Del Ⅰ Smad3-brist förbättrar ö-baserad terapi för diabetes och diabetisk njurskada genom att främja cellproliferation via den E2F3-beroende mekanismen

Abstrakt

1. Motivering

Dålig cellproliferation är en av de skadliga faktorerna som hindrar cellöarsättningsterapi för patienter med diabetes. Smad3 är en viktig transkriptionsfaktor för TGF-signalering och har visat sig främja diabetes genom att hämma cellproliferation. Därför antar vi att Smad3-defekta öar kan vara en ny cellersättningsterapi för diabetes.

2. Metoder

Vi undersökte denna hypotes i streptozocininducerade typ-1 diabetiska möss och typ-2 diabetiska db/db möss genom att transplantera Smad3 knockout (KO) och vildtyp (WT) öar under njurkapseln, respektive. Effekterna av Smad3KO kontra WT-öersättningsterapi på diabetes och diabetisk njurskada undersöktes. Dessutom applicerades RNA-seq för att identifiera nedströms målgenen som ligger till grund för Smad3-reglerad cellproliferation i Smad3KO-db/db kontra Smad3WT-db/db musöar.

3. Resultat

Jämfört med Smad3WT-öterapi gav behandling med Smad3KO-öar en mycket bättre terapeutisk effekt på både typ-1 och typ-2 diabetes genom att signifikant sänka serumnivåerna av blodsocker och HbA1c och skydda mot diabetiska njurskador genom att förebygga en ökning av serumkreatinin och utvecklingen av proteinuri, mesangial matrisexpansion och fibros. Dessa var förknippade med en signifikant ökning av transplanterad cellproliferation och blodinsulinnivåer, vilket resulterade i förbättrad glukosintolerans. Mekanistiskt avslöjade RNA-seq att jämfört med Smad3WT-db/db musöar uppreglerade deletion av Smad3 från db/db musöar markant E2F3, en pivotal regulator av cellcykel G1/S-inträde. Ytterligare studier fann att Smad3 kunde binda till promotorn av E2F3 och därmed hämma cellproliferation via en E2F3-beroende mekanism eftersom tystnad av E2F3 upphävde den proliferativa effekten på Smad3KO-celler.

4. Slutsats

Smad3-brist i ersättningsterapi kan avsevärt förbättra både typ-1 och typ-2 diabetes och skydda mot diabetisk njurskada, som förmedlas av en ny mekanism av E2F3-beroende cellproliferation.

Nyckelord

Smad3, ötransplantation, diabetes, E2F3, cellcykel.

Klicka här för att hämtaCistanche fördelar

Introduktion

typ-1 och 2 diabetes mellitus (T1DM och T2DM). cell- eller ötransplantation är en attraktiv terapi och har framgångsrikt tillämpats på patienter med T1DM. De öar eller celler som används för transplantation är vanligtvis från dödsdonatorn eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) [1, 2]. Mer än 1500 fall av klinisk ötransplantation har slutförts hos patienter med T1DM enligt det väletablerade Edmonton-protokollet [1]. Även om cirka 50 procent av patienterna har insulinoberoende i 5 år efter transplantationen, är transplantationssvikt ett vanligt problem kliniskt. En av faktorerna som hindrar ötransplantation är den extremt låga proliferationshastigheten för de ympade öcellerna [3]. Dessutom kan de farliga stimuli från transplantatets mikromiljö såsom inflammation, immunallotransplantatavstötning och metabolisk stress göra att transplanterade celler genomgår apoptos och nekros, vilket resulterar i progressiv transplantatförlust [1]. Därför är förbättring av den transplanterade cellproliferationen avgörande för framgången med ötransplantationsbaserad behandling för diabetes.

Transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-) signalering spelar pleiotropa roller i många biologiska processer. Signaltransduktionen initieras genom bindningen av TGF-liganden till dess typ 2-receptor TGFBR2. Den senare rekryterar och aktiverar typ 1-receptor TGFBR1 genom fosforylering. Aktiverad TGFBR1 fosforylerar ytterligare de receptorreglerade Smad-proteinerna (R-Smads), Smad2 och Smad3. R-Smads bildar ett komplex med Smad4, som translokerar in i kärnan för att transkriptionellt reglera målgener [4, 5]. Det rapporteras att bukspottkörtelns ö upprätthåller universellt aktiverad TGF-signalering, vilket avslöjas av en relativt hög nivå av fosforylerad Smad2/3 under de fysiologiska förhållandena. Men som svar på insulinbehovet minskar TGF-signaleringsaktiviteten, åtföljd av ökad cellproliferation [6]. Dessutom främjar farmakologisk hämning av TGF-signalering cellproliferation in vitro och in vivo [7, 8]. Ännu viktigare är att deletionen av Smad3 resulterar i mer robust cellproliferation jämfört med deletionen av Smad2 hos möss med partiell pankreatektomi, vilket indikerar att Smad3 men inte Smad2 är den primära effektorn nedströms om TGF-signalering för att reglera cellproliferation [6]. Senare studier visar att Smad3 undertrycker cellproliferation genom att inducera uttrycket av cyklinberoende kinashämmare (CDKI), inklusive p16, p21 och p57 [7, 8].

Vårt senaste arbete fann också att raderingen av Smad3 i db/db-möss (Smad3KO-db/db) förhindrar uppkomsten av öppen diabetes utan fetma, hyperglykemi, insulinresistens och glukosintolerans. Intressant nog visar Smad3KO-db/db-möss öhyperplasi med signifikant ökad cellproliferation och ihållande hyperinsulinemi [9]. Detta innebär att Smad3 är patogen vid diabetes och att rikta in sig på Smad3 i celler kan representera en ny cell- eller ö-ersättningsterapi för diabetes. Detta undersöktes i den aktuella studien genom att använda Smad3 knockout (Smad3KO) ötransplantation i streptozocin (STZ)-inducerade typ{11}} diabetiska möss och i typ-2 diabetiska db/db möss.

Cistanche-tillskott

Resultat

1. Smad3KO-ötransplantation gav en bättre terapeutisk effekt på STZ-inducerad typ-1 diabetes

För att jämföra den terapeutiska effekten av Smad3KO kontra Smad3WT-ö på diabetes, utförde vi först syngen ötransplantation under njurkapseln hos STZ-inducerade diabetiska möss där hyperglykemi orsakas av cellbrist. Diabetiska möss på dag 7 efter STZ-injektion transplanterades med 3 doser av öar (50, 100 och 200 öar per mus) som nyligen isolerades från Smad3WT- eller Smad3KO-möss. Både slumpmässiga blodsockernivåer (RBG) och fastande blodsockernivåer (FBG) övervakades varje vecka under 16 veckor. Transplantationsdoserna valdes baserat på de tidigare fynden att transplantation av 300 öar är tillräckligt för att snabbt återställa euglykemi i cellutarmade möss [10]. Såsom visas i figurerna 1A till D utvecklade de diabetiska mössen med skenoperation ihållande hyperglykemi under 16 veckor. Transplantation med en låg dos (50 öar) av Smad3KO- eller WT-öar misslyckades med att minska både RBG- och FBG-nivåerna. Men diabetiska möss som fick 100 Smad3KO-öar, men inte samma dos av Smad3WT-öar, återfann gradvis normal RBG och FBG liknande de som fick 200 Smad3KO- eller WT-öar. Vi fann också att den blodsockersänkande effekten enbart tillskrivs de transplanterade öarna eftersom hyperglykemi återkom omedelbart när den ö-bärande njuren togs bort från 16 veckor och framåt (pil, figur 1A).

Försämrad glukostolerans utvecklades också hos skenopererade diabetiska möss, som lindrades avsevärt genom att transplantera den höga dosen (200) av Smad3KO- eller WT-öar och 100 Smad3KO-öar, men inte av den låga dosen av 50 Smad3KO- eller WT-öar och 100 Smad3WT-öar (Figur 1E och G). Som väntat utvecklade STZ-inducerade diabetiska möss inte insulinresistens.

Däremot observerades förlängt svar på insulin hos hyperglykemiska möss med skenoperation eller ineffektiv terapi med 50 Smad3WT- eller KO-öar och 100 Smad3WT-öar (Figur 1F och H). I linje med återvunnen euglykemi och förbättrad glukosintolerans, visade diabetiska möss som fick 200 Smad3KO- eller WT-öar och 100 Smad3KO-öar, men inte 50 Smad3KO- eller WT-öar och 100 Smad3WT-öar, sänkt blod HbA1c-nivå 1 i kombination med ökad nivå av HbA1c-insulin. och J). Dessutom orsakade STZ-inducerad diabetes tillväxthämning, som delvis återfanns i möss transplanterade med 200 Smad3KO- eller WT-öar och 100 Smad3KO-öar (Figur S1). Dessutom utvecklade STZ-inducerade diabetiska möss också diabetisk nefropati vid 16 veckor, vilket framgår av mesangial expansion, interstitiell fibros, proteinuri och ökat serumkreatinin (Figur 2). Intressant nog resulterade behandling med 100 Smad3KO-öar, men inte 100 Smad3WT-öar, i skydd mot utvecklingen av diabetisk njursjukdom, även om detta också var anmärkningsvärt hos diabetiska möss behandlade med den höga dosen av 200 Smad3KO- eller WT-öar (Figur 2). Dessa fynd visar en bättre terapeutisk effekt av Smad3KO-öar på STZ-inducerad diabetes och tyder på en 50-procentig minskning av de öar som behövs för att uppnå kompetent glykemisk kontroll och skydd mot diabetisk njurskada genom att använda Smad3-defekt ö-ersättningsterapi för diabetes.

2. Smad3KO-ötransplantation gav en bättre terapeutisk effekt på typ-2 diabetes hos db/db-möss

Det har rapporterats att ötransplantation förbättrar T2DM i en dietmatad musmodell med hög fetthalt utmanad med en låg dos STZ [11]. Vi undersökte sedan om transplantation av Smad3KO-öar också ger en bättre terapeutisk effekt på T2DM genom att behandla db/db-möss med 250 Smad3KO- eller WT-öar från prediabetesåldern vecka 4 till vecka 12. Vi fann att transplantation med antingen Smad3KO eller WT öar påverkade inte tillväxten av mottagar-db/db-möss (Figur S2). Även om db/db-möss som fick Smad3WT-ötransplantation visade en trendminskning av RBG och FBG jämfört med skenopererade db/db-möss, visade db/db-möss transplanterade med motsvarande dos av Smad3KO-öar en signifikant minskning av RBG och FBG (Figur 3A och B). Glukosintolerans utvecklad i db/db-möss förbättrades signifikant av Smad3KO men inte Smad3WT-ötransplantation, även om insulinresistens inte förändrades (Figur 3C-F). Jämfört med Smad3WT-ötransplantation eller skenoperation visade db/db-möss behandlade med Smad3KO-ötransplantation också en signifikant minskning av HbA1c-nivåerna i blodet, vilket åtföljdes av en anmärkningsvärd ökning av nivåerna av blodinsulin (Figur 3G och H). Vidare försvagade behandling med 250 Smad3KO-öar avsevärt glomerulär mesangial expansion (Figur 4). Men eftersom inga signifikanta förändringar i serumkreatinin, proteinuri och njurfibros påvisades hos db/db-möss vid 12 veckors ålder, hittades inga uppenbara förändringar i dessa parametrar i db/db-möss behandlade med Smad3KO eller WT-öar (Figur 4). Sammantaget indikerar dessa data återigen att transplantation av Smad3KO-öar ger en bättre behandling jämfört med Smad3WT-öar i typ-2 diabetiska db/db-möss.

3. Smad3-brist främjar cellproliferation i de ympade öarna i både STZ-inducerade diabetiska möss och db/db-möss.

Vi undersökte sedan de potentiella mekanismerna där transplantation av Smad3KO-öar ger en bättre terapeutisk effekt på både T1DM och T2DM. Vi undersökte först cellmassan i de ympade öarna genom immunfärgning med insulin. I STZ-inducerad diabetes misslyckades vi med att detektera förekomsten av insulinpositiva celler under njurkapseln hos möss ympade med 50 Smad3KO- eller WT-öar vid vecka 16 efter transplantation, vilket tyder på förlust av celler. Oväntat visade diabetiska möss som fick 100 Smad3WT-öar endast ett fåtal dispergerade insulinproducerande cellkluster, men detta ökade till stor del hos diabetiska möss behandlade med 100 Smad3KO-öar, vilket resulterade i nästan en 17-faldig ökning av cellmassan (Figur 5A och B). Intressant nog uppvisade diabetiska möss som fick en hög dos av 200 Smad3KO- eller WT-öar en liknande cellmassa (figur 5A och B). Dessa fynd överensstämde med den dosberoende effekten av ötransplantation på hyperglykemi som visas i figurerna 1A och B.

Vi undersökte sedan om den ökade cellmassan i Smad3KO-ötransplantat är associerad med ökad cellproliferation. Tvåfärgsimmunfluorescens visade att vid vecka 16 efter ötransplantation, visade mössen som behandlats med 100 Smad3WT-öar odetekterbara eller sällsynta PCNA plus insulin plus celler, vilket primärt ökade hos dem som fick 100 Smad3KO-öar eller en hög dos på 200 Smad3KO eller WT holmar (Figur 5C och D). Vi undersökte sedan om Smad3 kontrollerar den tidiga cellproliferationen i de ympade öarna under progressiva diabetiska tillstånd genom BrdU-märkning på dag 7 efter ötransplantation när nivåerna av blodsocker förblev höga. BrdU-märkning avslöjade en 3-faldig ökning av BrdU plus insulin plus celler i 100 Smad3KO-ötransplantat jämfört med samma dos av Smad3WT-ötransplantat (Figur 5E och F). Detta fynd indikerar att Smad3-brist till stor del främjar cellproliferation genom S-fas-cellcykeln under hyperglykemiska förhållanden, vilket bidrar till en 17-faldig ökning av cellmassan som ses vid vecka 16 efter ötransplantation (Figur 5A och B) . Sammantaget tyder alla dessa fynd på att Smad3-brist till stor del främjar cellproliferation och därigenom återställer euglykemi vid STZ-inducerad typ-1 diabetes.

På liknande sätt detekterades också hög cellproliferativ aktivitet i Smad3KO-ötransplantat i typ-2 diabetiska db/db-möss, vilket visas genom en 5-faldig ökning av cellmassan jämfört med de med Smad3WT-ötransplantat vid ålder av vecka 12 efter ötransplantation (Figur 6A och B), vilket var associerat med en 2.5--faldig ökning av insulin plus PCNA plus celler (Figur 6C och D). Genom att använda BrdU-märkning upptäckte vi också en 3-faldig ökning av insulin plus BrdU plus-celler i Smad3KO-ötransplantat på dag 7 efter transplantation i 12-veckogamla db/db-möss (Figur 6E och F). Detta fynd bekräftar återigen att celler som saknar Smad3 är resistenta mot hyperglykemi och förblir mycket proliferativa för att bibehålla cellmassan för att förbättra T2DM.

4. Smad3-brist främjar cellproliferation in vitro

Det har rapporterats att farmakologisk hämning av TGFBR1 främjar cellproliferation in vitro [7, 8]. Vi undersökte därför om den genetiska deletionen av Smad3 också främjar cellproliferation genom att odla Smad3KO- och WT-öcellerna följt av BrdU-märkning. Dubbel immunfluorescens visade att öceller som saknade Smad3 uppvisade en signifikant högre nivå av BrdU-positiva celler (5,7 procent) jämfört med Smad3WT-öceller (2,4 procent) (Figur 7A och B). Den ökade proliferationen av Smad3KO-celler demonstrerades också genom ökat uttryck av PCNA som avslöjats av Western blot-analys (Figur 7C), vilket bekräftar den viktiga reglerande rollen för Smad3 i cellproliferation.

5. RNA-seq identifierar E2F3 som en Smad3 målgen som reglerar cellproliferation

För att avslöja nedströmsmekanismen för Smad3 för att reglera cellproliferation, utförde vi RNA-seq i öar isolerade från db/m eller db/db möss med eller utan deletion av Smad3-genen inklusive Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m och Smad3KO-db/m möss som tidigare beskrivits [9]. Bananrikningsanalys utfördes bland de differentiellt uttryckta generna (DEG) mellan Smad3WT och Smad3KO öar i db/m eller db/db bakgrund. I den genetiska bakgrunden för db / db resulterade Smad3KO i betydande förändringar i cellcykelrelaterade gener eller vägar som avslöjades av GO- och KEGG-analys (Figur 8A och Figur S3). Med tanke på de individuella generna avslöjade RNA-seq-analys en ökning av uttrycket av gener som involverade cyklin, cyklinberoende kinaser (CDK) och proteinfamiljen celldelningscykel (CDC) i Smad3KO-db/db-öar jämfört med Smad3WT-db /db-öar, som ytterligare validerades i odlade Smad3KO-öceller med RT-PCR (Figur S4 A och C). I motsats härtill, i den genetiska bakgrunden av db/m, orsakade Smad3KO inget anmärkningsvärt inflytande på cellcykelrelaterade gener eller vägar (Figur S3B och C). Det rapporteras att TGF-/Smad3-signalering negativt reglerar cellcykeln genom att inducera de cyklinberoende kinashämmargenerna (CDKI) [7, 8, 12]. Överraskande nog undertrycktes ingen av dessa CDKI-geners uttryck i Smad3KO-db/db-öar in vivo och odlade Smad3KO-öceller som avslöjades av RNA-seq respektive RT-PCR (Figur S4B och C). Däremot uppreglerades uttrycksnivåerna för flera CDKI-gener som p16, p18 och p57 till och med i odlade Smad3KO-öceller (Figur S4C). Detta innebär att det finns en alternativ mekanism i Smad3-reglerad cellproliferation.

Vi analyserade således Smad3-bindningspotentialen för promotorsekvenserna för 224 DEG i cellcykelns GO-term med ECR-webbläsarprogramvaran (Figur 8A). Bland dem fick en gen vid namn E2F3 vår uppmärksamhet eftersom det är en nyckel och terminal executor som reglerar G1/S-inträde i cellcykeln [13, 14]. Vi hittade ett potentiellt Smad3-bindningsställe i promotorn för mus-E2F3-lokuset som också är konserverat hos människor (Figur 8B).

Cistanche tubulosa

För att undersöka om E2F3 är väsentligt för Smad3-reglerad cellproliferation undersökte vi sambandet mellan E2F3 och Smad3 i öar. I överensstämmelse med RNA-sekvensen upptäckte immunhistokemi att uttrycket av E2F3 till stor del reducerades i öarna hos Smad3WT-db/db-möss men ökade kraftigt i Smad3KO-db/db-möss (Figur 8C). Dessutom observerades också ökat E2F3-uttryck i odlade Smad3KO-öceller vid både RNA- och proteinnivåer (Figur 8 DF). Däremot upphävde adenovirusmedierad tystnad av E2F3 den proliferativa aktiviteten hos celler (insulin^plusBrdU^plus) i Smad3KO-öceller (Figur 9), vilket visar en viktig roll för E2F3 i Smad3-reglerad cellproliferation.

För att ytterligare bekräfta den förutsagda bindningen av Smad3 i E2F3-promotorn utförde vi kromatinimmunoutfällning (ChIP) i isolerade musöar (Figur 10A). Specificiteten för Smad3-antikroppen som användes för ChIP validerades initialt genom immunoutfällning i musöar (Figur 10B). ChIP PCR bekräftade bindningen av Smad3 till E2F3-promotorn som anti-Smad3-antikroppen, men ingen icke-specifik IgG-isotyp fällde framgångsrikt ut kromatinfragmentet motsvarande E2F3-promotorn (Figur 10C). Kvantitativ RT-PCR avslöjade en 6-faldig anrikning av E2F3-promotorsekvensen i ChIP-analysen med Smad3-antikroppen jämfört med IgG-isotypen (Figur 10D), vilket visar att Smad3 kan binda till promotorregionen av det genomiska E2F3-lokuset .

För att validera den funktionella betydelsen av Smad3-bindning på E2F3-promotorn, konstruerade vi en luciferasreportervektor som drivs av en mus E2F3-promotor som hyser Smad3-bindningsstället eller dess mutanta form (Figur 10E). Dubbel-luciferasanalys i HEK293T-celler avslöjade en robust transkription av luciferas driven av den klonade E2F3-promotorn, som signifikant hämmades genom att överuttrycka Smad3. Emellertid upphävde mutation av Smad3-bindningsstället den hämmande effekten av Smad3 (Figur 10F). Dessa fynd gav direkta bevis för den undertryckande rollen av Smad3 i E2F3-transkription genom att binda till dess promotor.

I den här studien visade vi att transplantation av Smad3-defekta öar gav en bättre terapeutisk effekt på diabetes och diabetisk njurskada hos STZ-inducerade diabetiska möss och db/db-möss. Vid STZ-inducerad diabetes resulterade transplantation av 100 Smad3KO men inte 100 Smad3WT-öar i en 17-faldig ökning av cellmassa, vilket var associerat med en signifikant ökning av insulinnivåerna i blodet och därmed förbättrad glukosintolerans och återställd euglykemi, vilket resulterade i som skydd mot diabetisk njurskada.

Liknande resultat hittades också i T2DM i db/db-möss där transplantation med 250 Smad3KO-öar men inte samma dos av Smad3WT-öar också ökade en 5-faldig cellmassa och gav en bättre glykemisk kontroll. Dessa fynd tyder på att Smad3-brist är resistent mot diabetiska mikromiljöer och till stor del främjar expansionen av ympade öceller och insulinproduktion för att uppvisa bättre glykemisk kontroll. Intressant nog fann vi också att behandling med 100 Smad3KO-öar kunde ge en lika stor glykemisk kontroll som användningen av 200 Smad3WT- eller KO-öar vid STZ-inducerad diabetes. Denna observation tyder på att Smad3-brist kan till stor del reducera (minst 50 procent) antalet öar som krävs för att framgångsrikt etablera insulinoberoende i cellöarsättningsterapi för T1DM. Dessa fynd ligger i linje med den tidigare rapporten att förbehandling av öarna med SB-431542, en hämmare av TGFBR1, främjar proliferation och funktion av celler efter transplantation [15]. Men eftersom Smad2 också spelar en viktig roll i den glukosstimulerade frisättningen av insulin i celler [16], kan inriktning på Smad3 men inte uppströms TGFBR1 i öar (celler) vara mer gynnsamt för cellersättningsbehandling av diabetes. Således kan Smad3-brist-ötransplantation representera en ny behandling för både T1DM och T2DM kliniskt. Dessutom kan behandling med Smad3KO-öar också skydda mot diabetisk njurskada vid 16 veckors T1DM, även om detta inte är djupgående i T2DM på grund av den minimala diabetiska njurskadan som uppstår hos db/db-möss vid åldern av vecka 12.

Mekanistiskt fann vi att Smad3 fungerar genom att undertrycka E2F3 för att hämma cellproliferation. Detta stöds av bevisen att E2F3-promotorn innehåller ett funktionellt Smad3-bindningsställe som bekräftats av ChIP och luciferasreporteranalys. Öceller som saknar Smad3 visade ökad proliferation i en E2F3-beroende mekanism eftersom nedbrytningen av E2F3 avskaffade denna pro-proliferativa aktivitet. E2F3 tillhör E2F-familjen och är en kritisk komponent i Rb-E2F-maskineriet som styr G1/S-cellcykelinträde [13]. E2Fs är de transkriptionsfaktorer och slutgiltiga exekutorer för att reglera gener som orkestrerar cellcykelframsteg [14]. Överuttryck av E2F3 har visat sig främja cellproliferation i öar från gnagare och människor [17]. Fynden att Smad3 transkriptionellt riktar sig mot E2F3 för att undertrycka cellcykeln i celler ger en ny reglerande mekanism för cellproliferation. Avbrott av Smad3 i cellöar främjar således E2F3-beroende cellproliferation, vilket visas av en markant ökning av insulinproducerande PCNA plus- eller BrdU plus-celler, vilket tyder på att behandling med en subterapeutisk dos av Smad3KO-öar är tillräcklig för att expandera cellen massa och hämmar både T1DM i STZ-inducerade möss och T2DM i db/db möss.

Herba CistancheochCistanche-extrakt

Det har rapporterats att TGF-signalering spelar en avgörande roll i bukspottkörtelöcellernas utveckling och funktion, stoppar cellcykeln och orsakar cellapoptos genom att inducera CDKIs [7, 8, 18]. Till vår förvåning avslöjade både in vivo och in vitro-experiment att transkriptionen av CDKIs inte ändrades eller ens uppreglerades i Smad3KO-öar (Figur S4). Denna diskrepans kan tillskrivas de olika experimentella förhållandena. Resultaten i den aktuella studien härrörde från Smad3KO-möss (öar). De tidigare studierna är dock baserade på den farmakologiska hämningen av TGFBR1, vilket ska påverka hela TGF-signaleringen [7, 8]. Dessutom använde vi öprover från unga vuxna möss (åldern 8-10 veckor), medan holmar från relativt gamla djur eller dödsdonatorer från äldre människor användes i tidigare studier [7, 8]. Eftersom cellöar visar åldersassocierad ackumulering av CDKIs [19], kan CDKIs i åldrade celler vara mer känsliga för TGF-signaleringshämning.

Det fanns flera begränsningar i denna studie. Först undersöks effekten av ötransplantation i den STZ-inducerade diabetiska musmodellen utan autoimmun reaktion. Därför bör fördelen med Smad3KO framför Smad3WT-öterapi för diabetes också verifieras i en autentisk T1DM-modell i framtiden. För det andra är resultaten från denna studie baserade på helön men inte cellspecifik Smad3KO-cellterapi. Det är oklart om andra celltyper än celler i ön skulle utföra en Smad3-beroende roll för att modulera cellproliferation genom intercellulära överhörningsvägar. Därför är ytterligare studier med cellspecifika Smad3KO motiverade. Dessutom måste fynden från denna studie verifieras i prover från mänskliga öar för att bevisa deras kliniska betydelse.

Referenser

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinisk pankreasötransplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Human pluripotent stamcellsdifferentiering till funktionella pankreatiska celler för diabetesterapier: innovationer, utmaningar och framtida riktningar. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histologisk graftbedömning efter klinisk ötransplantation. Transplantation. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Olika roller av TGF-beta/Smads vid njurfibros och inflammation. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad-signalering vid njurfibros. Front Physiol. 2015; 6:82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Ett smarrigt signalnätverk reglerar cellöarnas spridning. Diabetes. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibering av TGF-beta-signalering främjar human pankreatisk beta-cellsreplikation. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombinerad hämning av DYRK1A, SMAD och Trithorax Pathways synergerar för att inducera robust replikering i vuxna mänskliga betaceller. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Smad3-brist främjar betacellsproliferation och funktion i db/db-möss genom att återställa Pax6-uttryck. Teranostik. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. En metod för murin ö-isolering och subkapsulär njurtransplantation. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Islet-transplantation förbättrar insulinkänsligheten i en murin modell av typ 2-diabetes. Endokrin. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Induktion av p16ink4a och p19ARF av TGFbeta1 bidrar till tillväxtstopp och senescenssvar i mus-keratinocyter. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Reglera proliferation under retinal utveckling. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Regleringen av E2F av proteiner från pRB-familjen. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Övergående undertryckande av TGFbeta-receptorsignalering underlättar transplantation av mänskliga öar. Endokrinologi. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2-avbrott i mus pankreatiska betaceller leder till öhyperplasi och försämrad insulinsekretion på grund av försvagningen av ATP-känslig K plus-kanalaktivitet. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Överuttryck av E2F3 främjar proliferationen av funktionella mänskliga betaceller utan induktion av apoptos. Cellcykel. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta familjesignalering i kontroll av cellproliferation och överlevnad. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--framsteg och utmaningar i mänsklig betacellsproliferation. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Riktad störning av SMAD3 resulterar i försämrad slemhinneimmunitet och minskad T-cells känslighet för TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Ett protokoll för isolering av öar från musbukspottkörteln. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantation av pankreasöar i njurkapseln hos diabetiska möss. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Borttagning av Smad3 förhindrar njurfibros och inflammation vid typ 2 diabetisk nefropati. Ämnesomsättning. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 och Hui-Yao Lan2,7

1 Forskningscentrum för integrerad medicin och avdelningen för nefrologi, anslutet sjukhus för traditionell kinesisk medicin vid Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

2. Institutionen för medicin och terapi och Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.

3. Guangdong-Hong Kongs gemensamma laboratorium för immunologiska och genetiska njursjukdomar, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kina.

5. Nyckellaboratorium för förebyggande och hantering av kroniska njursjukdomar i staden Zhanjiang, institutet för nefrologi, anslutna sjukhus vid Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.

6. Nationell klinisk forskningsbas för traditionell kinesisk medicin, anslutet sjukhus för traditionell kinesisk medicin vid Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Gemensamt forskningslaboratorium för immunologiska och genetiska njursjukdomar, det kinesiska universitetet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.