Del 3: Echinacoside isolerad från Cistanche Tubulosa stimulerar förmodat utsöndring av tillväxthormon via aktivering av ghrelinreceptorn
Mar 06, 2022
Echinakosid isolerad från Cistanche tubulosa Stimulerar förmodat utsöndring av tillväxthormon via aktivering av ghrelinreceptorn
Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* och Jason TC Tzen 1,*
1 Graduate Institute of Biotechnology, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)
2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw
3 Institutionen för veterinärmedicin, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw
4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan
* Korrespondens: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (anknytning 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)
Akademisk redaktör: Pinarosa Avato
Mottaget: 22 januari 2019; Godkänd: 14 februari 2019; Publicerad: 17 februari 2019
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrakt:Cistanchearter, öknens ginseng, har registrerats ha många biologiska aktiviteter i traditionell kinesisk farmakopé och har använts som anti-aging medicin. Tre fenyletanoidglykosider—echinakosid, tubulosid A och acteosid—detekterades i vattenextraktet avCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight och huvudbeståndsdelen,echinakosid, renades ytterligare.Echinacosidemed en koncentration högre än 10_6 M visade signifikant aktivitet för att stimulera utsöndring av tillväxthormon från hypofysceller från råtta. I likhet med tillväxthormonfrisättande hormon-6, en syntetisk analog av ghrelin, hämmades stimuleringen av tillväxthormonutsöndring av echinakosid av [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substans P , en omvänd agonist av ghrelinreceptorn. Molekylär modellering visade att alla tre fenyletanoidglykosiderna interagerade adekvat med bindningsfickan hos ghrelinreceptorn, och echinakosid visade en något bättre interaktion med receptorn än tubulosid A och acteosid. Resultaten tyder på att fenyletanoidglykosider, särskilt echinakosid, är aktiva beståndsdelar som förmodligen är ansvariga för anti-aging effekterna av C. tubulosa och kan anses utvecklas som icke-peptidylanaloger av ghrelin.
Nyckelord: cistanchetubulosa;echinakosid; ghrelin; utsöndring av tillväxthormon;fenyletanoidglykosider
echinakosidicistanchehar många effekter
Snälla klicka här till del 2
4. Material och metoder
4.1. Kemikalier och växtmaterial
Cistanchedeserticola YC Ma erhölls från en lokal marknad och autentiserades av Dr. Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight köptes från Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Kina). Acetonitril, myrsyra och metanol av HPLC-kvalitet köptes från ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), dialyserat fetalt bovint serum (DFBS) och Trypsin-EDTA köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNase I köptes från Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Tillväxthormonfrisättande hormon-6 (GHRP-6) erhölls från Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Kollagenas typ I och [D-Argl, D-Phe5, D-Trp7,9, Leull]-substans P köptes från Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Råtttillväxthormon ELISA-kit köptes från Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Kina).
4.2. HPLC/UV- och LC_MSn-analyser av vattenextraktionen av Cistanche spp.
Torkad stjälk (25 g) avCistanchedeserticola YC Ma ellerCistanchetubulosa (Schenk) R extraherades tre gånger med 500 ml destillerat vatten under 60 minuter vid 50 grader i ett vattenbad. Lösningen filtrerades genom ett 13 mm syriskt filter med 0,45 um PP-membranfilter (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) och utsattes för följande analyser. De kemiska beståndsdelarna i extrakten analyserades
med användning av en Syncronis C18-kolonn (4,6 × 250 mm innerdiameter, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i HPLC-systemet kopplat till en modell 600E fotodiodmatrisdetektor (Waters Corporation,
Milford, MA, USA). Den mobila fasen bestod av (A) vatten innehållande {{0}},1 procent myrsyra och (B) acetonitril. Elueringsgradienten var som följer: 0–60 min, linjär gradient från 14 procent B; 0–3 min, 14 procent till 17 procent B; 3–4 min, 17 procent B; 4–15 min, 17 procent till 20 procent B; 15–20 min, 20 procent B; 20–50 min, 20 procent till 14 procent B; 50–60
min, 14 procent B. Den ultravioletta (UV) absorbansdetektionsvåglängden sattes till 330 nm. En linjär fälla kvadrupol (LTQ) tandem masspektrometer (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) utrustad med elektrosprayjonisering (ESI) gränssnitt var ansluten till ett Surveyor LC-system (Thermo Electron)
med en 5 uL provslinga. Elueringsgradienten var som följer: 0–90 min, linjär gradient från 14 procent B; 0–24 min, 14 procent till 17 procent B; 24–25 min, 17 procent B; 25–36 min, 17 procent till 20 procent B; 36–37 min, 20 procent B; 37–80 min,
20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 procent) som kollisionsgas.
4.3. Isolering av Echinacoside
Vattenextraktet från den torkade stjälken (25 g) av C. tubulosa koncentrerades under reducerat tryck för att ge djupbrun sirap. Råextraktionen suspenderades med destillerat vatten och lyofiliserades med en frystork. Pulvret på 100 mg löstes i destillerat vatten på 5 ml och utsattes för rening med användning av Sephadex LH-20-kolonn (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sverige) eluerad med 10 procent vattenhaltig metanollösning och övervakad med HPLC . Fraktionerna innehållande echinakosid detekterades genom avläsning av absorbansen vid 245 nm och skördades med användning av en autosampler.
4.4. Djur
Experimenten godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid National Chung_Hsing University med godkännandenumret för IACUC 106-079. Sprague_Dawley-hanråttor som vägde 250_300 g köptes från BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Två djur per bur hölls i en kontrollerad miljö med 23 o2, 60 o 10 procent luftfuktighet och en 12 timmars ljus/mörkercykel. Råttorna matades med en standardfoderdiet (kalorier tillhandahålls
med 28,7 procent protein, 13,4 procent fett och 57,9 procent kolhydrater, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) och destillerat vatten ad libitum.
4.5. Primär hypofyscellodling
Hypofysceller isolerades enligt en modifierad enzymatisk dispersionsmetod utvecklad av Yamazaki et al. [29]. Kortfattat bedövades Sprague Dawley-hanråttor med Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Frankrike), och de främre hypofysen togs bort och dispergerades för att odla hypofysceller i suspension, som beskrivits tidigare [30].
4.6. Tillväxthormonsekretionsanalys
De primära främre hypofyscellerna på 4 × 104 celler/brunn odlades vid 37 grader under 5 procent CO2 i 2 dagar före analysen av utsöndring av tillväxthormon enligt protokollet som beskrivits tidigare [30].
Efter avlägsnandet av odlingsmediet svaltades cellerna i serumfritt Dulbeccos Modifierade Eagles medium (DMEM) i 90 minuter för att stabilisera basal hormonutsöndring. Svältmediet ersattes med färskt DMEM innehållande echinakosid (från 10_8 till 10_5 M) eller GHRP-6 (en agonist av en human ghrelinreceptor, GHSR, 10_7 M) som en positiv kontroll, och cellerna inkuberades under 15 och 30 minuter vid 37 grader under 5 procent CO2. För detektion av antagonisteffekt inkuberades cellerna med en GHSR
invers agonist, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substans P (0.5 uM), och behandlas sedan med DMEM innehållande echinacoside (10_5 M) eller GHRP-6 (10_7 M) i 30 min. Mediet uppsamlades för
bestämning av utsöndring av tillväxthormon genom ett ELISA-kit för tillväxthormon från råtta (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).
4.7. Statistisk analys
Data presenterades som medelvärden o SD. Skillnaderna analyserades med T-Test. Statistiska beräkningar utfördes av GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). En nivå på p < 0.05="" ansågs="" vara="" statistiskt="">
4.8. Homologimodellering och dockning
Homologimodellering och dockning till en human ghrelinreceptor, tillväxthormonsekretagogreceptor (GHSR, accessionsnummer AAI13548), etablerades genom att följa vår tidigare konstruktion [21,24]. Kortfattat användes kristallstrukturer av 1 och 2 adrenerga receptorer (PDB 2YCY och 3PDS) med bundna ligander, cyanopindolol och FAUC50 som mallar för att konstruera GHSR-strukturen [31,32]. GHSR-strukturen med den lägsta totala PDF-energin valdes för ytterligare dockning med GHRP-6, echinacoside, tubulosid A och acteosid. Alla modelleringsprocesser utfördes med Discovery Studio 2.1-plattformen (http://accelrys.com/).
3D-strukturen för GHRP-6 laddades ner från Pub-Chems sammansatta databas på NCBI:s webbplats (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3D-strukturerna för echinakosid, tubulosid A och akteosid byggdes med programmet Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Det ligandbindande stället för GHSR definierades som det sfäriska utrymmet med en radie på 14 Å från mitten av bindningsfickan i dockningssimuleringen. Dockning av GHRP-6, echinakosid, tubulosid A eller acteosid till bindningsstället för GHSR utfördes i silico genom att använda LibDock-modulen i Discover Studio 2.1-paketet och minimerades ytterligare genom smart minimeringsalgoritm med CHARMm kraftfält i Upptäck Studio 2.1-paketet [33]. För att jämföra de relativa bindningsaffiniteterna för echinakosid, tubulosid A och acteosid i GHSR, användes det aktiva centrumområdet konstruerat med GHRP-6 i GHSR för dockningen, och bindningsenergin beräknades av GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , National Chiao Tung University, Taiwan).
Författarbidrag: Djurförsök, C.-JW, Y.-CL och W.-YC; Identifiering och rening: MY.C., N.-HL och C.-HC; Molekylär modellering: C.-JW, Y.-CL och JTCT; Projektdesign och skrivande: C.-HC och JTCT
Finansiering: Arbetet stöddes delvis av ett bidrag till Jason TC Tzen från National Chung-Hsing University (NCHU-102D604).
Tack: Författarna tackar Tian-Shun Weng för att han delade med sig av sin yrkeserfarenhet av användningen av Cistanche-arter.
Intressekonflikter: Alla författare förklarar inga intressekonflikter.
Referenser
1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": En recension. Am. J. Chin. Med. 2012,40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]
2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa etanolextrakt förmedlar könshormonnivåer från råtta genom induktion av testikelsteroidogena enzymer. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Molekylära vägar relaterade till livslängdsfrämjande och kognitiv förbättring av Cistanche tubulosa i Drosophila. Fytomedicin 2017, 26, 37–44. [CrossRef]
4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Reversering av vattenhaltiga extrakt av Cistanche tubulosa från beteendemässiga brister i Alzheimers sjukdomsliknande råttmodell: Relevans för amyloidavlagring och central neurotransmittorfunktion. BMC-komplement. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]
5. Xuan, GD; Liu, CQ Forskning om effekten av fenyletanoidglykosider (PEG) av Cistanche deserticola på anti-aging hos åldrade möss inducerade av D-galaktos. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]
6. Jiang, Y.; Tu, PF Analys av kemiska beståndsdelar i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche totala glykosider på inflytandet av vaskulära demensråttors inlärning och minne och mekanismforskning. Haka. Ört. Med. 2005, 36, 1852–1855.
8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacoside främjar benregenerering genom att öka OPG/RANKL-förhållandet i MC3T3-E1-celler. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]
9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH De hypokolesterolemiska effekterna av Cistanche tubulosa-extrakt, en kinesisk traditionell råmedicin, hos möss. Am. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]
10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Effekt av echinakosid på njurfibros genom hämning av TGF- 1/Smads signalväg i DB/DB-mössmodellen för diabetisk nefropati. Drug Des. Devel. Ther. 2017, 11,2813–2826. [CrossRef]
11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Sun, HX; Liu, X. Antihyperglykemiska och hypolipidemiska effekter av Cistanche tubulosa i typ 2-diabetiska DB/DB-möss. J. Etnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]
12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Preliminär optimering av en formel för kinesisk örtmedicin baserad på de neuroprotektiva effekterna i en råttmodell av rotenoninducerad Parkinsons sjukdom. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]
13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Datum, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin är en acylerad peptid som frisätter tillväxthormon från magen. Nature 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]
14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Uttryck av ghrelinreceptor-mRNA i råtta- och mushjärnan. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]
15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin i regleringen av kroppsvikt och metabolism. Främre. Neuroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]
16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagraj, HS; tyskar, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Effekter av mänskligt tillväxthormon hos män över 60 år. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Systematisk översikt: Säkerheten och effektiviteten av tillväxthormon hos friska äldre. Ann. Internera. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]
18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Tillväxthormonbehandling vid mänskligt åldrande: Fördelar och risker. Hormoner 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]
19. Sattler, FR Tillväxthormon hos den åldrande mannen. Bästa praxis. Res. Clin. Endokrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]
20. Se, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, unika acylerade flavonoidtetraglykosider i Chin-shin oolong-te, är förmodade orala agonister av ghrelinreceptorn.
J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]
21. Hsieh, SK; Se, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identifiering av biosyntetiska intermediärer av teaghreliner och teaghrelinliknande föreningar i oolong-teer och deras molekylära dockning till ghrelinreceptorn.
J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]
22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Se, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghreliner, unika acylerade flavonoidglykosider i Folium Ginkgo, stimulerar utsöndring av tillväxthormon via aktivering av ghrelinreceptorn. J. Etnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]
23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Song, X.; Fu, F.; Gao, X. Strukturell karakterisering och identifiering av fenyletanoidglykosider från Cistanches deserticola YC Ma av UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem. Anal. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]
24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Kvantitativ analys av Cistanches Herba med hjälp av högpresterande vätskekromatografi i kombination med diode array-detektion och högupplöst masspektrometri kombinerat med kemometriska metoder. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]
25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Åh, MS; et al. Neuroprotektiv effekt av ghrelin i 1-metyl-4-fenyl-1, 2, 3, en 6-tetrahydropyridinmusmodell av Parkinsons sjukdom genom att blockera mikroglialaktivering. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]
26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Bortom stresskonceptet: Allostatisk belastning - Ett utvecklingsbiologiskt och kognitivt perspektiv. I utvecklingspsykopatologi: Volym två: utvecklingsneurovetenskap; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; s. 578–628.
27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER En översyn av de kardiovaskulära och anti-aterogena effekterna av ghrelin. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]
28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Ghrelinreceptor omvända agonister: Identifiering av en aktiv peptidkärna och dess interaktionsepitoper på receptorn. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]
29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Reglerande effekt av ghrelin på utsöndring av tillväxthormon från perfuserade främre hypofysceller från råtta. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]
30. Se, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, ett unikt emodinderivat i Heshouwu, stimulerar utsöndring av tillväxthormon via aktivering av ghrelinreceptorn. J. Etnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]
31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Två distinkta konformationer av helix 6 observerade i antagonistbundna strukturer av en beta1-adrenerg receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]
32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et al. Struktur och funktion av ett irreversibelt agonist-beta(2) adrenoceptorkomplex. Nature 2011, 469, 236–240. [CrossRef]
33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; stater, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM—Ett program för makromolekylär energi, minimering och dynamikberäkningar. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187-217. [CrossRef]
