plasma in för genotypning och biomarköranalys följt avAkutnjureskadakonstaterande. AKI definierades som en ökning av serumkreatinin (SCr) på större än eller lika med 0,3 mg/dl eller 50 procent från "baseline" SCr. Baslinjen SCr definierades som det lägsta värdet före studieregistreringen. AKI definierades också med hjälp av modifierade urinproduktionskriterier (daglig produktion istället för var 6:e ​​timme).

För att bestämma renal clearance av plasmabiomarkörer registrerade vi en prospektiv kohort i Harborviews medicinska och kirurgiska intensivvårdsavdelningar, Critical IllnessAkutnjureskadaKohort (CIA). Försökspersoner var kvalificerade för inskrivning om de uppfyllde 2 av 4 kriterier för systemiskt inflammatoriskt svarssyndrom hade en kliniskt misstänkt infektion och hade en kvarvarande urinkateter på plats. En tidsinställd urininsamling slutfördes som varade i minst 2–4 timmar och EDTA-plasmaprover samlades in i början och slutet av den tidsinställda urininsamlingen. Clearance beräknades med formeln Clearance(X) = U(X) * V/ P(X), varU(X) representerar urinkoncentrationen av löst ämneX, V indikerar urinvolymen under 2–4-h uppsamlingsperioden, ochP (X) representerar den genomsnittliga plasmakoncentrationen av löst ämneX från de första och slutliga blodinsamlingarna.

Genotypningsstrategi

Genotypning utfördes hos 421 patienter av europeisk härkomst med hjälp av Illumina 660-plattformen (Illumina, San Diego, CA). Genotypade data kvalitetskontrollerades med hjälp av ett samplingsfrekvensfilter > 0.97, minor allele frequency (MAF) > 0.01 och SNP-samtalsfrekvens > 0,95. Efter kvalitetskontroll, 238 SNPs ±50 kilobaser avANGPT1, ANGPT2,ochTNFRSF1Ahittades. Efter kopplingsojämvikt (LD) beskärning av en r²av {{0}}.8 togs 48 SNPs bort, vilket ledde till totalt 190 SNPs som användes i associationstester. Imputering utfördes med hjälp av referenspanelen 1000 Genomes Project med hjälp av IMPUTE2 v2.3.0.

Plasmaproteinbedömning

Plasma- och urinbiomarkörer mättes med hjälp av elektrokemiluminiscenta immunanalyser (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD), som tidigare beskrivits. Blodet samlades upp i EDTA-behandlade sterila rör, urinen samlades upp i sterila behållare och båda centrifugerades omedelbart. Plasma och urin alikvoterades sedan och frystes vid -80 grader. Proverna lagrades under olika varaktigheter men de tinades i en enda sats och endast en gång för att köra biomarkörmätningarna för denna studie. Alla biomarkörmätningar utfördes i duplikat vid Harborview Pulmonary Research Laboratories.

I Silico analyser

För att testa SNP för uttryck av QTL-effekter frågade vi portalen för Genotype-Tissue Expression (GTEx).

Cell kultur

Humana njure mikrovaskulära endotelceller (HKME Cs) renades från fostrets njurar efter frivilliga graviditetsavbrott mellan 100 och 135 dagar efter befruktningen. Informerat samtycke för användning av fostervävnad erhölls från patienter. Vi valde sedan slumpmässigt 9 olika donator-HKMECs, tinade och strök en halv miljon celler i T25-kolvar belagda med 0,2 procent gelatin och hölls i EBM-2 basalt medium innehållande 1 procent antibiotika-antimykotikum (Life Technologies), 10 procent FBS, 100 ug/mL ECGS, 50 ug/ml heparin och 20 ng/mL VEGF (FoU), under 48 timmar tills konfluens. Vid 48 timmar renade vi genomiskt DNA från HKMEC och cellsupernatanter samlades in. Vi genotypade framgångsrikt celler från 8 donatorer.

Statistisk analys

Patientdemografiska variabler rapporteras som antingen medelvärde plus /−standardavvikelse eller som median och kvartiler. Först använde vi logistisk regression för att testa ett samband mellan de 19 0 SNP:erna och utvecklingen av AKI-SP2 jämfört med AKI-SP1 med hjälp av en additiv genetisk modell (Golden Helix, MT). Vår modell användes för följande kovariater: ålder, kön, sepsis och de första fem huvudkomponenterna. Eigenstrat-metoden v4.2 användes för att beräkna huvudkomponenterna och de fem bästa inkluderades som kovariater. Oddskvoter (OR) rapporteras med 95 procents konfidensintervall. För analysen mellan genetiska varianter och AKI-subfenotyper korrigerade vi för flera jämförelser genom att använda ett Benjamini-Hochberg-tröskelvärde för falsk upptäckt (FDR) < 0,10,="" vilket="" uppskattar="" att="" mindre="" än="" 10="" procent="" av="" associationerna="" har="" ett="" fdr-värde="" på="" eller="" under="" denna="" nivå="" är="" falskt="" positiva="" [31].="" i="" en="" känslighetsanalys="" användes="" en="" imputerad="" genotyp="" för="" att="" identifiera="" ytterligare="" snp:="" er="" associerade="" med="">

För det andra använde vi linjär regression som justerade för ålder, kön och sepsis för att bestämma samband mellan topppresterande SNP och log₂transformerade biomarkörkoncentrationer. För det tredje slutförde vi en kausal slutledningsanalys för att testa sambandet mellan genetiska varianter och AKI-SP2 och den potentiella förmedlingen av associationen genom plasmabiomarkörkoncentrationer. Medlingsanalysen utfördes med hjälp av den icke-linjära implementeringen av strukturell ekvationsmodellering implementerad i medlingspaketet för STATA [32, 33]. Ytterligare detaljer om den kausala slutledningsanalysen finns i onlinetillägget. För det fjärde bestämde vi samband mellan genetiska varianter och AKI svårighetsgrad, mätt med maximalt serumkreatinin, via logistisk regression. Ytterligare information om material och metoder finns i onlinetillägget. I analysen utvärderade vi 190 SNP och använde en konservativp-värdeav 0.05/190 =2.6 × 10^{− 4}. Med tanke på att cirka 40 procent av ICU-patienterna utvecklar AKI och ett förväntat förhållande mellan kontroll (AKI-SP1) till fall (AKI-SP2) på 1,5, en förväntad provstorlek på 421 och en MAF på minst { {16}}.30, kommer vi att ha 81 procents makt att upptäcka en relativ risk på 1,5 eller högre [34]. Analyserna slutfördes med användning av STATA (version 15) och Goldenhelix (version 4.0). Alla studier godkändes av Human Subjects Division vid University of Washington. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla inskrivna ämnen.

Resultat

Karakteristika för populationer Av de 425 patienterna från valideringskohorten i vårt tidigare arbete hade 421 genotypningsdata tillgängliga. Demografi och kliniska baslinjeegenskaper beskrivs i tabell 1. Alla försökspersoner var av europeisk härkomst. Totalt 267 (63 procent) klassificerades som AKI-SP1 och 154 (37 procent) som AKI-SP2. Försökspersoner som utvecklade AKI-SP2 hade högre sjukdomsallvarlighet vid presentationen (genomsnittliga poäng för akut fysiologi och kronisk hälsoutvärdering (APACHE) III, 111 ± 26 mot 74 ± 24), var mer benägna att ha sepsis (84 procent mot 66 procent), och var mer benägna att behandlas med vasopressorer (79 procent mot 42 procent) jämfört med AKI-SP1.

Genetisk variation nära ANGPT2, rs2920656, är associerad med AKI-SP2

Av de 190 SNP:erna ±50 kilobaser av generna var 72 nära ANGPT1, 100 var nära ANGPT2 och 18 var nära TNFRSF1A-genen. Vi identifierade en SNP som möter en FDR < 0,05="" som="" var="" associerad="" med="" aki-sp2="" jämfört="" med="" aki-sp1="" (tabell="" 2="" och="" fig.="" 1).="" inga="" signifikanta="" samband="" observerades="" med="" snp="" i="" eller="" nära="" angpt1="" eller="" tnfrsf1a="" (tabell="" s2="" och="" s3).="" snp="" som="" visade="" det="" starkaste="" sambandet="" med="" risk="" för="" aki-sp2="" var="" rs2920656="" (or,="" 0,45;="" 95="" procent="" ci,="" 0,31–0,66;="" p="">< 1,4="" ×="" 10–5;="" fdr="0.003)." denna="" introniska="" snp="" är="" ≈="" 30="" kb="" nedströms="" till="" 3′-positionen="" för="" angp="" t2="" och="" förklarade="" ungefär="" 3="" procent="" av="" variansen="">

utvecklingen av AKI-SP2 (R2). Eftersom endast ett litet antal försökspersoner var homozygota rs2920656 (n=26), testade vi också samband mellan rs2920656 och AKI-SP2 i en dominant genetisk modell, vilket gav konsekvent resultat (ELLER, 0,42; 95 procent KI, 0,28–0,64; p < 1,4="" ×="" 10–6).="" vi="" testade="" också="" för="" ytterligare,="" potentiellt="" starkare="" associationer="" inom="" angpt2-lokuset="" med="" hjälp="" av="" imputerade="" genotyper="" men="" hittade="" inga="" associationer="" starkare="" än="" de="" som="" observerades="" med="" rs2920656="" (tabell="" s4).="" i="" en="" känslighetsanalys="" testade="" vi="" om="" inkludering="" av="" kritiskt="" sjuka="" patienter="">Akutnjureskadaskulle påverka den genetiska associationen. Vi grupperade patienter utan AKI och AKI-SP1 tillsammans och fastställde om rs2920656 fortfarande var starkt associerat med en minskad risk för AKI-SP2. I denna analys hade 839 patienter antingen ingen AKI eller AKI-SP1 och 154 hade AKI-SP2. Risken för att utveckla AKI-SP2 igen minskade signifikant med minst en T-allel för rs2920656 (ELLER 0.31; 95 procent CI, 0.19–0.52; p < 0,001)="" (tabell="" s5).="" i="" en="" annan="" känslighetsanalys="" testade="" vi="" om="" rs2920656="" var="" associerad="" med="" minskad="" risk="" för="" aki-sp2="" inom="" var="" och="" en="" av="" de="" fyra="" olika="" studierna="" som="" ingick="" i="" ispaar.="" inom="" var="" och="" en="" av="" de="" tre="" randomiserade="" kontrollstudierna="" (alta,="" factt="" och="" omega)="" och="" den="" prospektiva="" icu-kohorten="" (mea)="" överensstämde="" punktuppskattningen="" med="" den="" mindre="" allelen="" av="" rs2920656="" som="" visar="" en="" minskad="" risk="" för="" utveckling="" av="" aki-sp2="" (tabell="" s6)="" ).="" således="" analyserades="" rs2920656="" ytterligare="" för="" att="" bestämma="" sambandet="" med="">

T allel av rs2920656 är associerad med minskad plasma ANG-2

Vi analyserade sedan sambandet mellan rs2920656 och plasma ANG-2-koncentrationer. Justering för ålder, kön och sepsis var varje kopia av T-allelen av rs2920656 associerad med minskade log2 plasma ANG-2-koncentrationer (= − 0,09; 95 procent CI {{9} }.15, − 0.04; P=0.002). Försökspersoner som var homozygota för C-allelen visade de högsta koncentrationerna av plasma ANG-2 (40 683 pg/ml; interkvartilt område (IQR) 19,374-73,205), medan försökspersoner som var homozygota för T-allelen visade den lägsta plasma ANG-2-koncentrationer (28 308 pg/ml (IQR 14,340-42, 944). Dessutom, av de 100 SNP:er som testades nära ANGP T2-genregionen, var rs29206565 den starkaste associerade med plasma ANG -2 koncentrationer (Fig. 2).

Medlingsanalys tyder på att ANG-2 är orsakssamband i utvecklingen av AKI-SP2

Vi testade för bevis för att sambandet mellan rs2920656 och risken för AKI-SP2 förmedlas genom plasma ANG-2-koncentrationer (Fig. 3). Den totala effekten av rs2920656 på AKI-SP2 var totalt=− 0.16 per allel (95 procent CI -0.24, − 0 .10, p=1.0 × 10− 4 ), vilket tyder på att för varje mindre allel (T-allel) av den genetiska varianten minskar risken att utveckla AKI-SP2 med 16 procent . Kausal mediationsanalys upptäckte en signifikant indirekt effekt för rs2920656 på AKI-SP2 som medierades genom plasma ANG-2-koncentrationer (indirekt, - 0,07 per allel; 95 procent CI -0.11, - 0,03; p { {34}}.001), vilket innebär att andelen effekt mellan rs2920656 och AKI-SP2 som förmedlas av ANG-2-koncentrationer är 41,5 procent .

T allel av rs2920656 är associerad med minskad AKI svårighetsgrad efter 7 dagar

Därefter testade vi sambandet mellan rs2920656 och traditionella kriterier för AKI-svårighet, såsom maximalt serumkreatinin och ökning av serumkreatinin inom 7 dagar efter studieregistreringen. I en dominant genetisk modell var T-allelen för rs2920656 associerad med en minskning av serumkreatinin på − 0.44 mg/dL (95 procent CI, − 0.77 , − 0.10), p=0.01) efter justering för ålder, kön, body mass index och sepsisstatus. Den mindre allelen av rs2920656 var också associerad med en minskning av ökningen av serumkreatinin mellan baslinjen och dag 7 (= − 0,25, 95 procent CI, − 0,46, − 0,03; p=0,03)

T allel av rs2920656 är associerad med lägre ANG-2 i cellkultur

Vi genomförde in vitro-experiment och i silico-analyser för att bestämma den funktionella betydelsen av rs2920656. Av 8 olika mänskliga fosternjurevävnadprover, 2 var CC, 5 var CT och 1 var TT för rs2920656. I en dominant genetisk modell var ANG-2-koncentrationerna numeriskt störst i endotelceller från donatorer homozygota för C-allelen och lägre i bärare av T-allelen, p=0.07 (Fig. 4). I GTEx-projektdatabasen var rs2920656 inte associerad med ANGPT2-genuttryck. Två andra SNP:er (rs41311412 och rs2515591) som är i måttlig LD (r2=0.23 och D'=0.86) med rs2920656 var dock associerade med reducerat ANGPT2-genuttryck (p=4.1 × 10− 5 ) i tibiala artären, en vävnad som är mycket berikad för endotelceller (tabell S7).

Plasma ANG-2 rensas minimalt av njurarna För att avgöra om skillnader injurefungerakan påverka plasmakoncentrationerna av ANG{{0}} mätte vi ANG-2 renal clearance hos kritiskt sjuka patienter med och utan AKI. I 20 olika tidsinställda urinprovtagningar med bokade plasmaprover var medianvärdet för serumkreatinin 0,86 mg/dL med ett interkvartilområde (IQR) på 0,69 till 1,45 mg/dL. Mediankoncentrationen av ANG-2 i plasma var 10 261 pg/ml (IQR 6210–19 115 pg/ml). Däremot var urinkoncentrationerna av ANG-2 50-faldigt lägre med en median på 206 pg/ml (IQR 11–839 pg/mL). Det beräknade njurclearancen för ANG-2 var < 1="" ml/min="" för="" alla="" tidsinställda="" urinsamlingar,="" vilket="" tyder="" på="" att="" plasmakoncentrationerna="" av="" ang-2="" inte="" ökar="" bara="" som="" en="" funktion="" av="" försämring="" av="" aki="" (tabell="">