Del 2 ERCC1-mutationer hindrar reparation av DNA-skador och orsakar lever- och njurdysfunktion hos patienter

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Klicka här för del 1

Del 2

Klicka till Cistanche NZ för njursjukdom

Diskussion

Ett nytt fall av bialleliskERCC1mutationer Endast två individer med bialleliskERCC1mutationer har rapporterats hittills, som båda visade CS-liknande egenskaper. Den svårast drabbade individen (165TOR) hade en nonsensvariant (Q158X) och en F231L missensevariant i (HhH)2-motivet av ERCC1 (Fig. S5 F), uppvisade tillväxthämning, utvecklingssvikt och kontrakturer och dog efter första levnadsåret på grund av lunginflammation (Jaspers et al., 2007). Den andra drabbade individen (CS20LO) hade kontrakturer, mikrocefali och hypertoni och var homozygot för F231L missense-varianten och dog under det andra levnadsåret (Kashiyama et al., 2013).

Vi rapporterar två syskon med bialleliskERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) och en noll-allel på grund av en moderärvd intragen deletion. Allt återstående ERCC1-protein som uttrycks i celler från dessa patienter bär R156W-aminosyrasubstitutionen, vilket stör en saltbrygga mellan den positivt laddade R156-resten och den motsatta negativt laddade D129-resten som ligger strax under den XPA-bindande fickan i den centrala domänen avERCC1. Effekten av denna substitution är tvåfaldig: (1) den minskar kraftigt den totala stabiliteten hos ERCC1 och dess bindningspartner XPF, och (2) den påverkar specifikt interaktionen med XPA (Fig. 9).

Minskade nukleära proteinnivåer av ERCC1 på grund av partiell felveckning

Western blöt och immunfluorescensanalyser visade att det övergripandeERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) i den endogenaERCC1lokus för RPE1-hTERT-celler. Intressant nog ledde fullständig förlust av ERCC1 hos möss till död inom 4 veckor, medan ökade proteinnivåer till cirka 15 procent av nivåerna i WT-möss ökade livslängden femfaldigt (Weeda et al., 1997), vilket tyder på att även låga nivåer av ERCC1 avsevärt öka potentialen för lönsamhet. I enlighet med våra fynd har tidigare studier visat att missense-mutationer i den centrala domänen avERCC1i allmänhet orsaka destabilisering (Sijbers et al., 1996b), vilket indikerar att denna region är viktig för proteinstabilitet.

Den nyligen rapporterade kryogena elektronmikroskopi strukturen av fullängdERCC1-XPF-heterodimer (Jones et al., 2020) avslöjar attERCC1R156återstoden är belägen på själva kanten av heterodimeren. Vi spekulerar i att den ökade bulkigheten och den förändrade elektroniska strukturen av substitutionen av ett arginin med tryptofan inte bara stör den XPA-bindande fickan utan också dimeriseringsgränssnittet mellan den centrala domänen av ERCC1 och nukleasdomänen av XPF, vilket orsakar allmän destabilisering (Fig. S5 F). Av intresse är missense-varianten XPFR799W belägen vid samma gränssnitt på XPF-sidan (Fig. S5 F) och resulterar också i destabilisering och kraftigt reducerade XPF-proteinnivåer (Mori et al., 2018). Hos en drabbad individ (CALIF1010) som uppvisade CS-liknande och segmentella progeroidegenskaper, ärvdes XPFR799W-varianten tillsammans med en intergen deletion i den andra XPF-allelen, vilket resulterade i en stark NER-defekt kombinerad med en mild ICL-reparationsdefekt (Mori et al. al., 2018), liknande de syskon som rapporterats i denna studie.

Ektopiskt uttryck av en inducerbar version avERCC1R156Wunder 24 timmar gjorde det möjligt för oss att nå WT-nivåer av detta mutanta protein, vilket resulterade i fellokalisering i cytoplasman, minskad interaktion med XPF och ökad interaktion med proteinvikande chaperoner, som upptäckts av MS. Alla dessa fynd ger stöd åt uppfattningen attERCC1R156Wär delvis felveckad och nedbruten i patientceller, vilket resulterar i en -80 procents minskning av ERCC1 nukleära proteinnivåer. KI av ERCC1R156W i RPE1-hTERT-celler stödjer denna slutsats.

När man jämförERCC1och XPF-proteinnivåer i PV46LD- och PV50LD-celler med de i celler från mer allvarligt drabbade individer (165TOR och CS20LO), noterade vi att dessa nivåer var jämförbara, eller kanske till och med lägre, i celler från syskonen som beskrivs i denna studie (Fig. 3) C och Fig. S3, E och F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Observera att CS20LO är homozygot för ERCC1F231L, medan 165TOR är heterozygot och har ett ytterligare för tidigt stopp på den andraERCC1allel (Q158X). Dessa fynd tyder på att förutom minskade proteinnivåer måste funktionaliteten hos det mutanta proteinet som fortfarande uttrycks och kombinationen av de två muterade allelerna tas i beaktande som en potentiell modulator av fenotypisk svårighetsgrad och uttrycksförmåga.

ERCC1R156W: Differentiell inverkan på ERCC1-beroende DNA-reparationsvägar

Uttryck av ERCC1R156W-GFP i ERCC1-KO-celler vid nivåer som liknar ERCC1WT gjorde det möjligt för oss att lösa inverkan av aminosyrasubstitutionen på proteinstabilitet från påverkan på proteinfunktionalitet. Medan det mutanta ERCC1R156W-proteinet var allvarligt försämrat i sin UV-inducerade interaktion med XPA och fisk och inte lyckades lokalisera effektivt till platser med UV-inducerade DNA-skador, upptäckte vi fortfarande avsevärd (~40 procent) reparationsaktivitet i UDS-analyser, klonogen överlevnad, och in vitro NER-analyser. Dessa fynd tyder på att ett mutant ERCC1-protein som endast interagerar mycket svagt med NER-komplexet fortfarande kan stödja avsevärda nivåer av NER-aktivitet (~40 procent) inuti celler. Tillsammans antyder dessa fynd att den låga uttrycksnivån för ERCC1 (~20 procent) i kombination med den kvarvarande GGR-aktiviteten hos mutantproteinerna som fortfarande uttrycks ger tillräckligt skydd för att förhindra PV46LD och PV50LD från att utveckla full-blown XP. Faktum är att kvarvarande GGR-aktivitet fortfarande detekterades under mer känsliga förhållanden i UDS-analyser jämfört med fibroblaster från en allvarligt drabbad och cancerbenägen XP-A-patient. Icke desto mindre kan båda patienterna fortfarande löpa risk att utveckla hudcancer, och skydd mot solljus rekommenderas därför. Den kvarvarande aktiviteten i PV46LD- och PV50LD-celler var antingen liknande eller lägre än reparationsaktiviteten vi upptäckt i 165TOR- eller CS20LO-celler (Fig. 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Den kliniska svårighetsgraden korrelerar därför inte med NER-aktivitet utan beror troligen på en roll för ERCC1 utanför NER som är viktig under utvecklingen.

Trots våra upptäckter att ERCC1R156W visade en minskad interaktion med SLX4 och också rekryterades mindre effektivt till platser för lokal ICL-induktion, visade ytterligare analys att ERCC1R156W-mutantproteinet endast var milt påverkat när det gäller att stödja ICL-reparation när det uttrycks ektopiskt i ERCC1- KO-celler. Effekten på ICL-reparation var dock mycket mildare än effekten av R156W-substitutionen på NER, vilket, i kombination med tidigare upptäckter att reparationen av ICL: er kräver mycket mindre ERCC1-protein än reparationen av NER-specifika DNA-lesioner (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), kan mycket väl förklara den milda inverkan på ICL-reparation. I patientfibroblaster, som har kraftigt reducerade nivåer av ERCC1, upptäckte vi måttlig känslighet, såväl som ökat kromosombrott vid exponering för den ICL-inducerande föreningen MMC, om än mycket mildare än celler från en FA-patient som inkluderades parallellt. Viktigt är att varken PV46LD eller PV50LD har visat några tydliga tecken på FA-liknande kliniska egenskaper, vilket tyder på att ERCC1R156W-mutantproteinet ger tillräckligt skydd mot den låga endogena ICL-belastningen hos dessa patienter.

ERCC1-brist orsakar lever- och njursvikt

Möss som är KO för antingen ERCC1 eller XPF för att visa allvarlig löpning (dvs mindre och svagare än WT-möss) och dör före de första fyra veckorna i livet på grund av allvarlig leversvikt (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). Leverspecifikt uttryck av ERCC1 i dessa möss korrigerade delvis den mindre storleken och förlängde livslängden upp till 12 veckor men demaskerade också allvarliganjurdysfunktionoch njursvikt som sekundär dödsorsak (Selfridge et al., 2001). KO-möss specifika för XP eller FA uppvisar inte leversjukdom, vilket tyder på att denna fenotyp inte orsakas av en NER- eller ICL-reparationsdefekt. Det är möjligt att partiell redundans mellan dessa två vägar, som går förlorad i ERCC1-KO-möss som saknar båda vägarna, kan förklara denna fenotyp. I linje med denna idé, hepatocyt ochnjure-proximala tubulicellerblev polyploida i ERCC1-KO-möss och ackumulerade höga nivåer av p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), vilket tyder på att ackumulering av endogen DNA-skada i dessa organ kan inträffa. Den exakta naturen hos denna endogena DNA-skada är dock fortfarande oklart.

Intressant nog visar möss med ledinaktivering av både NER- och ICL-reparation inte leverdysfunktion, vilket tyder på att redundans mellan dessa DNA-reparationsvägar inte är den enda förklaringen och att en ytterligare funktion av ERCC1-XPF utanför dessa DNA-reparationsvägar bidrar till nedsatt leverfunktion (Mulderrig och Garaycoechea, 2020). Det är möjligt att ERCC1-XPF är involverad i ytterligare DNA-reparationsvägar som hanterar endogen DNA-skada. Till exempel har ERCC1-XPF nyligen visat sig agera på alternativa DNA-strukturer, såsom Z-DNA, under vilka det samarbetar med reparationsproteiner som inte matchar varandra snarare än NER- eller ICL-reparationsfaktorer (McKinney et al., 2020). Dessutom visades ERCC1-XPF vara involverad i en delväg av basexcisionsreparation tillsammans med RECQ1-helikasen (Woodrick et al., 2017).

De två syskonen (PV46LD och PV50LD) i denna studie uppvisade en misslyckande, kortväxthet och brist på subkutant fett, vilket påminner om den lilla storlek som observerats hos ERCC1-KO-möss (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Dessutom utvecklade syskonen levernedsättningar med en övervägande kolestatisk bild som ledde till ortotopisk levertransplantation före 9 års ålder. Denna intervention förhindrade tydligt tidig död men förbättrade inte misslyckandet med att trivas, vilket framgår av tillväxt av vikt, längd och huvudomkrets efter transplantation långt under den tredje centilen.

Av intresse rapporterades kolestatisk leversjukdom som ett vanligt kännetecken hos egyptiska CS-patienter, vilket tyder på att detta bör övervakas noggrannare hos CS-patienter från annan etnisk bakgrund för att se om detta är ett vanligare drag än tidigare känt (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Även om inga leveravvikelser har beskrivits hos XP-patienter, finns det vissa fall av levercytolys (cellnedbrytning eller bristning) hos FA-patienter (Masserot-Lureau et al., 2012), vilket kan skilja sig från leveravvikelser som observerats i ERCC 1- bristfälliga syskon. Histologisk undersökning av en leverbiopsi från det äldre syskonen (PV50LD) avslöjade förändringar i hepatocytmorfologi med nukleär förstoring och variabilitet, som noterats i ERCC-1-deficienta möss (Fig. S1 D; N´uñez et al., 2000) ).

Den andra dödsorsaken i ERCC1-KO-möss med leverspecifikt uttryck av ERCC1 var allvarlignjursvikt(Selfridge et al., 2001). Båda syskonen uppvisar också njurdysfunktion, med drag som tyder på proximal tubulär dysfunktion som leder till progressivnjurenedsättning. Dock stabiliserades tubulär funktion efter levertransplantationen, mennjurefungerakräver kontinuerlig övervakning. Den renala fenotypen hos ERCC1- KO-möss – med dilaterade tubuli som innehåller läckt proteinhaltigt material som överensstämmer med en tubulopati (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) – är liknande till patienterna som beskrivs i vår studie. Dessutom har nedsatt njurfunktion och, i vissa fall, svikt rapporterats i kombinerad XP/CS (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) samt CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), medan ett samband mellan FA och strukturella anomalier injurehas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) som dog vid 37 års ålder (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Patienter med defekter i de interagerande nukleotidexcisionsreparationsproteinerna ERCC1 eller XPF visar xeroderma pigmentosum med sent inträdande allvarlig neurologisk degeneration [Abstract] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Även om ingen levernedsättning rapporterades, utvecklade denna patient allvarlig hjärnatrofi vid 15 års ålder, vilket utvecklades till progressiv neurodegeneration med demens. Mild hjärnatrofi har också noterats hos båda syskonen vid 13 och 11 års ålder, vilket tyder på att den neurologiska utvecklingen hos båda syskonen bör övervakas noggrant.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006) presenterade en fenotyp med viss överlappning med syskonen som rapporterats här, inklusive ljuskänslighet utan hudcancer, kortväxthet, brist på subkutant fett, utvecklingsförsening och njurinsufficiens (Niedernhofer et al., 2006). Till skillnad från syskonen som rapporterats här, visade den här pojken uttalade segmentella progeroidegenskaper, men en mycket mildare leverbild utan kolestas. Syskonen som rapporteras här visar att bialleliska ERCC1-mutationer kan orsaka ett spektrum av fenotyper, från det som vanligtvis ses i CS till en fenotyp som omfattar mildare kortväxthet, ljuskänslighet och svår lever- ochnjurenedsättning, potentiellt på grund av en kombinerad stark påverkan på NER och en samtidig påverkan på ICL-reparation, vilket särskilt kan påverka dessa organ.

Material och metoder

Alla procedurer som utförs i denna studie är i enlighet med de etiska standarderna och godkändes av Human Ethics Committee vid Royal Children's Hospital, Melbourne, Victoria, Australien (HREC36291C) och UK National Research Ethics Service Committee North East–Newcastle och North Tyneside 2. Patienter rekryterades till program för odiagnostiserade sjukdomar för pediatriska patienter med förmodade "föräldralösa" mendelska sjukdomar. Saliv eller blodprover från patienterna och deras familjemedlemmar samlades in för genomisk DNA-extraktion efter skriftligt informerat samtycke. Föräldrarna har gett tillstånd att visa oredagerade fotografier av de drabbade syskonen i fig. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T identifierades i båda de drabbade individerna i exon 4 av 8 av ERCC1-genen. Vid första förfrågning av exomdata hos båda de drabbade individerna verkade denna variant vara i ett homozygott tillstånd men var närvarande i ett heterozygott tillstånd hos fadern och frånvarande hos modern, vilket tyder på en möjlig deletion på moderns allel. Missense-varianten finns i gnomAD-databasen med en frekvens av 0,01 procent (22 heterozygoter, inga homozygoter) och har inte tidigare rapporterats hos drabbade individer. Missense-varianten har deponerats i LOVD-databasen (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 och http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) och ClinVar-databasen ( variant-ID: 978472).

Detektering av raderingen med qPCR

För att detektera deletionen extraherades genomiskt DNA från lymfocyter/epitelceller och den relevanta regionen av ERCC1-genen amplifierades i en qPCR. qPCR utfördes med hjälp av prober och specifika primrar (listade i tabell S1) utformade med hjälp av Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) och syntetiserade av Sigma-Aldrich. Primerna utformades för att inkludera den deleterade regionen i exon 4 och en region inom genen som inte är deleterad som en kontroll (exon 5). En multiplex qPCR med LightCycler R 480 Probes Master reaktionsblandning (Roche) utfördes enligt tillverkarens protokoll för att amplifiera och kvantifiera ERCC1-genregionen, med användning av CFTR-genen (exon 27) som en intern standard (tabell S1). qPCR utfördes på LightCycler R 480-instrumentet (Roche), och dataanalys utfördes med programvaran LightCycler R 480 version 1.5.0 (Roche). American College of Medical Genetics riktlinjer följdes för tolkning av sekvensvariation.

Detektering av missense-varianten genom Sanger-sekvensering

Genomiskt DNA isolerades genom att återsuspendera cellpellets i helcellslysatbuffert (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml gelatin, 0,45 procent Tween-20 och 0,45 procent NP-40) som innehåller 0,1 mg/ml Proteinas K (EO0491; ThermoFisher Scientific) och inkuberar i 1 h vid 56 grader följt av 10-min värmeinaktivering av Proteinas K vid 96 grader . Fragment på ~1 kb som spänner över missense-mutationerna PCR-amplifierades (sekvenseringsprimrar listas i tabell S1) följt av Sanger-sekvensering med användning av antingen framåt- eller bakåtprimern.

Cellinjer

Fibroblastcellinjer etablerades från hudbiopsier från både drabbade individer och föräldrar. Alla cellinjer (listade i tabell S2) odlades vid 37 grader i en atmosfär av 5 procent CO2-indium (Thermo Fisher Scientific) kompletterat med penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich) och 10 procent FBS (Bodinco BV). Alla cellinjer testades rutinmässigt för mykoplasmainfektion.

Fibroblast-immortalisering med hTERT

WT (48BR) och PV50LD fibroblasterna immortaliserades genom nukleofektion av p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) med användning av Amaxa Nucleofector (program U23). Varje elektroporering innehöll 400,000 fibroblaster och 2,5 µg plasmid-DNA. Efter elektroporering såddes celler i 25-cm2 vävnadsodlingskolvar innehållande 5 ml DMEM och 10 procent FBS. Efter 2 dagar ersattes odlingsmediet med ett medium innehållande 20 µg/ml neomycin.

/streptomycin (Sigma-Aldrich) och 10 procent FBS (Bodinco BV). Alla cellinjer testades rutinmässigt för mykoplasmainfektion.

Plasmidkonstruktioner

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>T-mutationer i ERCC1. Den överlappande PCR-produkten infogades som ett Nhel- och Agel-fragment för att generera plenty-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT och ERCC1R156W infogades som NheI- och AgeI-fragment i pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 för att generera pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPoch pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Platsstyrd mutagenes användes för att introducera punktmutationer i pMacro Bac-XPF-ERCC1WT med användning av KOD-plus mutageneskit (Toyobo) enligt beskrivningen i tillverkarens protokoll, med hjälp av primererna som anges i Tabell S1. Alla sekvenser verifierades genom Sanger-sekvensering.

Generering av KO-cell

linjer för att generera enstaka KO, U2OS(FRT) och RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO)-celler samtransfekterades med pLV-U6g-PPB som kodar för ett guide-RNA från Leiden University Medical Center/Sigma -Aldrich enkelguide RNA (sgRNA) bibliotek (se Tabell S3 för plasmider och Tabell S4 för sgRNA-sekvenser) som riktar in sig på ERCC1-genen tillsammans med en expressionsvektor som kodar för Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfekterade U2OS(FRT)-celler selekterades på puromycin (1 µg/ml) under 3 dagar och ströks ut vid låg densitet, varefter individuella kloner isolerades. Transfekterade RPE1-hTERT-celler FACS-sorterades på BFP/GFP och pläterades vid låg densitet, varefter individuella kloner isolerades. KO-kloner verifierades genom Western blot-analys. Frånvaron av Cas9-integrering/stabilt uttryck bekräftades med Western blot.

Generering av stabila cellinjer

En enda ERCC1 KO-klon i U2OS(FRT)-bakgrunden (se tabell S2) användes för att stabilt uttrycka ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP eller GFP-NLS genom samtransfektion av pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid som kodar för dessa cDNA (2 µg), tillsammans med pOG44-plasmid som kodar för Flp-rekombinaset (0,5 µg). En polyklonal cellpopulation erhölls efter selektion på 1 µg/ml puromycin och 4 µg/ml blasticidin S. Uttryck av de GFP-märkta ERCC1-proteinerna eller GFP-NLS inducerades genom tillsats av 2 µg/ml doxycyklin under 24 timmar.

Generering av KI-cellinjer

För att generera homozygota KI: er, behandlades RPE{0}}hTERT-celler först i 30 minuter med 1 µM DNA-PK-hämmare (NU7441) för att undertrycka felbenägen DSB-reparation och öka användningen av homologiberoende reparation. Därefter resuspenderades 350,000 celler i 20 µl nukleofektorbuffert (V4XP-3032; Lonza) i närvaro av 4,5 µg plasmid innehållande Cas9 och sgRNA riktad mot ERCC1-genen (se tabell S3 för plasmider och tabell S4 forsgRNA-sekvenser) och 100 µM enkelsträngat donator-DNA innehållande patientmutationen såväl som tysta mutationer för att förstöra PAM-stället för att förhindra omskärning av Cas9 och tysta mutationer för att introducera ett HindIII-restriktionsställe för att underlätta screening av KI-kloner. Celler elektroporerades med användning av anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) med EA-104-programmet. Efter elektroporering pläterades celler vid låg densitet i McCoy-medium med 10 procent FBS. Nästa dag ersattes mediet med DMEM (10 procent FBS och 1 procent penicillin/streptomycin), och celler fick bilda kolonier. Ungefär 400 kolonier isolerades och expanderades. Genomiskt DNA isolerades och ett fragment inklusive den införda mutationen och det införda restriktionsstället (HindIII) amplifierades med kapslad PCR (se tabell S1 för primrar). PCR-fragment digererades med Hindlll (NEB) i 3 timmar vid 37 grader och separerades sedan genom gelelektrofores. Klonerna som hade det införda HindIII-restriktionsstället analyserades genom Sanger-sekvensering (se tabell S1 för primrar). Vi erhöll två homozygota KI-kloner bland 400 isolerade kloner, vilket motsvarar en KI-effektivitet på ~0,5 procent.

Lentiviral transduktion

för lentiviral transduktion infogades mVenus-ERCC1WT eller mVenus ERCC1R156W i lentiviral vektor pLenti-CW57-TO. HEK293T transfekterades med vektorer som kodar för dessa ERCC1-fusioner, VSV-G, RRE och REV med hjälp av JetPEI (Sigma Aldrich) för att producera viruset. Den virusinnehållande supernatanten samlades upp efter 24 timmar och filtrerades med ett 0.44-µm-filter. Primära fibroblaster PV46LD och PV50LD transducerades lentiviralt i närvaro av polybren (Sigma-Aldrich). Celler selekterades med 15 ug/ml puromycin. Uttryck av de mVenus-märkta ERCC1-proteinerna inducerades genom tillsats av 2 µg/ml doxycyklin under 24 timmar.

Klonogena överlevnadsanalyser

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 celler poängsattes. Överlevnadsexperiment utfördes i duplikat och upprepades minst två gånger.

Immunutfällning för Co-IP

Celler skenbehandlades eller UV-C-bestrålades (20 J/m2) och skördades efter 1 timme. Cellpellets lyserades under 20 min på is i EBC-150-buffert (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 procent NP-40, 2 mM MgCl2 och proteashämmare cocktail [Roche]) kompletterad med 500 U/ml Benzonase Nuclease (Novagen). Cellysat inkuberades i 1,5 timmar vid 4 grader med GFP-Trap A-kulor (Chromotek). Pärlorna tvättades sedan sex gånger med EBC-150-buffert (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 procent NP-40, 1 mM EDTA och proteashämmarcocktail) och kokades i Laemmli-SDS provbuffert.

Western blot

Cellerna snurrades ner, tvättades med PBS och kokades i 10 min i Laemmli-buffert (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35 procent SDS, 16,5 procent glycerol, 0,0005 procent bromofenolblått och 0,05 M ditiotreitol). Proteiner separerades på 4 procent –12 procent Criterion XT Bis-Tris geler (#3450124; Bio-Rad) i NuPAGE MOPSrunning buffert (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) och blottades på polyvinylidenfluoridmembran (IPFL00010; EMD Millipore) ). Membranet blockerades med blockerande buffert (MB-070-003; Rockland) under 1 timme vid rumstemperatur. Membranet undersöktes sedan med antikroppar (anges i tabell S5) enligt anvisningarna. Ett Odyssey CLx-system (LI-COR Biosciences) användes för detektion.

RNA-återvinningsanalys (RRS)

30,000 celler såddes på 12-mm täckglas i 24-brunnsplattor i DMEM med 1 procent FBS. Efter 24 timmar bestrålades cellerna med UV-C i en dos av 6 J/m2 och inkuberades i ett konditionerat medium under olika tidsperioder ({{20}} timmar, 3 timmar och 18 timmar). Efter inkubation märktes begynnande transkript genom att inkubera cellerna med 400 µM 5-etynyluridin (CLK-N002-10; Jena Bioscience), som sedan visualiserades med en Click-iT-blandning bestående av 50 mM Tris-buffert, pH 8,0, 60 µM Atto-azid (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-askorbinsyra (A0278; Sigma-Aldrich) och 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) i 1 timme. Cellerna tvättades tre gånger under 5 minuter med PBS och monterades på objektglas (Thermo Fisher Scientific) med Aqua Polymount (Brunschwig).

Immunfluorescens

För immunofluorescerande färgning såddes 250,000 celler på 18-mm täckglas. Nästa dag fixerades cellerna med 4 procent paraformaldehyd, följt av permeabilisering med {{10}},5 procent Triton X-100 under 10 min. Celler behandlades med 100 glyciner i PBS under 10 minuter för att blockera oreagerade aldehydgrupper, sköljdes med PBS och jämviktades i tvättbuffert (PBS innehållande 0,5 procent BSA och 0,05 procent Tween-20; Sigma-Aldrich) i 10 minuter. Antikroppssteg och tvättar var i tvättbuffert. De primära antikropparna inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur, följt av sekundära antikroppar i 1 timme och DAPI i 5 minuter. Primära och sekundära antikroppar listas i Tabell S5. Celler inkuberades med 0,1 µg/ml DAPI och monterades med Aqua Polymount.

H2AX-färgning

200,000 celler såddes på 18-mm täckglas i 24-brunnsplattor med DMEM (10 procent FBS och 1 procent P/S). Nästa dag exponerades cellerna för IR av YXlon International röntgengenerator (200 KV, 4 mA; doshastighet 2 Gy/min). Vid de angivna tidpunkterna fixerades cellerna med 3 procent paraformaldehyd i PBS under 10 minuter och färgades för H2AX under 1 timme (se ovan). Bilder kvantifierades med hjälp av ett specialbyggt makro i ImageJ som möjliggjorde automatisk och objektiv analys av antalet foci per cell, som beskrivits tidigare (Typas et al., 2015).

Mikroskopisk analys av fixerade celler

Bilder av fixerade prover togs på ett Zeiss AxioImagerM2 eller D2 bredfältsfluorescensmikroskop utrustat med 63× PLAN APO (1,4 numerisk apertur [NA]) oljedoppningsobjektiv (Zeiss) och en HXP 120 metallhalogenlampa som används för excitation. Fluorescerande sonder detekterades med hjälp av följande filter för DAPI (excitationsfilter: 350/50 nm; dikroisk spegel: 400 nm; emissionsfilter: 460/50 nm), Alexa 555 (excitationsfilter: 545/25 nm; dikroisk spegel: dichroisk spegel: 565 nm ; emissionsfilter: 605/70 nm), eller Alexa 647 (excitationsfilter: 640/30 nm; dikroisk spegel: 660 nm; emissionsfilter: 690/50 nm). Bilderna spelades in med ZEN 2012-programvaran och analyserades i ImageJ.

UV-laser mikrobestrålning

Celler odlades på 18-mm kvarts (UV-C) eller glas (UV-A) täckglas och placerades i en Chamlide CMB magnetisk kammare där tillväxtmediet ersattes av CO2-oberoende Leibovitz L{ {4}} medium (Thermo Fisher Scientific). UV-C-laserspår gjordes med hjälp av en diodpumpad halvledar- 266-mm yttriumaluminiumgranatlaser (medeleffekt 5 mW, repetitionshastighet upp till 10 kHz och pulslängd 1 ns). Före UV-Amicro-bestrålning sensibiliserades celler antingen med 6 µM trioxsalen under 1 timme för att generera ICL eller med 15 µM BrdU under 24 timmar för att generera DSB. UV-A-laserspår gjordes av en diodpumpad halvledar-355-nm Yttrium Aluminium Granat-laser (medeleffekt 14 mW och repetitionshastighet upp till 200 Hz). Båda lasrarna integrerades i ett UGA-42-Caliburn/2L Spot Illumination-system (Rapp OptoElectronic).

Mikrobestrålning kombinerades med levande cellavbildning i en miljökammare inställd på 37 grader på ett helt kvarts vidfältsfluorescensmikroskop av Zeiss Axio Observer 7, med användning av ett 100× (1,2NA) ultrafilter glycerol-immersionsobjektiv (UV-C) ) eller ett Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) oljenedsänkningsobjektiv (UV-A). Lasersystemet är kopplat till mikroskopet via en TriggerBox och ett filter med neutral densitet (ND-1) blockerar 90 procent av laserljuset. AnHXP 120-V metallhalogenlampa användes för excitation. Bilder förvärvades i Zeiss ZEN och kvantifierades i ImageJ.

Kromosombrottsanalys

2 × 1{{20}}6 fibroblaster såddes i 175-cm2 vävnadsodlingsflaskor med DMEM (10 procent FBS) och odlades vid 37 grader i närvaro eller frånvaro av 50 nM MMC. Efter 48 timmar sattes 600 µl demecolcin (10 µg/µl) till varje odlingskolv, och cellerna inkuberades under ytterligare 30 minuter vid 37 grader för att berika metafaserna. Celler trypsiniserades sedan och återsuspenderades i 75 mM KCL och inkuberades i 20 minuter vid rumstemperatur. Cellerna snurrades ner, återsuspenderades i 10 ml fixativ (75 procent metanol och 25 procent ättiksyra), inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur och centrifugerades. Pellets återsuspenderades i 10 ml fixativ och inkuberades under 5 minuter vid rumstemperatur. Detta steg upprepades och slutligen återsuspenderades pelleten i 0,5–1,0 ml fixativ. Cellsuspensionen droppades på ett objektglas och fick torka. Objektglasen färgades under 5 minuter i en 3-procentig Giemsa-lösning, sköljdes i kranvatten och fick torka. Objektglasen kodades och från varje kodad kultur undersöktes 50 metafaser med avseende på kromosomskador. Efter poängsättning avkodades objektglasen och resultaten analyserades enligt presentationen (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 celler såddes på 18-mm täckglas i 12-brunnsplattor i DMEM med 1 procent FBS. Efter 24 timmar bestrålades celler lokalt genom ett 5-µm filter med 30 J/m2 UV-C. Celler pulsmärktes därefter med 20 µM EdU (VWR) och 1 µM 5-fluoro-deoxiuridin (Sigma-Aldrich) i antingen 1 timme eller 4 timmar. Efter märkning, medium jagades celler med 10 µM tymidin i DMEM utan tillskott under 30 minuter och fixerades i 15 minuter med 3,7 procent formaldehyd i PBS. Celler permeabiliserades i 20 minuter i PBS med 0,5 procent Triton-X100 och blockerades i 3 procent BSA (Thermo Fisher Scientific) i PBS. Den inbyggda EdU kopplades till Attoazide Alexa Fluor 647 med Click-iT kemi enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen). Efter koppling efterfixerades cellerna med 2 procent formaldehyd under 10 minuter och blockerades därefter med 100 mM glycin. DNA denaturerades med 0,5 M NaOH under 5 minuter, följt av blockering med 10 procent BSA under 15 minuter. Därefter inkuberades cellerna med en antikropp mot cyklobutan-pyrimidindimerer (se tabell S5) i 2 timmar, följt av sekundära antikroppar i 1 timme och DAPI i 5 minuter. Celler monterades i Polymount (Brunschwig).

MS datainsamling

MS utfördes i huvudsak som tidigare beskrivits (Salas Lloret et al., 2019). Alla experimenten utfördes på ett EASY-nLC 1000-system (Proxeon) kopplat till en Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) genom en nanoelektrosprayjonkälla. Q-Exactive kopplades till en 25-cm kiseldioxidsändare (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) internt packad med 1,9 µm C18-AQ-kulor (Reprospher) -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Tyskland). Prover kördes i en 40-min kromatografigradient från 0 procent till 30 procent acetonitril och ökades sedan till 95 procent acetonitril före återjämvikt i kolonnen med en flödeshastighet på 200 NL/min. Masspektrometern drevs i ett databeroende insamlingsläge med en topp-sju metod och ett skanningsområde på 300–1 600 m/z. Full-scan MS-spektra förvärvades vid ett målvärde på 3 × 106 och en upplösning på 70,000, och de högre kollisionsdissociationstandemmasspektra (MS/MS) registrerades vid ett målvärde på 105, och med en upplösning på 35 000, ett isoleringsfönster på 2,2 m/z och normaliserad kollisionsenergi på 25 procent. Minsta mål för automatisk förstärkningsreglering var 104. De maximala MS1- och MS2-injektionstiderna var 250 respektive 120 ms. Prekursorjonmassorna av skannade joner uteslöts dynamiskt från MS/MS-analys i 30 s. Joner med laddning 1 och högre än 6 exkluderades från att utlösa MS2-analys.

MS-dataanalys All rådata analyserades med MaxQuant (version 1.6.6.0) som beskrivits tidigare (Tyanova et al., 2016a). Vi utförde sökningen mot ett i silico-smält UniProt-referensproteom för Homo sapiens, inklusive kanoniska och isoformsekvenser (27 maj, 2019). Databassökningar utfördes enligt standardinställningar med följande modifieringar. Digestion med trypsin/P användes, vilket medgav fyra missade klyvningar. Oxidation (M) och acetyl (protein N-term) tillåts som variabla modifieringar med ett maximalt antal av tre. Karbamido-metyl (C) inaktiverades som en fast modifiering. Etikettfri kvantifiering (LFQ) aktiverades, vilket inte tillåter snabb LFQ. Max-Quant-utdata bearbetades ytterligare med hjälp av Perseus beräkningsplattform (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). LFQ-intensitetsvärden log2-transformerades och potentiella föroreningar och proteiner identifierade av endast plats eller omvända peptider avlägsnades. Prover grupperades i experimentkategorier och proteiner som inte identifierades i fyra av fyra replikat i minst en grupp togs också bort. Saknade värden tillräknades med normalfördelade värden med en 1,8 nedväxling (log2) och en randomiserad 0,3 bredd (log2) med hänsyn till hela matrisvärden. Statistisk analys (t-tester) utfördes för att bestämma vilka proteiner som var signifikant berikade. Vulkanplottar genererades och utdatatabeller för statistisk analys bearbetades ytterligare i Microsoft Excel. MS proteomikdata har deponerats till ProteomeXchange Consortium via PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) partnerförråd med datauppsättningsidentifieraren PXD017940.

Rening av rekombinant ERCC1-XPF

Baculovirusproduktion utfördes enligt beskrivningen med användning av pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA-konstruktionerna (Enzlin och Sch¨arer, 2002). ERCC1WT och ERCC1R156W samuttrycktes med XPFWT från ett enda baculovirus i Sf9-insektsceller. Heterodimererna renades över nickelaffinitet, storleksuteslutning och heparinkromatografi enligt beskrivning (Enzlin och Sch¨arer, 2002). ERCC1-XPF eluerades från heparinkolonnen vid cirka 600 mM NaCl. Proteinkoncentrationer varierade från 0,1 till 0,2 mg/ml.

Nukleasanalys

Ett stam-loop-substrat (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) innehållande fluorescerande färgämne Cy5 (50 pmol) vid 39 ändar (IDT) glödgades i en 100-µl härdningsbuffert (10 mM Tris, pH 7,5 och 50 mM NaCl) genom att värma till 95 grader i 5 minuter och långsamt kyla ned under en period av 2 timmar. 200 fmol glödgat substrat användes i 20-µl reaktioner innehållande 25 mM HEPES, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10 procent glycerol, 0,5 mM -merkaptoetanol, 0,1 mg/ml BSA, 40 mM NaCl och 0–40 nM protein. Reaktionerna inkuberades vid 30 grader under 30 minuter och stoppades genom tillsats av 10 ul 90 procent formamid/10 mM EDTA. Efter uppvärmning vid 95 grader i 5 minuter och kylning på is, laddades 15 µl av varje prov på en 15 procentig denaturerande polyakrylamidgel. Geler kördes vid 30 mA i 30 minuter och band visualiserades genom fluorescens av Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

In vitro NER-analys

XPF-deficienta (XP2YO) cellextrakt och plasmiden innehållande platsspecifik dG-AAF lesion genererades som tidigare beskrivits (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . För varje reaktion, 2 µl reparationsbuffert (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfokreatin och 1,8 mg /ml BSA, slutligt pH 7,8), 0,2 µl kreatinfosfokinasbuffert (2,5 mg/ml kreatinfosfokinas från kaninmuskel [Sigma Aldrich], 10 mM glycin, pH 9,0 och 50 procent glycerol), 3 µl cell-XF-brist extrakt, NaCl (till en slutlig koncentration av 70 mM) och renade ERCC1-XPF-proteiner i en total volym av 9 µl förvärmdes vid 30 grader i 10 minuter. 1 pl plasmid innehållande dG-AAF (50 ng/ul) sattes till varje reaktion, och reaktionerna inkuberades vid 30 grader under 45 min. Reaktionsblandningen kyldes sedan på is under 5 minuter, följt av tillsats av 0,5 µl av 1 µM komplementär sträng d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC), och reaktionsblandningen denaturerades genom upphettning vid 95 grader i 5 minuter. Efter 15 minuters hybridisering vid rumstemperatur tillsattes 1 µl sekvensblandning (innehållande 0,13 U sekvens och 2,0 µCi [-32P] dCTP för varje reaktion). Efter förinkubation vid 37 grader under 3 minuter tillsattes 1,2 µl deoxiribonukleotidtrifosfatblandning (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP och 100 µM dGTP). Reaktionsblandningen inkuberades vid 37 grader under 12 minuter och reaktionen stoppades genom tillsats av 8 ul laddningsfärgämne (80 procent formamid och 10 mM EDTA). Prover upphettades vid 95 grader i 5 minuter, kyldes på is och laddades på en 14% denaturerande polyakrylamidgel. Geler kördes vid 45 W i 2,5 timmar och band visualiserades med användning av en PhosphorImager (Typhoon RGB).

Kompletterande material online

Fig. S1 visar laboratorievärden av lever- och njurfunktioner hos syskon 1 och syskon 2. Fig. S2 visar genomisk sekvenseringsdata som bekräftar missense-mutationen och den intragena deletionen i ERCC1-genen. Fig. S3 visar proteinuttrycket av ERCC1 och XPF i patientfibroblaster. Fig. S4 visar renade rekombinanta ERCC1- och XPF-proteiner och Co-IP av ERCC1WT och ERCC1R156W. Fig. S5 visar mikroskopibilder av UDS, H2AX-foci och platsen för patientmutationer i ERCC1-XPF. Tabell S1 innehåller sekvenserna för alla primrar och prober som används i denna studie. Tabell S2 listar alla cellinjer som testats i denna studie. Tabell S3 listar alla plasmider som är involverade i denna studie. Tabell S4 visar studiens sgRNA-sekvenser och Tabell S5 visar antikropparna. Tabell S6 visar antalet celler som används för kvantifiering i figurerna. Data S1 visar alla obeskärda Western blot-filer.

Erkännanden

Författarna tackar både syskon och deras föräldrar för att de har bidragit till denna artikel, Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Nederländerna) för den lentivirala expressionsvektorn thepLenti-CW57-TO-GFP och råd om generering av KI celler, Joachim Goedhart (University of Amsterdam, Amsterdam, Nederländerna) för mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Nederländerna) för DNA-PK-hämmaren, Wim Vermeulen och Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Nederländerna) för att tillhandahålla 165TOR-celler, Tomoo Ogi (University of Nagoya, Japan) för att tillhandahålla CS20LO-celler, Alan Lehman (University of Sussex, Storbritannien) för att tillhandahålla CSL16NG och CSL16NG hTERT-celler, och Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Nederländerna) för råd om generering av KI-celler .

Detta arbete finansierades av ett Leiden University Medical CenterResearch Fellowship och ett Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI-anslag (ALW.016.161.320) till MSLuijsterburg, ett startanslag från Europeiska forskningsrådet (310913) till ACO Vertegaal, ett KWF Kankerbestrijding YoungInvestigator-anslag ( 11367) till R. Gonz´alez-Prieto, ett KWF Kan kerbestrijding-anslag (VU 2013-5983) till MA Rooimans, och anslag från Korean Institute for Basic Science (IBS-R022-A1) och National Cancerinstitutet (P01CA092584) till ODSch arer.

Författarbidrag: K. Apelt genererade KO-celler, KI-celler och stabila cellinjer; utförde Western blot och immunfärgningar för ERCC1 och XPF uttryck, lentivirala transduktioner, klonogena överlevnad (UV, MMC, IR), Co-IP experiment för Western blot analys, UDS experiment, Co-IP experiment för MS och H2AX färgningar; och skrev tidningen. A. Kragten utförde UDS, RRS och immunfärgningar efter lokal UV. AP Wonder gem genererade KO- och KI-celler och utförde UDS-experiment, Western blot och Sanger-sekvensering för att bekräfta missense-mutationen. SM White gav rådgivning till patienterna, analyserade exomdata, utförde biopsier, genererade primära fibroblaster och skrev den kliniska patientbeskrivningen. S. Lunke och BT Wilson genererade NGS-data. S. Pantaleo och D. Flanagan utförde qPCR för att validera borttagningen. C.Quinlan skrev den kliniska beskrivningen av njuren. W. Hardikar skrev den kliniska beskrivningen av levern. MA Rooimans och R.MF Wolthuis genererade hTERT-immortaliserade 48BR- och PV50LD-fibroblaster och utförde de MMC-inducerade kromosombrytningsanalyserna. R. Gonzalez-Prieto och ACO Vertegaal analyserade alla MS-experiment. WW Wiegant och H. vanadium utförde klonogena överlevnad i U2OS-celler (IR). J.-E.Yeo och HS Kim renade rekombinanta proteiner och utförde nukleasanalysen och NER-analyserna in vitro. OD Sch¨arers övervakade in vitro NER-arbete bidrog till den strukturella tolkningen av R156W-allelen och redigerade tidningen. MS Luij sterburg övervakade projektet och skrev uppsatsen.

Referenser

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky och SM Elsayed. 2011. Kolestas hos patienter med Cockayne syndrom och föreslagna modifierade kriterier för klinisk diagnos. OrphanetJ. Rare Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown och PJ McHugh. 2017. RPA aktiverar XPF-ERCC1-endonukleaset för att initiera bearbetningen av DNA-intersträng-tvärbindningar. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson och RS Nairn. 2000. Roll av ERCC1 i avlägsnandet av långa icke-homologa svansar under riktad homolog rekombination. EMBO J. 19:5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers och LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-XPF-endonukleas underlättar reparation av DNA-dubbelsträngsbrott. Mol. Cell. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. Fellokalisering av XPF-ERCC1-nukleas bidrar till minskad DNA-reparation hos XP-F-patienter. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Fanconi-anemi och dess diagnos. Mutat. Res. 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa och N. Tebib. 2017. Njurengagemang hos 2 syskon med Cockayne syndrom. Iran. J. Kidney Dis. 11:253–255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski och RD Wood. 1993. Samkorrigering av ERCC1, ERCC4 och xeroderma pigmentosum grupp F DNA-reparationsdefekter in vitro. EMBO J. 12:3685–3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol et al. 2013. Mutationer i ERCC4, som kodar för DNA-reparationsendonukleaset XPF, orsakar Fanconi-anemi. Am. J. Hum. Genet. 92:800–806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi och AD D'Andrea. 2016. Fanconis anemiväg: nya spelare och nya funktioner. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers och JH Hoeijmakers. 1998a. DNA-strukturelement som krävs för ERCC1-XPF-endonukleasaktivitet. J. Biol. Chem. 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers och JH Hoeijmakers. 1998b. Kartläggning av interaktionsdomäner mellan humana reparationsproteiner ERCC1 och XPF. Nucleic Acids Res. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg och SJ Verbeek. 1995. Ökad känslighet för ultraviolett-B och cancerframkallande ämnen hos möss som saknar DNA-excisionsreparationsgenen XPA. Natur. 377:169–173.

DiGiovanna, JJ och KH Kraemer. 2012. Lyser på xeroderma pigmentosum. J. Invest. Dermatol. 132:785–796.

Enzlin, JH och OD Schrer. 2002. Det aktiva stället för DNA-reparationsendonukleaset XPF-ERCC1 bildar ett mycket konserverat nukleasmotiv. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada och H. Kitamura. 2006. Cockaynes syndrom med återkommande akut tubulointerstitiell nefrit. Patol. Int. 56:678–682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer och OD Schrer. 2005. Platsspecifik inkorporering av N-(deoxiguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluoren (dG-AAF) i oligonukleotider med hjälp av modifierad "ultra-mild" DNA-syntes. Nucleic Acids Res. 33:1961–1969.

Gregg, SQ, AR Robinson och LJ Niedernhofer. 2011. Fysiologiska konsekvenser av defekter i ERCC1-XPF DNA-reparationsendonukleas. DNA-reparation (Amst.). 10:781–791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. 2015. XRCC4-brist hos människor orsakar en markant neurologisk fenotyp men ingen uppenbar immunbrist. J. Allergy Clin. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et al. 2020. Förlust av ZBTB24 försämrar icke-homolog ändfogning och klassväxlingsrekombination hos patienter med ICF-syndrom. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeijmakers och W. Vermeulen. 1999. Verkan av DNA-reparationsendonukleas ERCC1/XPF i levande celler. Vetenskap. 284:958–961. h

vetenskap.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers och W. Vermeulen. 2007. Den första rapporterade patienten med human ERCC1-brist har cerebro-oculofacio-skelettsyndrom med en mild defekt i reparation av nukleotidexcision och allvarlig utvecklingssvikt. Am. J. Hum. Genet. 80:457–466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald och F. Arwert. 1997. Bevis för minst åtta Fanconi-anemigener. Am. J. Hum. Genet. 61:940–944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch och NQ McDonald. 2020. Cryo-EM-strukturer av XPF-ERCC1-endonukleaset avslöjar hur DNA-kopplingsingrepp stör en autohämmad konformation. Nat. Commun. 11:1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau och VA Bohr. 2017. Cockayne syndrom: Kliniska egenskaper, modellsystem och vägar. Åldrande Res. Upp. 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. Felfunktion av nukleas ERCC1-XPF resulterar i olika kliniska manifestationer och orsakar Cockaynes syndrom, xeroderma pigmentosum och Fanconi-anemi. Am. J. Hum. Genet. 92:807–819.