Del 2:Acteosid undertrycker RANKL-medierad osteoklastogenes genom att hämma C-Fos-induktion och NF-KB-väg och dämpa ROS-produktion
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Snälla klicka här tillbaka till del 1
AkteosidHämmar benresorption av makrofager Acteosid förhindrade också RANKL-medierad benresorption på ett dosberoende sätt, mätt med ett in vitro-modellsystem (Fig. 3A). Benresorption inhiberades signifikant när BMMs inkuberades med 1 mM akteosid (Fig. 3B). En 10 mM akteosidbehandling försvagade nästan fullständigt RANKL-inducerad gropbildning av BMM. På liknande sätt minskade akteosid benresorption i RANKL-stimulerade RAW264.7-celler (fig. S2A och B). Akteosids förmåga att hämma benresorption berodde på tidpunkten för behandlingen i förhållande till RANKL-stimulering. Acteosid (10 mM) tillsatt 4 dagar efter RANKL-stimulering minskade inte gropbildningen i BMM, medan den undertryckte antalet bildade osteoklaster (Fig. 3C). Detta annorlunda resultat berodde delvis på gropområdet som redan bildats efter 4 dagars RANKL-stimuleringsbildning (Fig. 3D).
AkteosidNedreglerar tidiga RANKL-signaleringsvägar
RANKL inducerar aktiveringen av 3 välkända MAPK och NF-kB i osteoklastprekursorer, och denna aktivering krävs för tidig osteoklastdifferentiering. För att förstå de möjliga mekanismerna genom vilkaakteosidhämmar osteoklastogenes, undersökte vi effekten avakteosidpå MAPK och NF-kB-aktivering i makrofager. BMM och RAW264.7-celler förbehandlades med 10 mM akteosid i 2 timmar och stimulerades sedan med 100 ng/ml RANKL under 30 minuter. MAPK-fosforylering undersöktes med Western blotting och immunometrisk analys. RANKL inducerade fosforylering av p38, ERK och JNK i BMMs (Fig. 4A) och RAW264.7-celler (Fig. 4B). Acteosid förhindrade dessa RANKL-inducerade ökningar av p-p38, p-ERK och p-JNK. Detta resultat stöddes av immunometrisk analys, vilken förbehandling med 10 mM akteosid signifikant hämmade nivåerna av fosforylerade MAPK i dessa makrofager (Fig. 4C). RANKL-behandling ökade DNA-bindningen av NF-kB, medan acteosid hämmade RANKL-inducerad aktivering av NF-kB-DNA-bindning (Fig. 5A). Denna hämning var mer framträdande i BMM än i RAW264.7-celler. Acteosid minskade också RANKL-stimulerad p65- och IkBa-fosforylering i BMM och RAW264.7-celler (fig. 5B och C). Tillsats av 10 mM akteosid hämmade nästan fullständigt både nedbrytningen och aktiveringen av IkBa i BMM (Fig. 5B). För att ytterligare bekräfta att NF-kB-aktivering är involverad i verkan av akteosid, transfekterades kB-promotor-luciferaskonstruktioner övergående in i RAW264.7-celler. Cellerna inkuberade med 100 ng/ml RANKL hade 3-faldigt högre kB-promotoraktivitet, som var signifikant försvagad av 10 mM akteosid (Fig. 5D).
AkteosidUndertrycker produktionen av inflammatoriska cytokiner och uttrycket av TNF-a, c-Fos och NFATc1 i RANKL-stimulerade makrofager TNF-a, IL-1b och IL-6 är viktiga vid osteoklastbildning och funktion, som förmedlas av NF-kB-signalering i RANKL-stimulerade makrofager. RANKL stimulerade produktionen av dessa cytokiner, och denna produktion reducerades markant med 10 mM akteosid förbehandling i BMM (Fig. 6A). På liknande sätt försvagade acteosid den RANKL-inducerade produktionen av cytokiner, förutom IL-6, i RAW264.7-makrofager (Fig. S3). För att förstå de molekylära mekanismerna för akteosidverkan i osteoklastogenes, undersökte vi ytterligare effekten av akteosid på uttryck av TNF-a, c-Fos och NFATc1. RANKL uppreglerade mRNA-uttrycket av dessa faktorer i BMM och RAW264.7-celler (fig. 6B och C). Förbehandling med 10 mM akteosid hämmade signifikant det RANKL-inducerade uttrycket av dessa faktorer i båda
BMM och RAW264.7-celler. Acteosid förbehandling minskade också kraftigt proteinnivåerna av c-Fos och NFATc1 i RANKL-stimulerade BMMs (Fig. 6D). Dessa resultat tyder på att akteosid nedreglerar RANKL-inducerande mediatorer av osteoklastbildning vid gen- och proteinnivåer.
CISTANCHEEXTRAKT: ACTEOSID
Acteosid minskar intracellulär ROS-generering i BMMs på ett dosberoende sätt
Eftersom det är känt att intracellulär ROS-produktion är korrelerad med RANKL-stimulerad osteoklastogenes, undersökte vi om acteosid hämmar ROS-produktion under RANKL-medierad osteoklastdifferentiering med användning av ett cellpermeabelt, oxidationskänsligt färgämne, DCFH-DA. Flödescytometrianalys visade att den genomsnittliga fluorescenssignalen som var specifik för DCF i BMM:er var uppenbarligen högerskiftad efter stimulering med RANKL, jämfört med de obehandlade kontrollcellerna (Fig. 7A). Denna förändring liknade fallet att RAW264.7-makrofager observerades efter RANKL-stimulering (data visas inte). Behandling av BMM med akteosid minskade signalintensiteten hos DCF på ett dosberoende sätt. Förbehandling med 10 mM akteosid reducerade nästan fullständigt nivåerna av intracellulär ROS producerad under osteoklastdifferentiering till de obehandlade kontrollnivåerna (Fig. 7B).
Oral akteosidadministration hämmar förändring av osteoporotiska biokemiska markörer och benförlust hos ovariektomerade möss
För att utforska effekten av akteosid på benförlust, förberedde vi en osteoporotisk djurmodell genom ovariektomi. Det fanns ingen signifikant skillnad i kroppsvikt mellan OVX- och Sham-möss under experimentperioden (data visas inte). OVX-gruppen hade signifikant högre serumnivåer av IL-1b och IL-6 än Sham-gruppen (Fig. 8). Ovariektomi-inducerade ökningar av dessa inflammatoriska cytokiner försvagades genom oral akteosidadministrering (AC-grupp). Serumnivåerna av benomsättningsmarkörer som ALP, kalcium, TRAP5b och OC ökade signifikant i OVX-gruppen. Av dessa osteoporotiska markörer hämmades uppenbarligen de ökade nivåerna av kalcium, TRAP5b och OC i OVX-möss av akteosidbehandling, medan serumnivån av ALP inte ändrades av behandlingen. Den genomsnittliga maximala frakturbelastningen till mitten av höger lårbensskaft var signifikant lägre i OVX-gruppen än i Sham-gruppen (Fig. 9A). Acteosidbehandling höjde den maximala frakturen tillbaka till den för Sham-gruppen. När lårbenets kortikala ben dissekerades och observerades med optisk mikroskopi, hade de osteoporotiska egenskaperna visade i OVX-gruppen nästan helt försvunnit i AC-möss (Fig. 9B). För att verifiera effekten av akteosid på OVX-inducerad osteoporosmodell, analyserades BMD och benmorfologiska parametrar i trabekulär av det lätta proximala lårbenet med mikro-CT. Såsom visas i Fig. 9C hittades en förändring av den femorala trabekulära arkitekturen i OVX-möss, medan denna förändring minskades genom behandling med akteosid. Resultaten från mikro-CT-analysen visade att BMD, ett mått på benstyrka, minskade dramatiskt i OVX-möss (Fig. 9D). Jämfört med Sham-gruppen visade OVX-möss också signifikanta förändringar i BV/TV, Tb. Sp och Tb. N, men ej i Tb.Th. Oral akteosidbehandling av OVX-möss förhindrade signifikant förändringen i BMD såväl som BV/TV och Tb.N.
Acteosid påverkar inte osteoblastogenes i benmärgsceller
Akteosids roll på osteoblastisk differentiering undersöktes ytterligare med hjälp av benmärgsceller. Såsom visas i Fig. 10A ökade DAG-behandling antalet alizarin rödfärgade celler och detta ändrades inte genom 10 mM akteosidförbehandling. Mängden närvarande färgämne visade att den kombinerade akteosiden ochDAG-behandling förändrade inte mineraliseringen (Fig. 10B). På liknande sätt påverkades inte DAG-inducerade ökningar av det intracellulära kalciuminnehållet (Fig. 10C) och mRNA-nivåer (Fig. 10D) av benspecifika markörer, såsom Runx2, osterix, BSP och OC av förbehandling med acteosid.
effekt av cistanche akteosid
Diskussion
Benremodellering regleras hårt av balansen mellan benbildning av osteoblaster och benresorption av osteoklaster. Långvarig och överdriven benresorption orsakar en obalans i skelettomsättningen, vilket resulterar i benresorptiva sjukdomar. För att utforska effekterna av akteosid på osteoklastogenes använde vi två makrofager, primärodlade BMM och RAW264.7-celler.
Dessa celler stimulerades med RANKL för att differentiera till osteoklaster i närvaro och frånvaro av akteosid. Vi visade för första gången att acteosid hämmar osteoklastdifferentiering och -bildning. Akteosid i sig vid de undersökta koncentrationerna orsakade inte en minskning av livsdugligheten för de primära odlade makrofagerna under både tillväxt- och differentieringsförhållanden.
Akteosidbehandling minskade också resorptionsaktiviteten hos mogna osteoklaster. Dessa resultat tyder på att akteosid undertrycker osteoklastisk bildning från makrofager och osteoklastresorptionsaktivitet. Resultaten från vårt odlingssystem, som inte inkluderade osteoblaster eller stromaceller, tyder också på att acteosid förhindrar osteoklastbildning genom att direkt verka på osteoklastprekursorer.
RANKL aktiverar MAPK inklusive p38, ERK och JNK. Dessa tre kinaser är involverade i tidig osteoklastisk differentiering och därmed deras hämning farmakologiskt eller med en dominant-negativ JNK-transfektion undertrycker RANKL-inducerad osteoklastogenes [29]. Våra resultat avslöjade att akteosidförbehandling hämmade alla dessa kinaser, vilket indikerar en icke-specifik nedreglering av MAPK. Detta resultat skilde sig delvis från den tidigare rapporten att EGCG, den viktigaste antiinflammatoriska föreningen i grön tee, specifikt dämpade JNK-aktivering utan att påverka ERK- eller p38-aktivering i RANKL-stimulerade BMMs [7]. Paeonol, en antiinflammatorisk förening som härrör från en kinesisk ört, har också rapporterats hämma ERK och p38, men inte JNK, fosforylering i RANKL-stimulerade RAW264.7-celler [30]. Däremot försvagade silibinin, en ny hämmare i ben, RANKL-inducerad aktivering av p38, ERK och JNK [31]. Dessa fynd tyder på att effekterna av anti-resorptiva föreningar på MAPK-aktivering av RANKL beror på föreningen, även om alla tre MAPK är involverade i tidig osteoklastogenes.
Med tanke på observationen att akteosid försvagade p-JNK
nivåer i RANKL-stimulerade BMM, även vid 1 mM, verkade blockeringen av JNK snarare än av p38 MAPK eller ERK vara mer specifik händelse i akteosid-medierad anti-osteoklastogenes i cellerna. Även om akteosid vid samma koncentration inte minskade antalet osteoklaster i BMM, var det en signifikant minskning av gropbildning genom akteosidbehandling. Vi fann också att förbehandling med SP600125, en farmakologisk hämmare specifik för JNK, dramatiskt förhindrade bildandet av osteoklaster (data visas inte). Sammantaget tyder dessa fynd på att JNK-medierad signalering är nära relaterad till den akteosidmedierade suppressionen av osteoklastogenes stimulerad av RANKL.
NF-kB-signalering reglerar cellulära händelser, inklusive apoptos, cellcykelprogression, celladhesion, cytokinproduktion och överlevnad i makrofager [32]. NF-kB-signalering krävs också för osteoklastutveckling, vilket har visats genom uppkomsten av osteopetros hos NF-kB-knockoutmöss [33,34]. Därför föreslås inhibering av NF-kB vara ett effektivt mål för antiresorptiva medel för att nedreglera osteoklastaktivitet och behandla osteoporos. Post-translationell modifiering av NF-kB-subfamiljeproteiner är avgörande för att modulera NF-kB-aktivitet. Speciellt är fosforylering av p65-subenheten och IkB-kinas avgörande för att NF-kB ska inducera osteoklastogenes [7]. Våra nuvarande fynd visade att RANKL-stimulering ökade DNA-bindande aktivitet av NF-kB och fosforylering av p65-subenheten och IkBa i både BMM och RAW264.7-celler. Förbehandling med akteosid hämmade dessa RANKL-inducerade ökningar, vilket resulterade i nedreglerad NF-kB-aktivitet. Följaktligen tyder dessa resultat på att, förutom MAPK, är NF-kB-signalering huvudmålet för akteosid för att hämma osteoklastdifferentiering och bildning från RANKL-stimulerade makrofager.
Förutom NF-kB-signalering spelar c-Fos/c-Jun/NFATc1-vägen nyckelroller i osteoklastutvecklingen, varför bristen på något av dessa proteiner kan stoppa osteoklastogenes [35,36]. I denna studie fann vi att acteosid förhindrade det RANKL-inducerade c-Fos- och NFATc1-uttrycket på mRNA- och proteinnivåerna. JNK är ett uppströms kinas av c-Jun, som krävs för NFATc1-uttryck och osteoklastogenes som svar på RANKL [29].
Blockering av theJNK/c-Jun-vägen med en skräphämmare minskade RANKL-inducerad osteoklastbildning och c-Fos och NFATc1-uttryck [7]. Våra resultat och tidigare fynd tyder på att inhibering av JNK-medierad signalering av akteosid är nära associerad med att förhindra RANKL-medierad c-Fos och NFATc1expression, som undertrycker osteoklastdifferentiering i makrofager. Skillnader i effekterna av akteosid på BMM och RAW264.7-celler beror åtminstone delvis på skillnader i känsligheten för JNK-hämning.
TNF-a kan inducera osteoklastogenes oberoende av RANKL-RANK-signalering [37]. IL-1 är en potent mediator av patologisk benförstöring inducerad av östrogenbrist eller inflammation [7]. Att störa typ I IL-1-receptorn eller IL-1-signalering kan vända benförlust inducerad av ovariektomi [38] eller reumatoid artrit [39]. Denna studie visade akteosids förmåga att minska produktionen av inflammatoriska cytokiner som TNF-a, IL- 1b och IL-6 i makrofager. Akteosid tros hämma inflammatorisk cytokinproduktion genom att undertrycka p38-kinas och ERK-signalering, eftersom aktivering av ERK1/2, p38 MAPK eller båda krävs för lipopolysackarid-inducerad produktion av dessa cytokiner i makrofager [40,41]. Luteolin, en inflammatorisk förening, hade också rapporterats undertrycka produktionen av inflammatoriska mediatorer genom att hämma p38 MAPK-aktivering [42]. I denna studie fann vi också att akteosid försvagade benförlusten hos möss som behandlats med äggstockar, vilket framgår av den återställda maximala frakturkraften vid mittskaftet av höger lårben och försvinnandet av osteoporotiskt kortikalt ben. Oral administrering av akteosid nedreglerade de ovarieektomiserade-inducerade ökningarna av IL-1b- och IL-6-nivåer i serum, men inte ALP. De ökade serumnivåerna av kalcium, TRAP och OC i OVX hämmades också av oral behandling med akteosid, vilket tyder på att akteosid dämpar förändringar av biomarkörer specifika för benbildning såväl som resorption. Eftersom osteoporos kännetecknas av en minskad masstäthet och försämrad trabekulär benmikroarkitektur, hämmades OVX-inducerad trabekulär benförlust och morfometrisk parameterändring signifikant av oral akteosidadministrering. Dessa fynd tyder på att akteosid kan användas som ett antiresorptivt medel för att behandla osteoporos genom att vända obalanserad osteoklastaktivering. Osteoblaster är dock den primära faktorn som är ansvarig för ny benbildning. Således behövs ett medel som kan öka osteoblastproliferation eller differentiering för att förbättra benbildningen [30]. Däremot fann vi att akteosid inte påverkade osteoblastdifferentiering eller mineralisering i DAG-behandlade benmärgsceller. Sammantaget tyder våra resultat på att akteosid har en anti-resorptionseffekt men inte direkt påverkar benbildningen. Mer detaljerade experiment som analyserar benspecifika parametrar in vivo och in vitro behövs för att klargöra huruvida acteosid gynnar osteoblastogenes eller inte.
Den föreliggande studien belyser den hämmande effekten av akteosid på osteoklastdifferentiering och benresorption genom att undertrycka MAPK och flera transkriptionsfaktorer som NF-kB, c-Fos och NFATc1. Data antyder två möjliga mekanismer genom vilka acteosid har dessa fördelar.
CISTANCHE ECHINACOSIDE OCH ACTEOSIDE KAN behandla osteoporos
Referenser
1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimmunologi: interaktioner mellan immun- och skelettsystemen. Molecules and Cells 17: 1–9.
2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Ben och benmärg: samma organ. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.
3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporos: nu och framtiden. Lancet 377: 1276–1287.
4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Benmetastaser i prostatacancer: nya terapeutiska strategier. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.
5. Goltzman D (2002) Upptäckter, droger och skelettsjukdomar. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.
6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutiska metoder för bensjukdomar. Science 289: 1508–1514.
7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigallocatechin-3- gallat hämmar osteoklastogenes genom att nedreglera c-Fos-uttryck och undertrycka nukleär faktor-kappaB-signal. Molecular Pharmacology 77: 17– 25.
8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, en bensamidhistondeacetylashämmare, förhindrar osteoklastogenes genom att nedreglera c-Fos-uttryck och undertrycker benförlust hos möss. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.
9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Den anti-osteoporotiska effekten av Yijung-tang i en ovariektomiserad råttmodell förmedlad av hämning av osteoklastdifferentiering. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.
10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Fiskolja undertrycker benresorption genom att hämma osteoklastogenes genom minskat uttryck av M-CSF, PU.1, MITF och RANK hos ovarieektomiserade råttor. Molecular Medicine Reports 7: 1896–1903.
11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklasten: en flerkärnig, benresorberande osteoimmuncell med hematopoetisk ursprung. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.
12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Reglerande mekanism för osteoklastogenes av RANKL- och Wnt-signaler. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.
