Del 1 RNA-Seq DEL 1 Baserad De Novo Transcriptome Assembly och genupptäckt av Cistanche Deserticola köttig stam

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakt

Bakgrunder

Cistanche deserticolaär en helt icke-fotosyntetisk parasitisk växt med stort medicinskt värde och är huvudsakligen utbredd i öknen i nordvästra Kina. Dess torkade köttiga stjälk är en avgörande tonic inom traditionell kinesisk medicin med rollen att främst förbättra manlig sexuell funktion och stärka immuniteten, men få mekanistiska studier har genomförts delvis på grund av bristen på genomiska och transkriptomiska resurser.

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Resultat

I denna studie utförde vi djup transkriptomsekvensering i den köttiga stammen avC. deserticola, och cirka 80 miljoner läsningar genererades med hjälp av Illumina-parändsekvenser på HiSeq2000-plattformen. Med hjälp av trinity assembler erhöll vi 95 787 transkriptionssekvenser med transkriptlängder från 200 bp till 15 698 bp, med en genomsnittlig längd på 950 baser och N50-längden på 1 519 baser. 63 957 transkript identifierades aktivt uttryckta med FPKM Mindre än eller lika med 0,5, där 30 098 transkript kommenterades med genbeskrivningar eller genontologitermer genom sekvenslikhetsanalyser mot flera offentliga databaser (Uniprot, NR och Nt vid NCBI och KEGG). Dessutom identifierade vi nyckelenzymgener involverade i biosyntesen av lignin och fenyletanoidglykosider (PhGs) som är kända för att vara de primära aktiva ingredienserna. Fyra gener för fenylalanin ammoniak-lyas (PAL), det första nyckelenzymet i lignin- och PhG-biosyntes, identifierades baserat på sekvensjämförelse och fylogenetisk analys. Två biosyntesvägar för PhG föreslogs också för första gången.

Slutsatser

Sammantaget genomförde vi en global analys avC. deserticolaköttigt stamtranskriptom med RNA-seq-teknologi. En samling enzymgener relaterade till biosyntesen av lignin och fenyletanoidglykosider identifierades från de sammansatta och kommenterade transkripten, och genfamiljen av PAL förutspåddes också. Sekvensdata från denna studie kommer att ge en värdefull resurs för att bedriva framtida forskning om biosyntes av fenyletanoidglykosider och funktionella genomiska studier i denna viktiga medicinalväxt.

Introduktion

C. deserticolaär ett världsomspännande släkte av fleråriga ökenväxter från familjen Orobanchaceae, och är en helt icke-fotosyntetisk art och odlar vanligtvis underjordiska holoparasitiska växter [1]. Den parasiteras på rötterna av psammofyten Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) [1, 2], som huvudsakligen lever i öknar och halvöknar på grund av sin höga tolerans mot torka och salthalt [1, 3].C. deserticolavisar stark motståndskraft mot tuffa miljöförhållanden och är huvudsakligen distribuerad i nordvästra Kina [4–6], särskilt i Inre Mongoliet, Gansu och Xinjiang. Den anses vara en hotad vild art de senaste åren på grund av ökad konsumtion av människor [5, 6]. C. deserticola som ofta kallas ökenginseng är allmänt känd som ökenkvast och den torkade köttiga stjälken har använts flitigt som en traditionellt viktig tonic i Kina och Japan under många år [4, 7–10]. Det spelades ursprungligen in i Shen Nong Ben Cao Jing (Dictionary of Chinese Materia Medica, 1977) [11] för ungefär 1800 år sedan och ansågs vara en av huvudkällorna till den kinesiska medicinörten Cistanche.

Utdragen avC. deserticolabesitter ett brett utbud av medicinska funktioner, särskilt för användning för att förbättra sexuell funktion, tonifiera njurarna, skydda levern, öppningsaktivitet, förbättra minnet, immunmodulerande, antioxidativ aktivitet, antiinflammatorisk, antiviral aktivitet, etc [7–10, 12– 15]. De huvudsakliga bioaktiva komponenterna i C. deserticola är fenyletanoidglykosider (PheGs, PhGs) [2, 9, 10, 14, 15]. Hittills har mer än 20 fenyletanoidglykosider isolerats från den saftiga stammen avC.deserticola[9, 14, 16]. Bland dem är akteosid och echinakosid två huvudkomponenter med betydande farmakologiska aktiviteter [2, 16], och dokumenterade som kvalitetsstandarder förC. deserticolai den kinesiska farmakopén (2005 och 2010 års upplagor). Tre kemiska komponenter i PhG är organisk syra, sackarid och fenyletanoid, men detaljerna om fenyletanoid biosyntesvägar är fortfarande dåligt förstådda iC.deserticola.

Trots den kommersiella och medicinska betydelsen avC.deserticola, är de genomiska och transkriptomiska data för denna art mycket begränsade. Det finns inga EST:er tillgängliga i NCBI-databasen och den fullständiga genominformationen för denna art förblir otillgänglig förutom kloroplastgenomsekvensen [1]. De begränsade transkriptomiska data hindrar studiet av PhG biosyntetiska mekanismer. RNA-seq-teknologi kan generera sekvenser av de uttryckta delarna av det målinriktade genomet [17] och identifiera gener [18] med hjälp av NGS-teknologiplattformar (som Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq och Roche 454). Det blir allt mer populärt inom transcriptome de novo-montering [19–22], eftersom det är ett kostnadseffektivt och kraftfullt tillvägagångssätt med hög upplösning och brett dynamiskt omfång [23–25], särskilt eftersom det har fördelen att utforska transkript med låg förekomst. [26]. På grund av de olika fördelarna är RNA-seq speciellt attraktivt för icke-modellorganismer med begränsade genetiska resurser [27-29]. Men det finns ingen detaljerad forskning av C. deserticola-transkriptom av RNA-seq.

I denna studie sekvenserade vi globalt stamtranskriptomet för C. deserticola med hjälp av Illumina Hiseq2000-plattformen och fick 7,9 G rådata. Genom montering och anteckning bröt vi generna som är involverade i biosyntesen av PhG och generna som är ansvariga för hela ligninbiosyntesen.

Vår RNA-seq-analys genererade den förstaC. deserticolakonsensus transkriptom och gav nya insikter i en omfattande förståelse av det medicinska värdet avC. deserticola.Dessutom kan metoden som beskrivs här i stor utsträckning tillämpas på profiltranskriptomer för att underlätta upptäckten av gener involverade i biosyntesvägar för specifika medicinska komponenter i en annan medicinalväxt med mycket begränsade genomiska resurser.

Cistanchehar många funktioner

Material och metoder

Insamling av växtmaterial

Den färska saftiga stjälken förC. deserticolai utgrävningsstadiet samlades in från en växtbas i BayanHot City of Alexa League i Inre Mongoliet i nordvästra Kina. Insamlingstillståndet erhölls från ägaren (HongKui CongRong Group) av anläggningsbasen. Verifikationsprovet deponerades i Core Genomic Facility vid Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences. Efter rengöring skars de saftiga stamvävnaderna i små bitar och frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades sedan i -80 grad tills vidare bearbetning.

RNA-extraktion, cDNA-bibliotekskonstruktion och Illumina-sekvensering

Totalt RNA extraherades från den suckulenta stammen med användning av TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., Kalifornien, USA) enligt tillverkarens instruktioner. De resulterande proverna behandlades med DNas I för att avlägsna eventuellt genomiskt DNA. Extraherade RNA kvantifierades med en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies) och kontrollerades för integritet med hjälp av denaturerande agarosgelelektrofores med etidiumbromidfärgning. RNA-prover med A260/A280-förhållanden mellan 1,9 och 2,1, RNA 28S:18S-förhållanden högre än 1,0 och RNA-integritetstal (RIN) mindre än eller lika med 8,5 användes i efterföljande analyser.

RNA-seq-biblioteken genererades med användning av Illumina Truseq RNA Sample Preparation Kit. Poly(A) plus RNA isolerades från totalt RNA med användning av Dynal oligo(dT)25-kulor enligt tillverkarens instruktioner. Efter rening tillsattes fragmenteringsbuffert för att bryta mRNA till korta fragment. Första-strängs cDNA syntetiserades med användning av dessa korta fragment som mallar, tillsammans med SuperScript III omvänt transkriptas och N6 slumpmässig hexamer-primer. Andra-strängs cDNA syntetiserades sedan med användning av buffert, dNTPs, RNaseH och DNA-polymeras I. Det resulterande dubbelsträngade cDNA:t utsattes för ändreparation med användning av T4 DNA-polymeras, DNA-polymeras I Klenow-fragment och T4-polynukleotidkinas och ligerades till adaptrar som använder T4 DNA-ligas. Adaptorligerade fragment renades med användning av ett Quick PCR-extraktionskit och eluerades med EB-buffert. Efter analys med användning av agarosgelelektrofores valdes lämpliga fragment ut som mallar för PCR-amplifiering. Sekvensering av det resulterande cDNA-biblioteket utfördes med ett Illumina HiSeq 2000-system.

Transcripts de novo montering och kvantifiering av genuttryck

Råavläsningar genererade från sekvensering renades genom att ta bort adaptersekvenserna (ATCTCGTATGCCGTC) med den interna metoden. Vi genomförde sedan en sträng filtreringsprocess av låg kvalitet. För det första skulle baser med Phred-kvalitetspoäng lägre än 20 trimmas från 3'-änden av sekvensen, tills de kommer in i en bas med högre kvalitet (mindre än eller lika med 20). Om längden på avläsningen var kortare än 50 bp skulle den kasseras. För det andra kommer läsningar att filtreras ytterligare av kriteriet att 70 procent baser i en läsning har högkvalitativa poäng (mindre än eller lika med 20). För det tredje användes endast parade ändar för ytterligare montering. De novo-transkriptsammansättningen utfördes med Trinity-versionen_20130216 [30] som bestod av tre på varandra följande programvarumoduler: Inchworm, Chrysalis och Butterfly. Monteringsparametrarna ställdes in enligt nedan:—seqType fq—JM 300G —min_contig_längd 200—CPU 20—inchworm_cpu 20—bflyCPU 20.

För att kvantifiera överflöd av transkript, justerades de sekvenserade parändläsningarna om till de sammansatta transkripten med hjälp av ett skript i Trinity [31]. Kartlagda läsningar användes för kvantifiering av RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) programvara [32]. Gen- eller isoformmängd representerades av fragmentet per kilobas av transkript per miljon fragment kartlagt (FPKM) värde, de transkript med FPKM-värde lika med eller större än 0.05 definierades som uttryckta.

Funktionell annotering av uttryckta avskrifter

För det finns inga genanteckningsuppsättningar av C. deserticola förutom kloroplastgenomet [1]. Vi kommenterade de uttryckta avskrifterna genom att jämföra med Genbank Nt, Genbank Nr och TAIR10_ pep_20101214_uppdaterade datauppsättningar separat med hjälp av BLAST-programmet (E< =="" 1e-20).="" meanwhile,="" all="" expressed="" transcripts="" were="" translated="" into="" potential="" proteins="" according="" to="" orf="" prediction="" by="" transdecoder="" [30]="" and="" predicated="" for="" the="" conserved="" domains="" based="" on="" the="" pfam="" database="">

aktiv ingrediens akteosid icistanche

Gene Ontology och KEGG pathway annotation

Genom sekvenslikhetsanpassning till Uniprot-databasen (http://www.uniprot.org/), erhölls Gene Ontology (GO)-annoteringen av alla sammansatta transkript med hjälp av en associationsfil som laddats ner från (ftp://ftp.ebi.ac. uk/pub/databases/GO/goa/UNIPROT/gene_association. goa_uniprot.gz). GO-termer klustring av uttryckta gener utfördes med hjälp av anpassade skript, och vi kommenterade gener på fjärde nivån för CC-, BP- och MF-kategorierna separat.

KEGG-väginformation tilldelades för alla förutsagda proteinsekvenser med hjälp av onlineverktyget KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Sekvenser i Fasta-format skickades till KAAS-begäran, och de resulterande filerna med all information om vägar relaterad till C. deseticola stamtranskriptom laddades ner. 13 växtorganismers gendatauppsättningar i KEGG användes för annotering med BBH-metoden (bi-directional best hit).

RT-qPCR-analys

Efter digestion med DNas I omvandlades cirka 5 ug totalt RNA till första-strängs cDNA via omvänd transkriptionsreaktion med oligo(dT)15-primrar och NoScript Reverse Transcription System (Promega). cDNA-produkterna späddes sedan 10- gånger med nukleasfritt avjoniserat vatten före användning som mall i realtids-PCR. Specifika cDNA:n amplifierades av GoTaq 2-Step RT-qPCR System (Promega) i en volym av 20 ul. PCR-amplifiering utfördes vid anlöpningstemperaturen på 60 grader med 7500 Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems) enligt tillverkarens instruktioner. Relativa transkriptförekomster beräknades med den jämförande cykeltröskelmetoden med genen "comp10579_c0" som intern standard, med hjälp av programvaran 7500 Manager.

Primerpar för RT-PCR designades baserat på onlineprogramvara (http://primer3.ut.ee/) och listas i S1 Dataset.

Resultat

RNA-sekvensering och de novo transkriptomsammansättning av C. deserticola köttig stam

Stjälken av C. deserticola har använts flitigt som en traditionellt viktig tonic i Kina och Japan under många år. För att få en global översikt över genuttryck i den köttiga stammen C. deserticola samlade vi in ​​C. deserticola stamprover av samma växtbas 2013 respektive 2014. Totalt RNA extraherades och polyA plus RNA renades för att konstruera RNA-sekvensbibliotek med parade ändar. 79 433 734 och 86 019 176 pair-end-läsningar motsvarande nästan 8 miljarder och 8,6 miljarder baser av sekvensen erhölls med Illumina HiSeq 2000-sekvensering

plattform i 2013-år och 2014-årsprov (tabell 1). Efter att ha tagit bort adaptersekvenser och filtrerat läsningar av låg kvalitet (se detaljer i Metoder), användes 64 831 040 högkvalitativa parändläsningar i 2013-årsprovet för de novo-transkriptomsammansättning. Med hjälp av Trinity sequence assembler [30], genererades 51 719 gener och 95 787 transkriptsekvenser med transkriptlängder från 200 bp till 15 698 bp. Den genomsnittliga längden på sammansatta avskrifter är 950 baser och N50-längden är 1 519 baser. Antalet transkript i olika längder visade att 57,32 procent av det sammansatta transkriptet var ungefär 500-bp eller längre (Fig 1A). Högkvalitativa pair-end-läsningar i 2014-årsprovet mappades till det sammansatta transkriptomet. Dessutom fann vi att transkriptnumret för varje sammansatt gen varierade och 69 procent av generna med en uttryckt isoform medan 31 procent av generna uttryckte två eller flera transkript (Fig 1B).

Uttryckskvantifiering och funktionell annotering av sammansatta transkript

Gen- eller transkriptöverflöd kvantifierades med användning av RSEM-paketet, där de sekvenserade läsningarna justerades om till de sammansatta generna eller transkriptionssekvenserna med hjälp av Bowtie och de kartlade läsningarna användes för kvantifiering. FPKM-värdet för varje gen eller transkript beräknades, och slutligen identifierade vi 63 957 och 52 857 aktivt uttryckta transkript (FPKM-värde mindre än eller lika med 0.5) i köttiga stamprover från C. deserticola i 2{{17} }13 respektive 2014. 44 776 transkriptioner (70,01 procent i 2013-årsprovet, 84,71 procent i 2014-årsprovet) uttrycktes vanligen i de två replikaten, och korrelationen (Pearson-korrelationskoefficient: 0,91979) av deras uttrycksdata var visas i S1 Fig. Sekvenseringsrådata hade laddats upp till NCBI SRA-databasen (accessionsnummer: SRX857402 och SRX858938). Vi använde uttryckta gener som identifierats i 2013-årsprovet för ytterligare analys. Funktionell anteckningsinformation för alla uttryckta transkript erhölls med två metoder. För det första justerades alla uttryckta transkript till kända nukleotid- (GenBank inte) och peptidsekvensdatabaser (GenBank nr och Arabidopsis-peptid) separat med BLAST-algoritmen. Av 63 957 uttryckta avskrifter,

29 220 (45,7 procent ) kommenterades och visade homologi med sekvenser i någon av de tre ämnesdatabaserna med E-värde cutoff 1e-20. Samtidigt förutspåddes kandidatkodningsregionerna för alla uttryckta transkriptsekvenser med hjälp av TransDecoder-mjukvara och de längsta ORF:erna för varje transkript användes för Pfam-domänsökning. Som ett resultat kommenterades 21 358 (33,4 procent ) avskrifter baserat på Pfam-databasen. Totalt sett matchades 30 098 (47,1 procent) transkript signifikant till kända gener i de offentliga databaserna genom att kombinera de två metoderna ovan. Den kompletta listan med uttryckta transkript med funktionsanteckning visades i kompletterande data (S2 Dataset).

Vi undersökte de 20 mest uttryckta transkripten (tabell 2) motsvarande 18,99 procent av alla sekvensläsningar, och fann att de flesta av dem är gener som svarar på abiotika

stress stimuli. Dehydrin (DHNs), en klass av hydrofila och värmestabila stressproteiner med ett stort antal laddade aminosyror som tillhör familjen Group II Late Embryogenesis Abundant (LEA), är den mest uttryckta genen. Tre olika Dehyrin-transkript (comp28713_c0_seq1/2/4) upptäcktes starkt uttryckta i den köttiga stammen som kan vara inblandade i att skydda celler från skador orsakade av torkstress. Andra stressrelaterade gener som värmechockprotein, patogenrelaterat protein och metallothionein visade sig också vara mycket uttryckta, vilket kan vara relaterat till dess svåra överlevnadsmiljö. Dessutom, vissa konstitutiva gener inklusive 26S ribosomal RNA-gen (komp22329_c2_seq1), auxin-undertryckt/dvaleassocierat protein (comp20999_c0_seq1), ADP-ribosyleringsfaktor (komp20499_ c0_seq1) transkriberades också mycket.

Funktionell klassificering av alla uttryckta transkript baserat på Gene Ontology och KEGG-databaser

Gene Ontology (GO)-anteckning erhölls från Uniprot-antecknings- och identitetsassocieringsfilen. Totalt tilldelades 20 907 transkript, som står för 32,69 procent av de totala uttryckta sekvenserna, till 1 745 funktionella termer. Av de totala funktionella GO-termerna utgjorde tilldelningar till den biologiska processen majoriteten (1 116, 63,95 procent) följt av cellkomponent (329, 18,85 procent) och molekylär funktion (300, 17,20 procent). De tilldelade funktionerna för uttryckta transkript täckte ett brett spektrum av GO-kategorier, och de 10 bästa GO-termerna med de mest kommenterade transkripten listades i tabell 3. Och vi tillhandahåller all uttryckt transkriptdistribution i tre genontologikategorier (Molecular Function, Cellular Component, och biologisk process) i den kompletterande filen (S3 Dataset). GO-termer relaterade till bindningsfunktioner och transferasaktivitet var övervägande representerade i kategorin molekylär funktion. Om bindningsfunktionerna representerade katjonbindning (4 394 transkript) den vanligaste, följt av nukleotid/nukleosidbindning (3 404 transkript i genomsnitt) och proteinbindning (2 422 transkript). Medan i transferasaktivitetsgruppen är de mest de med överförande fosforinnehållande grupper (2 256 transkript, 65,77 procent). Bland den cellulära komponentkategorin var transkripten mer lokaliserade till intracellulärt (10 581 transkript i genomsnitt), medan bland den biologiska processkategorin var transkripten mer involverade i biopolymerens metaboliska process (6 683 transkript i genomsnitt), följt av reglering av cellulär process (4 841) transkript), genuttryck (4 678 transkript) och transport (3 512 transkript).

För att bryta gener involverade i biosyntesen av lignin och PhG, söktes 21 358 icke-redundanta potentiella proteinsekvenser mot gensekvenser från 13 växtorganismer i KEGG-databasen, och de tilldelades 275 KEGG-vägar med minst 5 träffar. De 10 bästa vägarna med de mest inriktade sekvenserna listades i tabell 4. De flesta vägarna var involverade i primära metaboliska processer, såsom aminosyra- eller proteinmetabolism (ko01230, ko04141 och ko04120), kolhydratmetabolism (ko01200 och ko00500) och nukleotid eller nukleosidmetabolism (ko03018, ko00230 och ko00240). Dessutom finns det 27 sekundära metabolism-relaterade vägar (Fig 2), såsom terpenoid ryggrad biosyntes, fenylpropanoid biosyntes, karotenoid biosyntes, isokinolin alkaloid biosyntes och tropan, piperidin och pyridin alkaloid biosyntes. Dessa resultat ger ytterligare indikationer på att aktiva metaboliska processer pågick i stamvävnaden C. deserticola. Alla uttryckta transkript associerade med KEGG-vägar listades i den kompletterande filen (S4 Dataset). Även om det finns några väsentligt förändrade vägar mellan C. deserticola och andra växter, såsom ris [35] (S5 Dataset), syftar vårt huvudmål i den här studien till att avslöja hela transkriptomprofilen för C. deserticola-stammen, och att avbilda relaterade vägar för PhGs biosyntes som kan vara användbara för att styra odlingen.

Kandidatgener som kodar för enzymer involverade i biosyntesen av lignin

Lignin är den näst vanligaste naturliga terrestra polymeren i växtriket, och utgör upp till en tredjedel av det material som finns i växternas cellväggar [36, 37]. Som en viktig komponent i cellväggarna hjälper ligniner vattentransport, ger mekaniskt stöd och strukturell integritet och försvarar sig mot patogener och växtätare [38–40]. Dessa roller av lignin är mycket värdefulla för att stödja underjordisk erektiv tillväxt avC. deserticolai öknen. I denna studie presenterade vi den kompletta bilden av ligninbiosyntesvägar iC. deserticola(Fig 3), där ligninmonomererna biosyntetiseras från fenylalanin genom en serie enzymatiska reaktioner, inklusive hydroxylering, metylering, reduktion och oxidativ polymerisationsprocess. Ligninbiosyntesrelaterade enzymer detekterades för tre huvudsakligen syntetiserade former i vaskulära

vävnad (p-hydroxyl-fenyl (H), guaiacyl (G) och syringyl (S) lignin) och 5-hydroxyl-guaiacyl lignin som endast identifierades i COMT (koffeinsyra 3-O-metyltransferas, EC 2.1.1.68) bristfälliga (såsom knock-down) växter [41, 42].

Fenylalanin ammoniak-lyas (PAL, EC 4.3.1.24) är det första nyckelenzymet i ligninbiosyntesvägen (Fig 3) som omvandlar fenylalanin till kanelsyra genom icke-oxidativ deaminering [43, 44]. Totalt 6 297 PAL-läsningar sekvenserades och 7 PAL-transkript sammanställdes iC. deserticola(Tabell 5). Genom jämförelse av sekvenslikheter fann vi att 4 av dem (comp28550_c1_seq1/2/3/5) hade mer än 95 procent likhet med den kända mRNA-sekvensen av C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), medan comp28550_c1_seq4 och comp25940_c0_seq1 hade 77 procent respektive 82 procent likheter. ORF-förutsägelse avslöjade att 5 transkript hade potential för kodande proteiner och bars med aromatisk aminosyralyasdomän (PF00221.14). Bland dem kunde endast comp28550_c1_seq4-transkriptet koda för en komplett proteinsekvens med 718 aminosyrarester. Det har rapporterats att PAL kodades av en liten multigenfamilj i de flesta växtarter, såsom 4 i Arabidopsis thaliana [39, 45], 5 i Populus trichocarpa [46, 47], 3 i Scutellaria baicalensis [48] och 7 Cucumis sativus [43, 49], etc. Vår fylogenetiska analys antydde att det fanns 4 PAL-kodande gener i C.deserticola och vi döpte dem till CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 respektive CdPAL4 (S2 Fig.). 4-kumarat-CoA-ligas (4CL, EC 6.2.1.12) och trans-cinnamat 4-monooxygenas (CYP73A, EC 1.14.13.11) är två enzymer som är ansvariga för att transformera kanelsyra till p-kumaroyl-CoA i två omvända ordningsföljder. De finns också i ryggraden, och deras uttrycks-FPKM-värden är 39,57 respektive 51,93.

De fyra typerna ligninerna biosyntetiserades genom olika vägar som kontrollerades av tre nyckelenzymer, cinnamoyl-CoA-reduktas (CCR, EC 1.2.1.44), shikimat o-hydroxikanel-metyltransferas (HCT, EC 2.3.1.133) och ferulat{{11 }}hydroxylas (F5H, EC 1.14.-.-). CCR rapporterades som en kontrollpunkt för ligninvägen [50, 51] som katalyserade X-CoA (X inklusive p-kumaroyl, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl och sinapoyl) till Y-aldehyd (Y inklusive p-cumar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl och sinap), medan HCT katalyserade p-cumar-oyl-CoA till p-cumaroyl shikiminsyra/p-cumaroyl kininsyra. De två enzymerna, precis som en switch, reglerade biosyntesen av P-hydroxyl-fenylligniner eller de andra tre typerna av ligniner.

F5H var en annan grenomkopplare som reglerade syringyllignin och 5-hydroxyl-guaiacyllignin. Andra viktiga enzymer inkluderar koffeinsyra 3-O-metyltransferas (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-metyltransferas (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) och cinnamyl-alkoholdehydrogenas ( CAD, EC 1.1.1.195) detekterades också uttryckta. Detaljerad uttrycksinformation listades i tabell 6. Dessa enzymgener identifierade i denna studie kommer att tillhandahålla en värdefull resurs för funktionella genomiska studier i denna viktiga medicinalväxt. 10 gener relaterade till ligninbiosyntesvägen i Tabell 6 valdes ut för RT-qPCR-verifiering för att bekräfta våra RNA-seq-resultat (Fig 4), och deras höga korrelationer (Pearson-korrelationskoefficient: 0,90343) indikerade hög noggrannhet och reproducerbarhet av vår transkriptomanalys . S1 Dataset listar primersekvenserna som används i denna analys.

Cistanchehar många effekter

Kandidatgener som kodar för enzymer involverade i biosyntesen av PhG

Fenyletanoidglykosider (PhG) är kända för att vara de primära aktiva ingredienserna iC. deserticolamed aktiviteter för att förbättra sexuell styrka, eliminera fria radikaler och anti-aging [7–10]. Tre kemiska komponenter i PhG är organisk syra, sackarid och fenyletanolaglykon (Fig 3). Den organiska syran inklusive koffeinsyra, ferulsyra och kumarsyra är produkter från fenylpropanoidbiosyntesvägen. Komponenterna i sackarider inklusive glukos och ramnos är produkter av kolhydratmetabolismvägar, såsom stärkelse- och sackarosmetabolism, aminosocker- och nukleotidsockermetabolism, fruktos- och mannosmetabolism, etc. Biosyntesvägen för fenyletanoldelen är dock inte klar ännu. Här föreslog vi två möjliga biosyntesvägar för fenyletanol baserat på våra sekvensdata. Den ena är den rapporterade koffeinsyra- eller ferulsyravägen, även känd som kanelsyravägen som liknar ligninbiosyntesens ryggradsväg. En annan är baserad på fenylalaninmetabolismvägen (Fig 3), där fenylalanin till fenyletanol uppnåddes genom en känd "Enrlich-väg" som först hittades i jäst för ett sekel sedan och validerades i petuniablommor [52, 53], tomat [ 54], och steg [55, 56]. Fyra enzymgener kodar för aspartat/tyrosinaminotransferas, histidinolfosfataminotransferas och primär-aminoxidas som är ansvariga för omvandlingen av fenylalanin till fenyletanol detekterades uttryckta i stammen av C. deserticola. Produkten av fenyletanol kan oxideras ytterligare av monooxygenas eller metyleras av metyltransferas till dess derivat (fenyletanolaglykon) som deltog i PhG-biosyntesen. Sammanfattningsvis föreslogs två förmodade biosyntesvägar av fenyletanolaglykon för C. deserticola men behöver fortfarande studeras vidare.