DEL 1 Beredning och utvärdering av mikroemulsionsbaserad transdermal tillförsel av Cistanche Tubulosa fenyletanoidglykosider

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3*, & et al.

Abstrakt.

Det primära syftet med denna studie var att utveckla en ny mikroemulsionsformulering (ME) för att levererafenyletanoidglykosid från cistanche(PG) för användning i hudblekare och solskyddsmedel. Oljefasen valdes på basis av läkemedlets löslighet, medan det ytaktiva medlet och det samtidiga ytaktiva medlet screenades och valdes på basis av deras solubiliseringsförmåga och effektiviteten med vilken de bildade ME. Pseudoternära fasdiagram konstruerades för att utvärdera ME-regioner och fem formuleringar av olja-i-vatten ME valdes ut som vehiklar. Hudpermeationsexperiment in vitro utfördes för att optimera ME-formuleringen och för att utvärdera dess permeabilitet i jämförelse med den för saltlösning. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos den optimerade ME och genomträngningsförmågan hos PG(fenyletanoidglykosid från cistanche) levererade av denna ME undersöktes också. Den optimerade ME-formuleringen bestod av isopropylmyristat (7 procent, vikt/vikt), Cremorphor EL (21 procent, vikt/vikt), propylenglykol (7 procent, vikt/vikt) och vatten (65 procent, vikt/vikt). Den ackumulerade mängden PG(fenyletanoidglykosid från cistanche) som trängde genom utskuren mushud när den bärs av ME var ~1,68 gånger den när PG bars av endast saltlösning. Den kumulativa mängden PG i mikroemulsionen (4149,650±37,3 µg·cm-2) var signifikant större än den för PG i saltlösningen (2288,63±20,9 µg· cm-2). Dessutom indikerade permeabilitetskoefficienten att optimerad mikroemulsion var en effektivare bärare för transdermal tillförsel av PG än kontrolllösningen (8,87±0,49 cm/hx10-3 mot 5,41±0,12 cm/hx10-3). Sammantaget ökade genomträngningsförmågan hos ME-buren PG signifikant jämfört med saltlösning.

cistanche

Introduktion

Herba cistanche,en stärkande ört som vanligen finns i ökenregioner, har använts ofta i traditionell kinesisk medicin. Hittills har flera studier utförts för att undersöka dess biofarmaceutiska egenskaper, inklusive förbättring av minne, sexuell styrka, eliminering av fria radikaler och anti-aging-aktivitet (1). Huvudkomponenten i H. cistanche ärfenyletanoidglykosid (PG). Tidigare studier har visat att PG hämmar aktiviteten av tyrosinas, det hastighetsbegränsande enzymet för syntesen av melanin i människokroppen (2). Dessutom har PG(fenyletanoidglykosid från cistanche) har rapporterats vara ansvarig för att avlägsna 2,2-difenyl-1-picrylhydrazylradikaler (3) och att skydda keratinocyter från ultraviolett (UV) strålning. Därför kan denna komponent ha potential för huddepigmentering. Aktuell medicinering har ofta använts inom kosmetiska områden, där läkemedlet levereras direkt på kroppsytan (4). Mikroemulsioner (ME) är ett nytt läkemedelstillförselsystem som konventionellt består av olja, ytaktivt ämne, samytaktivt medel och vattenhaltiga faser (5) och har rapporterats förbättra hastigheten och absorptionen av lipofila läkemedel (6). Dessutom, på grund av dess tillfredsställande löslighet, låga hudirritation och höga permeabilitet, förväntas det användas vid topikal läkemedelstillförsel (7,8). Så vitt vi vet har få studier utförts där PG levererades via topikal medicinering med mikroemulsion. I föreliggande studie etablerades ett olja-i-vatten (O/W) nanoemulsionstillförselsystem för transdermal administrering, och PG införlivades i nanoemulsionen (9,10). Under tiden utfördes beredning och karakterisering av PG-baserad nanoemulsion genom att undersöka den transdermala frisättningen in vitro.

Material och metoder Reagens.

Cremorphor EL och isopropylmyristat (IPM) köptes från Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Tyskland). Etanol, oljesyra (OA) och Tween-80 köptes från Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kina). Etyloleat köptes från Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Alla kemikalier och lösningsmedel som användes var av analytisk reagenskvalitet. Förberedelse och utvärdering av mikroemulsionsbaserad transdermal tillförsel av Cistanche tubulosa fenyletanoidglykosider JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, {MEI} WANG2 och } Farmaceutiska avdelningen, The First Affiliated Hospital; 2 Institutionen för naturmedicin, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Department of Pharmacy, Kanghua Hospital, Dongguan, Guangdong 523003, PR Kina Mottaget 2 december 2015; Godkänd 29 november 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Korrespondens till: Dr Junping Hu, Institutionen för naturmedicin, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830051, Kina E-post: huj @yeah.net * Bidrog lika mycket Nyckelord: fenyletanoidglykosid, mikroemulsion, transdermal tillförsel, skinlightener, solskyddsmedel yang et al: ME-BASERAD PG FÖR KOSMETISK ANVÄNDNING 1110 Beredning av PhGs. PhG(fenyletanoidglykosid från cistanche) bereddes som rutinmässigt beskrivits (11).

Den lufttorkadeC. tubulosadrevs och extraherades genom perkolering med 80 procent EtOH. Perkolatet indunstades under tryck, följt av filtrering av den kvarvarande vätskan. Filtratet koncentrerades och kromatograferades på en SP-825 makroporös hartskolonn med användning av 0, 30, 50, 70 och 90 procent EtOH i vatten som elueringsmedel. 30-50 procent EtOH-elueringsmedlen koncentrerades och torkades för att erhålla PhG-rik fraktion. UV-spektrofotometri indikerade innehållet i PhG(fenyletanoidglykosid från cistanche) var 87,6 procent. Screening av oljor, ytaktiva ämnen och cotensider för ME. Löslighetstester utfördes för att välja lämpliga komponenter för framställning av en ME-formulering med hög läkemedelsladdningskapacitet. I denna process tillsattes en överskottsmängd PG till 4 ml av vart och ett av följande reagens: IPM, flytande paraffin, OA, Cremophor EL, Tween-80, absolut etanol, propylenglykol, glycerin och PEG400 , respektive. Efter detta skakades den resulterande blandningen ömsesidigt vid 37°C under 72 timmar, följt av centrifugering vid 12 830 xg under 10 minuter. Därefter återsuspenderades pelleten i metanol och PG bestämdes med användning av UV-spektrofotometri vid 333 nm. Lämpliga utspädda lösningar av oljor, ytaktiva ämnen och hjälplösningsmedel i metanol tjänade som en blankkontroll. Konstruktion av fasdiagram. För att erhålla ett koncentrationsområde av komponenter för den befintliga mikroemulsionsgränsen, konstruerades pseudoternära fasdiagram med användning av en vattentitreringsmetod som tidigare beskrivits (12). Trefasdiagram framställdes med 1:3, 1:1 och 3:1 viktförhållanden av ytaktivt medel till samytaktivt medel. Oljefasen och den ytaktiva blandningen blandades sedan i viktförhållandena 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 och 9:1 . Blandningen av olja och ytaktivt medel blandades homogent och späddes droppvis med renat vatten under magnetisk omrörning (300 rpm) vid rumstemperatur tills transparent ME erhölls. Koncentrationen av komponenter registrerades för att fullborda det pseudoternära fasdiagrammet. Baserat på dessa diagram valdes lämpliga koncentrationer av material för framställning av PG-baserad ME. Framställning av ME och vattenlösningen av PG. Totalt 5 MEs (ME1-5) valdes ut enligt fasdiagrammen med ett viktförhållande av ytaktivt medel: Cotensid på 3:1 (tabell I). Mikroemulsionssystem framställdes genom att blanda olja med blandningen av ytaktivt medel och co-ytaktivt medel, och vatten tillsattes exakt till oljiga faser med magnetisk omrörning (300 r/min) vid 37˚C. Systemen ekvilibrerades med hjälp av försiktig magnetisk omrörning i 30 minuter följt av upplösning av lämplig mängd PG under ultraljudsbehandling. Den vattenhaltiga lösningen framställdes med samma PG-halt löst i renat vatten. Karakterisering av mikroemulsionen. Den genomsnittliga droppstorleken och polydispersitetsindexet för MEs utvärderades med fotonkorrelationsspektroskopi (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Storbritannien). Alla prover späddes med vatten i förhållandet 1:5 och filtrerades genom ett 0,22 µm filter. Testet utfördes i en termostatkammare vid 25˚C i tre exemplar. Morfologin för PG-mikroemulsioner observerades med användning av transmissionselektronmikroskopi (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tokyo, Japan). Kortfattat avsattes en droppe utspätt prov på ett filmbelagt koppargaller, följt av färgning med en droppe 2-procentig vattenlösning av fosfovolframsyra.

De genomsnittliga droppdiametrarna för mikroemulsionerna bestämdes med fotonkorrelationsspektroskopiinstrument (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) vid rumstemperatur. Viskositeten för ME-fordonen mättes vid 25˚C med hjälp av NDJ-8S digital viskosimeter (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Kina) med ett nr. 1 rotor inställd på 60 rpm. pH-bestämning. pH-värdena för MEs bestämdes vid 25˚C med hjälp av Phs-3C digital acidimeter (Shanghai REX Instruments Factory, Shanghai, Kina). Brytningsindexen mättes med en termostatisk Abbe-refraktometer (Optical Instrument Factory, Shanghai, Kina). Beredning av hudvävnader. Kunming hanmöss som vägde 20 g köptes från Experimental Animal Center vid Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). 10 möss (6 veckor gamla) utsattes för adaptiv matning under 1 vecka i en 12 timmars ljus/12 timmars mörk cykel, vid rumstemperatur (24±2˚C), med en luftfuktighet på 50±15 procent. Alla djur hade tillgång till en vanlig diet och vatten. Håret togs bort med en elektrisk klippare. Efter terminal anestesi med kloralhydrat (10 procent) via subkutan injektion, skars hudvävnader bort från bukregionen och det subkutana fettet och bindväven avlägsnades. Vävnaderna placerades i ett kylskåp vid 4°C över natten. Studieprotokollen godkändes av den etiska kommittén vid Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). In vitro permeationsstudie. Permeationsexperiment utfördes som tidigare beskrivits (12). Den utskurna huden klämdes fast mellan donatorn och receptorkammaren i en vertikal diffusionscell med en effektiv diffusionsarea på 2,8 cm2. Receptorkammaren fylldes med färsk, normal saltlösning. Diffusionscellen hölls vid 37˚C med användning av ett recirkulerande vattenbad och lösningen i receptorkamrarna omrördes kontinuerligt vid 200 rpm. Efter detta placerades testformuleringen (1,0 ml) försiktigt i donatorkammaren. Därefter avlägsnades 3 ml av lösningen i receptorkammaren och ersattes med en lika stor volym färsk normal saltlösning vid förutbestämda intervall (0, 2, 4, 6, 8, 10 och 24 timmar). Provet erhållet från receptorkammaren användes för att bestämma PG(fenyletanoidglykosid från cistanche)nivåer med hjälp av UV-spektroskopi vid en våglängd av 333 nm. Den kumulativa mängden PG som trängde genom den utskurna mushuden beräknades enligt följande formel:

Där Qn var den ackumulerade mängden vid en given tidpunkt t, Cn är läkemedelskoncentrationen i mottagarlösningen vid varje provtagningstidpunkt, Ci är läkemedelskoncentrationen i provet, S är den effektiva diffusionsarean (S{{0 }}.8 cm2), och V0 och Vi är volymerna av mottagarlösningen respektive provet. Den ackumulerade mängden (Qn) av PG(fenyletanoidglykosid från cistanche)permeated plottades som en funktion av tiden (t) för varje formulering. Permeationshastigheten för PG vid ett steady-state (Jss, µg/cm-2/h-1) genom mushuden beräknades från lutningen av den linjära delen av plotten av Qnversus-tid. Permeabilitetskoefficienten (Kp, cm/h) beräknades enligt följande formel:

Där Kp är permeabilitetskoefficienten, är Jss utflödet beräknat vid steady-state, och C0representerar läkemedelskoncentrationen som förblev konstant i vehikeln. Hudretentionsstudie. Följande avsnitt detaljerar jämförelsen av ex vivo-permeationsbeteendet, kumulativ mängd, permeationshastighet, permeabilitetskoefficienten och hudretentionsegenskaper mellan optimerade ME-formuleringar (PG-halt, 2 procent, vikt/vikt) och vattenlösningen. Vid slutet av permeationsexperimentet bestämdes resthalten av läkemedel i huden med användning av en homogeniseringsmetod. Efter tvättning med normal koksaltlösning skars huden i små sektioner och placerades i ett glasrör innehållande 3 ml metanol i ett isbad. Provet homogeniserades med en hastighet av 12000 r/min. rpm i 2 min och centrifugerades sedan vid 12 830 xg horisontellt i 30 min vid 25 ˚C. Supernatanten fick passera genom ett mikroporöst filter (0,45 um) och PG(fenyletanoidglykosid från cistanche)nivåerna i supernatanten bestämdes med UV-spektroskopi vid en våglängd av 333 nm. Stabilitetsstudie. Den fysiska stabiliteten av PG-laddat ME undersöktes via klarhet, partikelstorleksanalys och fasseparation, vilket observerades vid 2-8˚C och vid rumstemperatur under 3 månader. Centrifugering utfördes vid 12 830 xg under 30 minuter vid 25 ˚C för att bedöma den fysiska stabiliteten av ME. Fasseparation och koncentration av PG undersöktes varje månad för att bedöma den optimala lagringstemperaturen. Kemisk stabilitet utvärderades på läkemedelsladdade formuleringar, lagrade vid 2‑8˚C och vid rumstemperatur, med PG-halten bestämd med UV-spektrofotometri vid 333 nm. Hudkänslighetstest. Hudkänslighetstest utfördes på kaniner (som väger 2,02,5 kg) för att utvärdera den irriterande potentialen av topisk applicering av den utvecklade formuleringen som tidigare beskrivits (13). Nio holländska kaniner (16 veckor gamla; väger 2,0-2,5 kg; 5 hanar och 4 honor) erhölls från Experimental Animal Center vid Xinjiang Medical University. Djuren utsattes för adaptiv utfodring under 1 vecka i en 12 h ljus/12 h mörk cykel, vid rumstemperatur (24±2˚C), med en luftfuktighet på 50±15 procent. Alla djur hade tillgång till en vanlig diet och vatten. Luftemboli användes för offret. Protokollen som används i denna studie godkändes av den etiska kommittén vid Xinjiang Medical University (Xinjiang, Kina). Håren på ryggen togs bort ~24 timmar före administrering av ME-formuleringarna. Djuren delades in i följande grupper: En optimerad ME-grupp (n=3), med topisk administrering av optimerad ME innehållande 2 procent (vikt/vikt) PG; en PG-saltlösningsgrupp (n=3), med topisk administrering av saltlösning innehållande 2 procent (vikt/vikt) PG; och kontrollsaltlösningsgrupp (n=3), föremål för topisk administrering av normal saltlösning. Administreringen utfördes två gånger om dagen under 5 dagar. Djuren observerades för eventuella tecken på klåda eller förändringar i huden, inklusive erytem, ​​papler, flagnande och torrhet (14). Efter utsättning av läkemedlet fortsatte observationen för enstaka eller flera administreringar i 3 dagar. Irritationspoängen för testområdet utvärderades genom att bedöma omfattningen av erytem och ödem enligt följande kriterier: 1, ingen synlig reaktion; 2, en lätt reaktion; 3, en måttlig reaktion och 4, en svår reaktion (15,16). Slutligen beräknades de totala irritationspoängen för varje tillstånd med hjälp av följande ekvation:

Statistisk analys. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Dataanalys utfördes med användning av en envägsvariansanalys följt av det minst signifikanta skillnadstestet. Data analyserades med SPSS-programversion 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultat och diskussion

Screening av oljor, ytaktiva ämnen och hjälpytaktiva ämnen för ME. PG(fenyletanoidglykosid från cistanche)var nästan olöslig i flytande paraffin och oljesyra, men måttlig löslighet observerades i IPM (tabell II). IPM ökar diffusionskoefficienten i huden och resulterar i en ökning av permeationskoefficienten (17,18). Dessutom väljs IPM vanligtvis för framställning av ME på grund av dess välkända genomträngningsförbättrande egenskaper och biokompatibilitet. Val av ytaktiva ämnen är avgörande för en framgångsrik formulering av ME eftersom det bidrar till att minska gränsytspänningen genom att bilda en film vid gränsytan mellan olja och vatten (19). I föreliggande studie visade PG en högre löslighet i Cremophor-EL (40,193 mg/ml; Tabell II) jämfört med Tween-80 (28,051 mg/ml; Tabell II). Därför valdes CremophorEL ut för användning i ytterligare studier på grund av dess löslighetsprofil och dess låga toxicitetsnivå som en non-jonisk tensid. Dessutom visade dess vattenlösning god löslighet av PG. Den högsta lösligheten av PG bland samytaktiva ämnen observerades i propylenglykol (48,714 mg/ml; Tabell II). Dessutom har propylenglykol förmågan att bilda ME med IPM och CremophorEL. Sammantaget användes IPM, CremophorEL och propylenglykol som oljefas, ytaktivt medel respektive samytaktivt medel för formuleringen av PG-laddade MEs. Konstruktion av pseudoternära fasdiagram. I den föreliggande studien konstruerades fasdiagram för att välja koncentrationsintervallet för komponenterna för mikroemulsionerna, och de markerade områdena indikerar den tydliga O/WME-regionen (Fig. 1). Ett nära samband mellan hydreringseffekten av stratum corneum och den dermala permeationen har tidigare rapporterats (20), och den termodynamiska aktiviteten av läkemedel vid ME var en betydande drivkraft bakom frisättning och penetration av läkemedel i huden (20,21 ). Den termodynamiska aktiviteten hos läkemedel vid ME med lägre innehåll av tensidblandningar visades vara en viktig drivkraft för frisättning och penetration av läkemedlet i huden (22,23).

The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 var grumliga och instabila (fig. 2).

De slutliga sammansättningarna av ME1-5 listas i tabell I. ME-beredning och karakterisering. De fysiska egenskaperna hos ME1-5 listas i tabell III. De dispersa systemen var makroskopiskt identiska, homogena och transparenta, utan några utfällningar. Medeldroppstorlekarna för dessa ME varierade mellan 30.56 och 79.21 nm (Fig. 3; Tabell III), med polydispersitetsindexvärden mellan 0.187 och 0.321 (Tabell III). Detta indikerade en enhetlig ME med en snäv storleksfördelning. Dessutom ökade droppstorleken i proportion med oljehalten men minskade med innehållet av ytaktiva ämnen. Detta fenomen kan tillskrivas expansionen av ME-oljekärnan, och den höga koncentrationen av ytaktivt medel som kraftigt reducerar olje-vattengränsytans spänning för att minska droppstorleken. Vidare var ME-viskositeten förhöjd som ett resultat av ökad nivå av ytaktiva ämnen och minskat vatten. pH-värdena för alla ME föll inom det lämpliga intervallet 5.0-7.5 (tabell III) och var därför kompatibla med det för hudvävnaderna. När det gäller fysisk stabilitet observerades ingen fasseparation, brott eller läkemedelsutfällning i någon av de testade ME, vilket indikerar att ME:erna hade tillfredsställande termodynamisk stabilitet mot centrifugering. Färgämneslöslighetstestet avslöjade att ett vattenlösligt färgämne (metylorange) fördelade sig likformigt genom ME-systemet, vilket antydde att det bildade ME var av O/W-typ (data visas ej). Mikrofotografierna avslöjade separata enstaka ME5-droppar med en sfärisk kontur (Fig. 4). Exvivo hudpermeationsstudie. Permeationsprofilerna för alla testade vehiklar följde nollordningens frisättningskinetik (26,27) och ME5 gav det högsta transdermala flödet av PG (86.795±0.23 µg/cm{{28 }} /h-1; Fig. 5; Tabell III). I föreliggande studie bestämdes effekterna av oljeinnehåll och blandning av ytaktiva ämnen på hudgenomträngningen av PG. Resultaten indikerade att ytaktiva ämnen förbättrar hudpermeation genom att öka membranfluiditeten, läkemedelssolubilisering och extraktion av lipid från stratum corneum. Genomträngningshastigheten för ME5 (86.795±0.23µg/cm-2 /h-1) ökade signifikant jämfört med genomträngningshastigheten för ME1 (69.57±{ {48}}.78, P=0.0094), ME2 (44.326±0.84, P{{50}} .0052), ME3 (79.859±0.12, P=0.039) och ME4 (58.332±0.39 µg/cm-2/h-1 , P=0.0063, Fig. 5; Tabell III) Detta överensstämde med resultaten från en tidigare studie, där den termodynamiska aktiviteten hos ME-läkemedelslasten kan minska med ökningen av nivåerna av ytaktiva ämnen (12,28 ). Viskositeten för ME5 (30,43±0,12 mPa.s) var lägre jämfört med den andra ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0.0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60.49±1.34 mPa.s, P=0.0094) och ME4 (43.27±0.21 mPa.s, P=0.0059).