Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Snälla klicka här till del 1

Uttryck av CD30 och OX40 är oumbärligt för proliferationen av sjukdomsförmedlande CD4 plus T-celler CD90.2 CD30OX40-celler visade en signifikant minskning av proliferation (Figur 4p och q) och aktivering (Figur 4r och s). Proliferationen av CD30OX40- CD4 plus T-celler stimulerade med Concanavalin A (Figur 6a och b) eller fytohemagglutinin (data visas inte) minskade lika mycket med 50 procent jämfört med CD4 plus T-celler från WTmice, även om denna skillnad inte gjorde det nå statistisk signifikans på grund av vissa extremvärden. Positiviteten för klyvd kaspas3 i lymfkörtlar var jämförbar i CD4 plus T-celler hos friska och nefritiska WT- och CD30OX40~-möss (Figur 6c). Ki-67 var gles i CD4 plus T-möss; deras celler av frisk WT och CD30OX40-r uttalades emellertid Ki-67-positivitet i lymfkörtlar hos nefritiska WT-möss (Figur 6d). Lymfkörtlar hos nefritiska CD30OX40-/möss hade ett färgningsmönster som var jämförbart med friska möss (Figur 6d). CD30OX40-/- nefritiska möss visade lägre procentandel av prolifererande Ki-67 plus centrala minnesceller, effektor-T-celler och Tregs (Figur 6e) i lymfkörteln.

Cistanche kan hjälpa till att behandla njursjukdom

Behandling med CD30LcOX40L-antikroppar förbättrar NTS-index

Den terapeutiska potentialen för att rikta in sig på CD30 och OX40 utvärderades genom att behandla möss med aCD30LxOX40L-, aCD30L- eller aOX40L-antikroppar med början 3 dagar före NTS-induktion. Det fanns en minskning av albuminuri (Figur 7a), PAS-poäng, halvmånepoäng och rörformiga avgjutningar (Figur 7b, c och e) hos möss behandlade med xCD30LaOX40L-antikroppar jämfört med isotypbehandlade möss (Figur 7a och b). Vi hittade en signifikant minskning av intraluminal trombpoäng (Figur 7d) och akut tubulär skadapoäng (Figur 7f) hos möss som förebyggande behandlades med xCD30LaOX40L-antikroppar jämfört med isotypbehandlade möss, medan ingen effekt observerades efter en enda blockad av liganderna.Njure-infiltrerande CD4 plus T-celler och neutrofiler (Figur 7g, h och j) minskade signifikant hos möss behandlade med aCD30LxOX40L-antikroppar. Inga ändringar i antaletnjure-infiltrerande CD8 plus T-celler och CD68 plus makrofager (Figur 7i och k) detekterades.

Om behandling med xCD30LxOX40L-antikroppar inleddes 3 dagar efter etablerad sjukdom, tenderade albuminuri och glomerulära PAS-poäng att minska, men ingen skillnad i serum-BUN upptäcktes (kompletterande figur 7A-C). Häri minskade också infiltrationen av njur-CD4 plus T-celler och neutrofiler signifikant (kompletterande figur S7F). Det fanns ingen skillnad i totalt antal CD4 plus T-celler i det perifera blodet hos möss behandlade med antingen isotypkontrollantikropp eller aCD30LaOX40L antikroppar (kompletterande figur 7G) eller i uttrycket av CD44 och CD62L i CD4 plus T-celler i lymfkörtlar (kompletterande Figur 6H). Tregs hittades också i jämförbara antal i båda grupperna (data visas inte). Th1-, Th17- och Treg-markörer på mRNA-nivå var jämförbara i lymfkörtlar hos möss behandlade med antingen isotypkontrollantikropp eller xCD30LaOX40L-antikroppar (kompletterande figur S7I). När mjältceller från nefritiska möss behandlade med aCD30LxOX40L-antikroppar återstimulerades med kanin-IgG fann man dock en signifikant minskad proliferationskapacitet av CD4 plus T-celler jämfört med isotypbehandlade möss, utan att apoptos påverkades (Figur 7). Inga skillnader i C3-titrar upptäcktes pånjureobjektglas, och ingen skillnad i mus-anti-kanin-IgG upptäcktes i serum från möss behandlade med xCD30LoOX4OL med början 3 dagar efter NTS-induktion jämfört med isotypkontrollbehandlade möss (kompletterande figur S7D och E).

DISKUSSION

I denna studie visar vi ett betydande bidrag av samstimulerande signalering via TNF-superfamiljmedlemmar CD30 och OX40 till CD4 plus T-cellsberoende murin immunkomplex glomerulonefrit. Vi visar att förebyggande blockad av CD30- och OX40-ligander avsevärt förbättrar sjukdomen genom induktion av perifer tolerans via en framträdande minskning av CD4 plus effektor T-cellsproliferation och defekt CCR6-medierad migration av Th17-celler tillnjure.

Baserat på nuvarande kunskap om involveringen av CD30 och OX40 i autoimmunitet undersökte vi om dessa receptorer är involverade i patogenesen av NTS. CD30 och OX40 är uppreglerade på T-celler vid antigenmöte. Uttrycket av både CD30 och OX40, såväl som CD30L och OX40L, ökade på CD4 plus T-celler i vår NTS-modell, som också har hittats tidigare hos SLE-patienter.16-20 CD30 och OX40 ökade mest markant på Th17-celler och Tregs, medan CD30L ökade på Tregs och OX40L visade ökat uttryck på båda. Intressant nog nedreglerades liganderna CD30L och OX40L på dendritiska celler, neutrofiler och monocyter under det senare förloppet av NTS. Vi antar att denna nedreglering sker kontraaktivt efter långvarig aktivering.

CD30OX40-/möss visade sig vara helt skyddade från sjukdomen, medan NTS-fenotypen i CD30~ och OX40 var jämförbar med WT-kontroller. Varken friska CD30OX40-/- möss eller enstaka knockoutmöss visade förändringar i leukocytfenotyp eller förändringar i relativa cellantal i sekundära lymfoida organ.

Distinkta CD4 plus T-cell subpopulationer, såsom Th1 och Th17 celler, har visat sig kritiskt påverka NTS via rekrytering av makrofager och neutrofiler.28,5

Figur 4| CD30OX40-/möss visar en Thelper cell 17 (Th17) trafikdefekt. Efter adoptiv överföring av CD4* T-celler från CD90.1 vildtyp (W) möss och CD90.2 CD30OX407 möss i förhållandet 1:1 i Rag1 möss (n =5 möss), möss utsattes för nefrotoxisk serumnefrit och följdes upp i 4 dagar.(ac) Procentandelar av Thelper-cell 1 (Th1), (df) T-hjälparcell 2 (Th2) och (g) -iTh17-celler av antingen CD90.1 WT eller CD90.2 CD30OX40-/möss utvärderades i (a,b,de,g,h) mjältar (c,f,i) ochnjurar. Uttryck av kemokinreceptorer (k) CXC kemokin (forts.)

Figur 5|CD30OX40-brist påverkar inte differentieringen av CD4 plus T-celler. (a) Representativa punktdiagram och (b) proportioner av CD4 plus T-celler med T-hjälparcell 17 (Th17) fenotyp efter stimulering av CD4* T-celler från vildtyp (WT) och CD30OX40~7 möss under Th17 polariserande förhållanden (n { {13}} möss per grupp). (c) Representativa punktdiagram och (d) proportioner av CD4*T-celler med fenotypen T-hjälparcell 1 (Th1) efter stimulering av CD4 plus T-celler från WT- och CD30OX40~-möss under Th1-polariserande förhållanden (n {{22 }} möss per grupp). Alla data visar medelvärde ± SEM från 2 oberoende experiment. Ifn, interferon; Il, interleukin.

Vi visade att skydd mot sjukdom är CD4 plus T-cellsberoende genom att inducera NTS i Rag1-/möss rekonstituerade med CD4 plus T-celler. Jämförbart antal CD4 plus-celler i mjältar från båda grupperna tidigt efter T-cellsöverföring uteslöt defekt rekonstitution av CD30OX40---celler. Under sjukdomen reducerades antalet CD4 plus T-celler signifikant i mjälten hos Rag1- möss som fick CD4 plus T-celler från CD30OX40~-möss. Rag1-/möss visade signifikant mildare sjukdom efter 14 dagar när de rekonstituerades med CD30OX40~- CD4 plus T-celler jämfört med WT CD4 plus T-celler. CD30OX40-/- CD4 plus T-celler (nämligen minnesceller, effektor CD4 plus T-celler och Tregs) visade sig ha en minskad proliferativ kapacitet både in vitro och in vivo i lymfkörtlar.

Adekvata immunsvar vid möte med ett antigen kräver snabb proliferation, differentiering och migrering av T-celler. T-cellsproliferation i sekundära lymfoida organ är inte bara förknippad med svar riktade mot ett antigen, utan kan också gynna autoimmunitet när homeostatisk proliferation äger rum.7 Även om antaletnjure-infiltrerande T-celler, makrofager och neutrofiler reducerades i CD30OX40-/möss som utsattes för NTS, total cellularitet i lymfkörtlar var stabil. Emellertid reducerades T-cellsproliferation i lymfkörtlar hos nefritiska CD30OX40--möss till nivån för friska WT-möss, vilket tyder på en potentiell minskning av patogena T-cellskloner samtidigt som de bibehåller steady-state-förhållanden. Därigenom minskar en defekt i T-cellsrepertoaren som en orsak tillnjureinfiltrerande CD4 plus-celler exkluderades.

Även om signalering via CD30 och OX40 har kopplats till T-cellsdifferentiering,8 påverkade förlusten av CD30 och OX40 – i våra händer – inte potentialen för CD4 plus T-celler negativt att differentiera mot antingen en Th1- eller en Th17-fenotyp under polariserande förhållanden i vitro. I alla fall,

data om OX40:s roll för Th17-kampanjen verkar vara dikotom.38,40

I linje med våra in vitro-data visade adoptivt överförda CD90.2 CD30OX40---celler ökade procentandelar av Th1-, Th2- och Th17-celler i mjälten jämfört med CD90.1 WT-celler. Vårt fynd kan förklaras av kompensatorisk uppreglering av CD28-signalering under de icke-fysiologiska in vitro- och adoptivöverföringsförhållandena, där CD30 och OX40 inte är tillgängliga på CD4 plus-celler. Följaktligen hittades CD4 plus T-celler som uttrycker CD28 i signifikant ökat antal i lymfkörtlar hos nefritiska CD30OX407/- möss jämfört med WT-möss. Samöverförda CD30OX40-/celler hade ökade procentandelar av Th1- och Th2-celler injurarjämfört med WT-celler, som efterliknar den ökade Th1- och Th2-fenotypen av CD4 CD30OX40~-celler i mjälten. Dessa fynd är i överensstämmelse med ökat CXCR3-uttryck på CD30OX40---celler i mjälten eftersom CXCR3 är känt för att förmedla Th1-migrering till njuren.1 CCR6 förmedlar Th17-migrering tillnjure.2 Häri resulterar den signifikanta minskningen av CCR6-uttryck på CD30OX40-- clls i minskad migration av CD30OX40- Th17-celler till njuren och slutligen minskar vävnadsskadan. Ändå måste vi komma ihåg att det absoluta antalet infiltrerande CD4 plus T-celler injurereducerades kraftigt när CD30OX40~/- celler överfördes, vilket förklarar skyddet för dessa möss till och med

Figur 7|Förebyggande behandling med aCD30LoOX40L-antikroppar minskar histologisk skada och sjukdomsindex vid nefrotoxisk serumnefrit (NTS). Behandling med xCD30LaOX40L-antikroppar inleddes 3 dagar före NTS-induktion. (a) Albuminuri utvärderades hos möss behandlade med isotyp, aCD30LxOX40L, CD30L eller xOX40L efter 14 dagars NTS (n =5 möss per grupp), (b) Glomerulär periodic acid-Schiff (PAS) poäng, (c) ) halvmånepoäng, (d) kapillär intraluminal trombpoäng, (e) tubulära gipsar och (f) poäng för akut tubulär skada utvärderades. Antalet (g,h)CD4 plus T-celler, (i) CD8 plus T-celler, (i)neutrofiler och (k) CD68 plus makrofager utvärderades.() Splenocyter från nefritiska möss behandlade med aCD30L och aOX40L antikroppar (n { {18}} möss per grupp) eller isotypantikropp (n =4) som började 3 dagar efter etablerad sjukdom utmanades med kanin-lgG under 24 timmar. Procentandelar av sen apoptotiska CD4 plus-celler (annexin V propidiumjodid [PI) och prolifererande (Ki-67) CD4*-celler anges. Data visar (a,l) medel ± SEM;(bg,ik) medianvärden är indikerade genom en horisontell linje. Data är representativa för 2 oberoende experiment.*P<><0.01. hpf,="" high-power="" field.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">njure-international.org.

även om de få infiltrerande cellerna visade en framträdande Th1-fenotyp.

Tregs begränsa NTS i regionala dränerande lymfkörtlar,7,30 men också inomnjurei den långvariga fasen av sjukdomen. Odobasic et al. postulerade att OX40L förbättrar Treg-funktionen i NTS. Tidigare data har dock ytterligare visat att även i frånvaro av Tregs räddade kombinerad upphävande av CD30- och OX40-signaler möss från dödlig autoimmun sjukdom. I våra händer hittades inga förändringar i procentandelen Tregs i nefritiska CD30OX40-möss jämfört med WT-möss, men effektor- och minnes-T-celler, såväl som Tregs, prolifererade mindre i CD30OX40---möss. Således tycks perifer tolerans, inducerad av blockering av CD30- och OX40-signalering, induceras genom att blockera patogena T-cellseffektorkloner snarare än att öka Treg-tal. Ändå behövs ytterligare experiment för att undersöka om Treg-funktionen påverkas i vår miljö.

Förebyggande kombinerad applicering av xCD30L- och xOX40L-blockerande antikroppar i möss med NTS visade att blockad av CD30- och OX40-kostimulerande vägar minskar utsöndringen av njuralbumin och, viktigast av allt, histopatologiska index, såväl som cellinfiltration av CD4 plus T-celler och neutrofiler injure. När kombinerad antikroppsblockad påbörjades 3 dagar efter sjukdomsdebut, reducerades även sjukdomsindex, även om effekterna inte var lika uttalade. Totala CD4-blod- och lymfkörtel-T-celler skilde sig inte i antal, och proportionerna av effektor-T-celler, centrala minnes-T-celler, effektorminnes-T-celler och naiva T-celler var jämförbara mellan behandlade och obehandlade möss. Detta är viktigt för en eventuell framtida klinisk tillämpning eftersom det visar att det systemiska immunsvaret inte förändras. Därmed är den samstimulerande blockaden ett attraktivt terapeutiskt alternativ vid T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar. Detta terapeutiska tillvägagångssätt har fördelen att selektivt blockera expansionen och migrationen av antigenspecifika T-celler, vilket leder till tolerans mot främmande och självantigener. 4-45"

Separat blockad av antingen CD30L eller OX40L med antikroppar förebyggande i nefritiska mikrofoner visade ingen signifikant förbättring, vilket ses med dubbel blockad av CD30L och OX40L. När det gäller OX40:s roll har divergerande resultat hittats i experimentella modeller av nefrit. Även om i linje med våra fynd förvärrade agonistiska OX40 monoklonala antikroppar njursjukdom i en musmodell av SLE," rapporterades nyligen en skyddande effekt av OX40L vid halvmånesk glomerulonefrit. I analogi med tidigare fynd verkar CD30 och OX40 fungera synergistiskt i vår NTS Ändå kan även experimentell uppställning och val av modeller, såsom antiserumvärd, tidpunkt och mängd av antikroppsapplicering, bidra till olika resultat.

Denna studie föreslår potentialen för kombinerad blockad av CD30- och OX40-samstimulerande vägar som en ny terapeutisk strategi för att uppnå perifer tolerans i autoimmunitet genom att minska patogen hyperproliferation i sekundära lymfoida organ och migration av sjukdomsfrämjande Th17-celler. Dessutom är det troligt att kombinerad CD30- och OX40-blockad skulle resultera i färre livshotande infektioner än traditionella immunsuppressiva terapier.

AVSLÖJANDE

Alla författarna deklarerade inga konkurrerande intressen.

TACK

Detta arbete stöddes av de österrikiska vetenskapsfonderna till PE (P27537-B26) och den österrikiska nationalbanken OeNB (nummer 17212 till KE) samt doktorandprogrammen MOL MED och MOLIN (W1241) vid Medical University of Graz, som stöds av de österrikiska vetenskapsfonderna. KS finansieras av ett utredarinitierat forskningsanslag av Baxter. Visuell abstrakt skapades med BioRender.com.

FÖRFATTARBIDRAG

KA, AHK, PE, ARR, ALl, HY, JPL och KE utformade studien; KA, AHK, AAM, DJC, IA, CS, KAK, KS, MS och KE utförde experiment; KA, AHK, DJC och KE analyserade data; KA gjorde figurerna; KA och KE utarbetade och reviderade artikeln; alla författare godkände den slutliga versionen av artikeln.

TILLÄGGSMATERIAL Kompletterande fil (PDF)

Figur S1. Uttryck av CD30, CD30L, OX40 och OX40L i mjälte, lymfkörtel ochnjurar.

Figur S2. Leukocytfenotyp av frisk CD30-/-, OX40-/ och CD30OX40-/-

Bild S3. Tregs i lymfkörtlar hos WT och CD30OX40-/möss. Bild S4. Renhet hos isolerade CD4 plus T-celler.

Figur S5.Rag1-möss rekonstitueras effektivt med CD4 plus Tceller från WT- och CD30OX40-/- möss.

Figur S6.Gatingstrategier för Th1 och Th17 flödescytometri, Figur S7. Behandlingsstart med xCD30LxOX40L-antikroppar efter etablerad sjukdom förbättrar njurcellsinfiltrationen i NTS. Kompletterande metoder.

REFERENSER

1. Chen L Flies DB. Molekylära mekanismer för samstimulering och hämning av T-celler. Nat Rey Immunol, 2013:13:227-242.

2. Adams AB, Ford ML, Larsen CP. Costimulation blockade in autoimmunity and transplantation: the CD28pathway.J Immunol.2016:197:2045-2050. 3. Croft M, Duan W, Choi H, et al. TNF-superfamilj vid inflammatorisk sjukdom: översätta grundläggande insikter. Trender Immunol. 2012;33:144-152.

4. Gaspal F, Bekiaris V, Kim MY, et al. Kritisk synergi av CD30- och OX40-signaler i CD4 T-cellshomeostas och Th1-immunitet mot Salmonella. J Immunol, 2008:180:2824-2829.

5. Gaspal FMC, Kim MY, McConnell FM, et al. Möss som saknar OX40- och CD30-signaler saknar minnesantikroppssvar på grund av bristfälligt CD4 T-cellsminne. J Immunol. 2005;174:3891-3896.

6. Gaspal FM, Withers D, Saini M, et al. Upphävande av CD30- och OX40-signaler förhindrar autoimmun sjukdom hos möss med FoxP3-brist. J Exp Med. 2011;208:1579-1584.

7. Z.Croft M. Rollen av TNE-superfamiljmedlemmar i T-cellsfunktion och sjukdomar. Nat Rev Immunol. 2009;9:271-285.

8. Wright CW, Rumble JM, Duckett CS. CD30 aktiverar både de kanoniska och alternativa NF-kappaB-vägarna i anaplastiska storcelliga lymfomceller. J Biol Chem. 2007;282:10252-10262.

9. Chakrabarty S, Nagata M, Yasuda H, et al. Kritiska roller för CD30/CD3OL-interaktioner i murin autoimmun diabetes. Cin Exp Immunol. 2003;133:318-325.

10. Sun X, Yamada H, Shibata K, et al. CD30-ligand är ett mål för en ny biologisk terapi mot kolit-associerad med Th17-svar. J Immunol.2010;185:7671-7680.

11. Shinoda K, Sun X, Oyamada A, et al. Krav på CD30-uttryck på CD4 T-celler i patogenesen av experimentell autoimmun encefalomyelit.J Neuroimmunol.2016;291:39-45.

12. Wu X, Rosenbaum JT, Adamus G, et al. Aktivering av OX40 förlänger och förvärrar autoimmun experimentell uveit. Invest Ophthalmol Vs Sci. 2011;52:8520-8526.

13. Aristides RSS, He H, Westlake RM, et al. Costimulatory molecule OX40Lis kritisk för både Th1 och Th2 svar i allergisk inflammation. Eur J Immunol. 2002;32:2874-2880.

14. Saijo S, Asano M, Horai R, et al. Undertryckande av autoimmun artrit hos interleukin-1-deficienta möss där T-cellsaktivering är försämrad på grund av låga nivåer av CD40-ligand och OX40-uttryck på T-celler. Artrit Rheum. 2002;46:533-544.

15. Odobasic D, Ruth A, Oudin V, et al. OX40-ligand är hämmande under effektorfasen av crescentisk glomerulonefrit. Nephrol Dial Transplantation. 2019;34:429-441.

16. Caligaris-Cappio F, Bertero MT, Converso M, et al. Cirkulerande nivåer av lösligt CD30, en markör för celler som producerar cytokiner av Th2-typ, ökar hos patienter med systemisk lupus erythematosus och korrelerar med sjukdomsaktivitet. Clin Exp Rheumatol.1995;13:339-343.

17. Dong L, Hu S, Chen F, et al. Ökat uttryck av gangliosid GM1 i perifera CD4 plus T-celler korrelerar löslig form av CD30 hos patienter med systemisk lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol.2010;2010:569053. 18. Graham DSC, Graham RR, Manku H, et al. Polymorfism vid TNF-superfamiljgenen TNFSF4 ger känslighet för systemisk lupus erythematosus. Nat Genet. 2008;40:83-89.

19. Dolff S, Quandt D, Wilde B, et al. Ökat uttryck av samstimulerande markörer CD134 och CD80 på interleukin-17-producerande T-celler hos patienter med systemisk lupus erythematosus. Artrit Res Ther.2010;12:R150. 20. Aten J, Roos A, Claessen N, et al. Stark och selektiv glomerulär lokalisering av CD134-ligand och TNF-receptor -1 vid proliferativ lupusnefrit. J Am Soc Nephrol.2000;11:1426-1438.

21. Javaid B, Quigg RJ. Behandling av glomerulonefrit: Kommer vi någonsin att ha andra alternativ än steroider och cellgifter?NjureInt.2005;67:1692-1703. 22. Jefferson JA. Komplikationer av immunsuppression vid glomerulär sjukdom, Clin JAm Soc Nephrol, 2018:13:1264-1275.

23. Lechler R, Chai JG, Marelli-Berg F, et al. T-cellsenergins bidrag till perifer T-cellstolerans. Immunology.2001;103:262-269. 24. Riella LV, Sayegh MH. T-cells co-stimulerande blockad innjuretransplantation: tillbaka till bänken.NjureInt Suppl.2011;1:25-30. 25. Gauvreau GM, Boulet LP, Cockcroft DW, et al. OX40L blockad och allergeninducerade luftvägsresponser hos patienter med mild astma. Clin Exp Allergy.2014;44:29-37.

26. Nawaf MG, Ulvmar MH, Withers DR, et al. Samtidig OX40- och CD30-ligandblockad upphäver den CD4-drivna autoimmuniteten som är associerad med CTLA4- och PD1-blockad samtidigt som den bevarar utmärkt anti-CD8-tumörimmunitet. J Immunol.2017;199:974-981.

27. Eller K, Weber T, Pruenster M, et al. CCR7-brist förvärrar skadan vid akut nefrit på grund av avvikande lokalisering av regulatoriska T-celler.JAm Soc Nephrol.2010;21:42-52

28. Kurts C, Panzer U, Anders HJ, et al. Immunförsvaret ochnjuresjukdom: grundläggande begrepp och kliniska implikationer. Nat Rev Immunol. 2013;13:738-753.

29. Rosenkranz AR, Mendrick DL, Cothran RS, et al. P-selektinbrist förvärrar experimentell glomerulonefrit: en skyddande roll för endotelialt P-selektin vid inflammation. J Clin Invest.1999;103:649-659.

30. Wolf D, Hochegger K, Wolf AM, et al. CD4 plus CD25 plus regulatoriska T-celler hämmar experimentell anti-glomerulär basalmembran glomerulonefrit hos möss. J Am Soc Nephrol.2005;16:1360-1370. 31. Kitching AR, Holdsworth SR, Ploplis VA, et al. Plasminogen och

Plasminogenaktivatorer skyddar mot njurskada vid halvmånesk glomerulonefrit. J Exp Med. 1997;185:963-968.