Del 2|Acteosid undertrycker RANKL-medierad osteoklastogenes genom att hämma C-Fos-induktion och NF-kB-väg och dämpa ROS-produktion

Kontakta ali.ma@wecistanche.com för mer information

KLICKA HÄR FÖR Del 1

Del 2|Hur främjar akteosider bentillväxt?

Klicka till Cistanches med Acteoside

Diskussion

Benremodellering regleras hårt av balansen mellan benbildning av osteoblaster och benresorption av osteoklaster. Långvarig och överdriven benresorption orsakar en obalans i skelettomsättningen, vilket resulterar i benresorptiva sjukdomar. Att utforska effekterna avakteosidpå osteoklastogenes använde vi två makrofager, primärodlade BMM och RAW264.7-celler. Dessa celler stimulerades med RANKL för att differentiera till osteoklaster i närvaro och frånvaro avakteosid. Det visade vi för första gångenakteosidhämmar osteoklastdifferentiering och bildning.Akteosidvid de undersökta koncentrationerna orsakade inte en minskning av livsdugligheten hos de primära odlade makrofagerna under både tillväxt- och differentieringsförhållanden.Akteosidbehandling minskade också resorptionsaktiviteten hos mogna osteoklaster. Dessa resultat tyder på att akteosid undertrycker osteoklastisk bildning från makrofager och osteoklastresorptionsaktivitet. Resultaten från vårt odlingssystem, som inte inkluderade osteoblaster eller stromaceller, tyder också på att acteosid förhindrar osteoklastbildning genom att direkt verka på osteoklastprekursorer. RANKL aktiverar MAPK inklusive p38, ERK och JNK. Dessa tre kinaser är involverade i tidig osteoklastisk differentiering och därmed deras hämning farmakologiskt eller med en dominant-negativ JNK-transfektion undertrycker RANKL-inducerad osteoklastogenes [29]. Våra resultat visade detakteosidförbehandling hämmade alla dessa kinaser, vilket indikerar en ospecifik nedreglering av MAPK. Detta resultat skilde sig delvis från den tidigare rapporten att EGCG, den viktigaste antiinflammatoriska föreningen i grön tee, specifikt försvagade JNK-aktivering utan att påverka eller p38-aktivering i RANKL-stimulerade BMMs [7]. Paeonol, en antiinflammatorisk förening som härrör från en kinesisk ört, har också rapporterats hämma ERK och p38, men inte skräp, fosforylering i RANKL-stimulerade RAW264.7-celler[30]. Däremot försvagade silibinin, en ny hämmare i ben, ranginducerad aktivering av p38, ERK och JNK [31]. Dessa fynd tyder på att effekterna av anti-resorptiva föreningar på MAPK-aktivering av RANKL beror på föreningen, även om alla tre MAPK är involverade i tidig osteoklastogenes. Med tanke på observationen att akteosid försvagade p-JNK-nivåer i RANKL-stimulerade BMM, även vid 1 mm, verkade blockeringen av JNK snarare än av p38 MAPK eller ERK vara en mer specifik händelse iakteosid-medierad anti-osteoklastogenes i cellerna. Även om akteosid vid samma koncentration inte minskade antalet osteoklaster i BMM, var det en signifikant minskning av gropbildning genom akteosidbehandling. Vi fann också att förbehandling med SP600125, en farmakologisk hämmare specifik för JNK, dramatiskt förhindrade bildandet av osteoklaster (data visas inte). Sammantaget tyder dessa fynd på att JNK-medierad signalering är nära relaterad till den akteosidmedierade suppressionen av osteoklastogenes stimulerad av RANKL. NF-kB-signalering reglerar cellulära händelser, inklusive apoptos, cellcykelprogression, celladhesion, cytokinproduktion och överlevnad i makrofager [32]. NF-kB-signalering krävs också för osteoklastutveckling, vilket har visats genom uppkomsten av osteopetros hos NF-kB-knockoutmöss [33,34]. Därför föreslås inhibering av NF-kB vara ett effektivt mål för antiresorptiva medel för att nedreglera osteoklastaktivitet och behandla osteoporos. Post-translationell modifiering av NF-kB-subfamiljeproteiner är avgörande för att modulera NF-kB-aktivitet. Speciellt är fosforylering av p65-subenheten och IkB-kinas avgörande för att NF-kB ska inducera osteoklastogenes [7]. Våra nuvarande fynd visade att RANKL-stimulering ökade DNA-bindande aktivitet av NF-kB och fosforylering av p65-subenheten och Ikea i både BMM och RAW264.7-celler. Förbehandling med akteosid hämmade dessa RANKL-inducerade ökningar, vilket resulterade i nedreglerad NF-kB-aktivitet. Följaktligen tyder dessa resultat på att, förutom MAPK, är NF-kB-signalering huvudmålet för akteosid för att hämma osteoklastdifferentiering och bildning från RANKL-stimulerade makrofager. Förutom NF-kB-signalering spelar c-Fos/c-Jun/NFATc1-vägen nyckelroller i osteoklastutvecklingen, varför bristen på något av dessa proteiner kan stoppa osteoklastogenes [35,36]. I denna studie fann vi att acteosid förhindrade det RANKL-inducerade c-Fos- och NFATc1-uttrycket på mRNA- och proteinnivåerna. JNK är ett uppströms kinas av c-Jun, vilket krävs för NFATc1-uttryck och osteoklastogenes som svar på RANKL [29] . Blockering av JNK/c-Jun-vägen med en JNK-hämmare minskade RANKL-inducerad osteoklastbildning och c-Fos och NFATc1-uttryck [7]. Våra resultat och tidigare fynd tyder på att inhibering av JNK-medierad signalering av akteosid är nära associerad med att förhindra RANKL-medierad c-Fos och NFATc1

expression, som undertrycker osteoklastdifferentiering i makrofager. Skillnader i effekterna avakteosidpå BMM och RAW264.7-celler beror åtminstone delvis på skillnader i känsligheten för JNK-hämning. TNF-a kan inducera osteoklastogenes oberoende av RANKL-RANK-signalering [37]. IL-1 är en potent mediator av patologisk bendestruktion inducerad av östrogenbrist eller inflammation[7]. Att störa typ I IL-1-receptorn eller IL-1-signalering kan vända benförlust inducerad av ovariektomi [38] eller reumatoid artrit [39]. Denna studie visade förmågan attakteosidför att minska produktionen av inflammatoriska cytokiner som TNF-a, IL-1b och IL-6 i makrofager. Akteosid tros hämma inflammatorisk cytokinproduktion genom att undertrycka p38-kinas- ochERK-signalering eftersom aktivering av ERK1/2, p38 MAPK eller båda krävs för lipopolysackarid-inducerad produktion av dessa cytokiner i makrofager [40,41]. Luteolin, en inflammatorisk förening, hade också rapporterats undertrycka produktionen av inflammatoriska mediatorer genom att hämma aktivering av p38 MAPK [42]. I denna studie fann vi också att akteosid försvagade benförlusten hos ovariektomierade möss, vilket framgår av den återställda maximala frakturkraften vid mittskaftet av höger lårben och försvinnandet av osteoporotisk kortikalt ben. Oral administrering av akteosid nedreglerade de ovariektomiserade inducerade ökningarna av serum IL-1b och IL-6 nivåer, men inte ALP. De ökade serumnivåerna av kalcium, TRAP och OC i OVX hämmades också av oral behandling med akteosid, vilket tyder på att akteosid dämpar förändringar av biomarkörer specifika för benbildning såväl som resorption. Eftersom osteoporos kännetecknas av en minskad masstäthet och försämrad trabekulär benmikroarkitektur, hämmades OVX-inducerad trabekulär benförlust och morfometrisk parameterändring signifikant av oral akteosidadministrering. Dessa fynd tyder på detakteosidkan användas som ett anti-resorptivt medel för att behandla osteoporos genom att vända obalanserad osteoklastaktivering. Osteoblaster är dock den primära faktorn som är ansvarig för ny benbildning. Således behövs ett medel som kan öka osteoblastproliferation eller differentiering för att förbättra benbildningen [30]. Däremot fann vi att akteosid inte påverkade osteoblastdifferentiering eller mineralisering i DAG-behandlade benmärgsceller. Sammantaget tyder våra resultat på att akteosid har en anti-resorptionseffekt men inte direkt påverkar benbildningen. Mer detaljerade experiment som analyserar benspecifika parametrar in vivo och in vitro behövs för att klargöra om akteosid gynnar osteoblastogenes eller inte. Den föreliggande studien belyser den hämmande effekten av acteoside på osteoklastdifferentiering och benresorption genom att undertrycka MAPKs och flera transkriptionsfaktorer såsom NF-kB , c-Fos och NFATc1. Data antyder två möjliga mekanismer genom vilka acteosid har dessa fördelar. En möjlighet är detakteosid.

hämmar osteoklastogenes på grund av dess antioxidantpotential. Många studier har visat att receptormedierad ROS-produktion kan fungera som en nedströms signalförmedlare [43-45]. Ett fåtal kinaser och transkriptionsfaktorer är känsliga för det cellulära redoxtillståndet, vilket påverkar olika cellulära händelser. RANKLstimulerar ROS-produktion, som förmedlar RANKL-inducerade cellulära svar för osteoklastdifferentiering [24]. Förbehandling med antioxidanter, såsom N-acetylcystein och glutation, förhindrade RANKL-medierad ROS-generering, vilket indikerar att antioxidanter minskar benförlust genom att sänka RANKL-inducerad reproduktion [24]. I överensstämmelse med dessa fynd visar den här studien detakteosiddämpar intracellulär ROS producerad i BMMs under osteoklastdifferentiering på ett dosberoende sätt. Denna observation antyder att hämningen av osteoklastogenes åtminstone delvis beror på antioxidantpotentialen hos akteosid. Vi föreslår också att akteosid kan nedreglera Ca2 plus inflöde och därmed undertrycka osteoklastogenes. Akteosid rapporterades nyligen hämma typ I-allergier genom att nedreglera/NFAT- och JNK-signalering i basofila celler [46]. Den kalciumavkännande receptorn är nära relaterad till regleringen av osteoklastogenes [47]. Detta förhållande tyder på att en kalciumkanal är inblandad iakteosid-inducerad hämning av osteoklastdifferentiering och bildning. Det krävs dock ytterligare studier för att utforska de exakta mekanismerna genom vilka acteosid fungerar som ett anti-resorptivt medel genom modulering av Ca2 plus homeostas.

Sammanfattningsvis visar våra nuvarande fynd att akteosid hämmar RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering från BMM och RAW264.7 makrofager och undertrycker benresorption av mogna osteoklaster.Akteosidförhindrar också RANKL-inducerad aktivering av tre välkända MAPK och transkriptionsfaktorer som NF-kB, c-Fos och NFATc1, såväl som produktionen av inflammatoriska cytokiner som TNF-a, IL-1b, och IL-6. Dessutom dämpar oral administrering av akteosid ovariektomi-inducerad osteoporos, även om det inte påverkar osteoblastogenes från benmärgsceller. Sammantaget tyder dessa fynd på att CTE-sidan har fördelaktiga roller för att minska osteoklastbildning och aktivitet som ett potent anti-resorptivt medel.

Stödjande information

Figur S1 Akteosids kemiska struktur.

(TIF)Figur S2Akteosidförhindrar RANKL-inducerad gropbildning i BMM. A BMM förbehandlades med de angivna doserna avakteosidunder 2 timmar i benbelagda 24-brunnsplattor och stimulerades med 50 ng/ml M-CSF och 100 ng/ml RANKL i 7 dagar. Gropbildning observerades under optisk mikroskopi. B, BMM odlades med M-CSF och RANKL i närvaro av olikaakteosidkoncentrationer ({{0}}–20 mM), och 7 dagar senare kvantifierades det resorberade området från 3 oberoende experiment och uttrycktes som en procentandel av kontroll (n=4 per experimentera). *p,0.05, **p,0.01 och ***p,0.001 jämfört med celler odlade med M-CSF och rangordning.

Figur S3 Akteosid dämpar produktionen av inflammatoriska cytokiner i RANKL-stimulerade RAW264.7-celler.

Celler förbehandlades med de ökande koncentrationerna (0–10 mM) avakteosidi 2 timmar följt av stimulering med 100 ng/ml RANKL i 48 timmar. Nivåerna av TNF-a, IL-1b och IL-6 bestämdes genom att använda ELISA-kit. ***p,0.001 vs. celler utan RANKL och akteosid. #p,0.05 och ##p,0.01 vs. celler stimulerade med endast RANKL.

Författarbidrag

Utformade och designade experimenten: S-YL J-CL. Utförde experimenten: S-YL K-SL S-HK SHY. Analyserade data: K-SL S-YL J-CL. Bidragna reagenser/material/analysverktyg: S-YL SHY J-CL. Skrev uppsatsen: S-YL SHY J-CL.

Referenser

1 Rho J, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimmunologi: interaktioner mellan immun- och skelettsystemet. Molecules and Cells 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Ben och benmärg: samma organ. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporos: nu och framtiden. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Benmetastaser i prostatacancer: nya terapeutiska strategier. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Upptäckter, droger och skelettsjukdomar. Nature ReviewsDrug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutiska metoder för bensjukdomar. Science289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigallocatechin-3-gallate hämmar osteoklastogenes genom att nedreglera c-Fos-uttryck och undertrycka nukleär faktor-kappaB-signal. Molecular Pharmacology 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, en bensamidhistondeacetylashämmare, förhindrar osteoklastogenes genom att nedreglera Fos-uttryck och undertrycker benförlust hos möss. European Journal of pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, Ma JY (2013) Den anti-osteoporotiska effekten av Yijung-tang i en ovariektomiserad råttmodell förmedlad av hämning av osteoklastdifferentiering. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Fiskolja undertrycker benresorption genom att hämma osteoklastogenes genom minskat uttryck av M-CSF, PU.1, MITF och RANK hos ovarieektomiserade råttor. Molecular Medicine Reports 7:1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklasten: en flerkärnig, benresorberande osteoimmuncell med hematopoetisk ursprung. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Regulatorymechanism of osteoclastogenesis by RANKL and Wnt signals. Frontiers in bioscience 16: 21–30.

13. Jules J, Zhang P, Ashley JW, Wei S, Shi Z, et al. (2012) Molekylär grund för kravet på receptoraktivator för nukleär faktor-kB-signalering för interleukin 1-förmedlad osteoklastogenes. The Journal of Biological Chemistry 287: 15728–15738.

14. Li C, Yang Z, Li Z, Ma Y, Zhang L, et al. (2011) Maslinsyra undertrycker osteoklastogenes och förhindrar ovariektomi-inducerad benförlust genom att reglera rangförmedlade NF-kB och MAPK-signalvägar. Journal of Bone andMineral Research 26: 644–656.

15. Tomoda M, Miyamoto H, Shimizu N (1994) Strukturella egenskaper och anti-komplementär aktivitet av rehmannan SA, en polysackarid från roten av Rehmannia glutinosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo) 42: 1666–1668.

16. Kim H, Lee E, Lee S, Shin T, Kim Y, et al. (1998) Effekt av Rehmannia glutinosa på en allergisk reaktion av omedelbar typ. International Journal of Immunopharmacology 20: 231–240.

17. Schapoval EE, Vargas MR, Chaves CG, Bridi R, Zuanazzi JA, et al. (1998) Antiinflammatoriska och antinociceptiva aktiviteter av extrakt och isolerade föreningar från Stachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology 60:53–59.

18. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, et al. (1998) Hepatoskyddande aktivitet av fenyletanoider frånCistanche deserticola. Planta Medica 64: 120–125.

19. Chun JC, Kim JC, Hwang IT, Kim SE (2002) Acteosid från Rehmannia-gluten sanulifierar parakvataktivitet i Cucumis sativus. Pesticide Biochemistry and physiology 72: 153–159.

20. Kim SS, Son YO, Chun JC, Kim SE, Chung GH, et al. (2005) Antioxidantegenskaper hos en aktiv komponent renad från bladen av paraquat-tolerant Rehmannia glutinosa. Redoxrapport 10: 311–318.

21. Son YO, Lee SA, Kim SS, Jang YS, Chun JC, et al. (2011) Acteosid hämmar melanogenes i B16F10-celler genom ERK-aktivering och tyrosinasnedreglering. The Journal of Pharmacy and Pharmacology 63: 1309–1319.

22. Yu JY, Lee SY, Son YO, Shi X, Park SS, et al. (2012) Kontinuerlig närvaro av H2O2 inducerar mitokondriemedierad, MAPK- och kaspasoberoende tillväxthämning och cytotoxicitet i humana gingivalfibroblaster. Toxicology In Vitro 26: 561–570.

23. Lu J, Yu JY, Lim SS, Son YO, Kim DH, et al. (2013) Cellulära mekanismer för de cytotoxiska effekterna av zearalenonmetaboliterna a-zearalenon och b-zearalenon på RAW264.7-makrofager. Toxicology In Vitro 27: 1007–1017.

24. Ha H, Kwak HB, Lee SW, Jin HM, Kim HM, et al. (2004) Reaktiva syrearter medierar RANK-signalering i osteoklaster. Experimentell cellforskning301: 119–127.

25. Cho ES, Kim MK, Son YO, Lee KS, Park SM, et al. (2012) Effekterna av rosiglitazon på osteoblastisk differentiering, osteoklastbildning och benresorption. Molecules and Cells 33: 173–181.

26. Son YO, Jang YS, Heo JS, Chung WT, Choi KC, et al. (2009) Apoptosinducerande faktor spelar en avgörande roll i kaspasoberoende, pyknotisk celldöd i väteperoxidexponerade celler. Apoptosis 14: 796–808.

27. Kook SH, Jeon YM, Park S, Lee JC (2013) Parodontala fibroblaster modulerar proliferation och osteogen differentiering av embryonala stamceller genom produktion av fibroblasttillväxtfaktorer. Journal of Parodontology In Press

28. Qi W, Yan YB, Lei W, Wu ZX, Zhang Y, et al. (2012) Förebyggande av osteoporos som inte används i råttor med Cordyceps Sinensis-extrakt. Osteoporosis International 23:2347–2357.

29. Ikeda F, Nishimura R, Matsubara T, Tanaka S, Inoue J, et al. (2004) Kritiska roller för c-jun-signalering i regleringen av NFAT-familjen och RANKL-reglerar osteoklastdifferentiering. The Journal of Clinical Investigation 114: 475–484.

30. Tsai HY, Lin HY, Fong YC, Wu JB, Chen YF, et al. (2008) Paeonol hämmar RANKL-inducerad osteoklastogenes genom att hämma ERK-, p38- och NF-kappa B-vägen. European Journal of Pharmacology 588: 124–133.

31. Kim JH, Kim K, Jin HM, Song I, Youn BU, et al. (2009) Silibinin hämmar osteoblastdifferentiering förmedlad av TNF-familjemedlemmar. Molecules and Cells 28: 201–207.

32. Napetschnig J, Wu H (2013) Molekylär grund för NF-kB-signalering. Annual Review of Biophysics 42: 443–468.

33. Franzoso G, Carlson L, Xing L, Poljak L, Shores EW, et al. (1997) Krav på NF-kappaB vid utveckling av osteoklaster och B-celler. Gener och utveckling11: 3482–3496.

34. Iotsova V, Caamano J, Loy J, Yang Y, Lewin A, et al. (1997) Osteopetros hos möss som saknar NF-kappaB1 och NF-kappaB2. Naturmedicin 3: 1285–1289.

35. Teitelbaum SL (2004) RANKNING c-juni i osteoklastutveckling. The Journal of Clinical Investigation 114: 463–465.

36. Takayanagi H (2005) Mekanistisk insikt i osteoklastdifferentiering inom osteoimmunologi. Journal of Molecular Medicine (Berl) 83: 170–179.

37. Cho ES, Lee KS, Son YO, Jang YS, Lee SY, et al. (2010) Kompressionsmekanisk kraft förstärker osteoklastogenes av benmärgsmakrofager genom aktivering av c-Fms-medierad signalering. Journal of Cellular Biochemistry 111: 1260–1269.

38. Lorenzo JA, Naprta A, Rao Y, Alander C, Glaccum M, et al. (1998) Möss som saknar typ I-interleukin-1-receptorn förlorar inte benmassa efter ovariektomi. Endocrinology 139: 3022–3025.

39. Abramson SB, Amin A (2002) Blockering av effekterna av IL-1 vid reumatoid artrit skyddar ben och brosk. Rheumatology (Oxford) 41: 972–980.

40. Hwang JM, Yu JY, Jang YO, Kim BT, Hwang KJ, et al. (2010) En fenolsyrafenetylureaförening hämmar lipopolysackarid-inducerad produktion av kväveoxid och pro-inflammatoriska cytokiner i cellkultur. InternationalImmunopharmacology 10: 526–532.

41. Fang M, Lee SY, Park SM, Choi KC, Lee YJ, et al. (2011) Antiinflammatorisk potential för Phaseolus calcaratus Roxburgh, en orientalisk medicin, på LPS-simulerade råa 264,7 makrofager. The Journal of Pharmacy and Pharmacology 63:120–128.

42. Lee JW, Ahn JY, Hasegawa S, Cha BY, Yonezawa T, et al. (2009) Hämmande effekt av luteolin på osteoklastdifferentiering och funktion. Cytotechnology 61:125–134.

43. Cosentino-Gomes D, Rocco-Machado N, Meyer-Fernandes JR (2012) Cellsignalering genom proteinkinas C-oxidation och aktivering. International Journal Molecular Sciences 13: 10697–10721.

44. Lee JC, Son YO, Pratheeshkumar P, Shi X (2012) Oxidativ stress och metallkarcinogenes. Free Radical Biology and Medicine 53: 742–757.

45. Nguyen Ngoc TD, Son YO, Lim SS, Shi X, Kim JG, et al. (2012) Natriumfluorid inducerar apoptos i mus embryonala stamceller genom ROS-beroende och kaspas- och JNK-medierade vägar. Toxikologi och tillämpad farmakologi 259: 329–337.

46. ​​Motojima H, Villareal MO, Iijima R, Han J, Isoda H (2013) Acteosid hämmar typ I-allergi genom nedreglering av Ca/NFAT- och JNK MAPK-signalvägar i basofila celler. Journal of Natural Medicines In Press

47. Caudrillier A, Hurtel-Lemaire AS, Wattel A, Cournarie F, Godin C, et al. (2010) Strontiumranelat minskar receptoraktivator av nukleär faktor-kB-ligand-inducerad osteoklastisk differentiering in vitro: involvering av den kalciumavkännande receptorn. Molecular Pharmacology 78: 569–576.