Del Ⅰ Järnkelatorn, PBT434, modulerar transcellulär järnhandel i hjärnans mikrovaskulära endotelceller
Apr 28, 2023
Abstrakt
Järn och andra övergångsmetaller, såsom koppar och mangan, är avgörande för att stödja hjärnans funktion, men överackumulering är cytotoxiskt. Denna överackumulering av metaller, särskilt järn, är gemensam för flera neurologiska störningar; dessa inkluderar Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Friedrichs ataxi och andra störningar som uppträder med neurodegeneration och associerad järnansamling i hjärnan. Hanteringen av järnflödet genom blod-hjärnbarriären ger den första försvarslinjen mot överackumulering av järn under normal fysiologi och dessa patologiska tillstånd. I denna studie fastställde vi att järnkelatorn PBT434, som för närvarande utvecklas för behandling av Parkinsons sjukdom och multipel systematrofi, modulerar upptaget av järn av mikrovaskulära endotelceller i mänsklig hjärna (hBMVEC) genom kelering av extracellulär Fe2 plus. Behandling av hBMVEC med PBT434 resulterar i en ökning av mängden av transkripten för transferrinreceptor (TfR) och ceruloplasmin (Cp). Western blot- och ELISA-analyser visar också en motsvarande ökning av proteinerna. Inom cellen ökar PBT434 den detekterbara nivån av välgörande, labil Fe2 plus; data indikerar att denna Fe2 plusfrigörs från ferritin. Dessutom förstärker PBT434 järnutflöde troligen på grund av ökningen av cytosoliskt järnhaltigt järn, substratet för järnexportören, ferroportin. PBT434 ekvilibrerar snabbt och dubbelriktat över en hBMVEC blod-hjärnbarriär. Dessa resultat indikerar att PBT434-järnkomplexet inte är ett substrat för hBMVEC-upptag och stödjer således en modell där PBT434 skulle kelera interstitiellt järn och hämma återupptaget av järn av endotelceller i blod-hjärnbarriären, som samt hämma dess upptag av de andra cellerna i den neurovaskulära enheten. Sammantaget presenterar detta en ny och lovande mekanism för terapeutisk järnkelering.
Klicka här för att hämtavilka är fördelarna med Cistanche
Introduktion
Metallkelationsterapi (MCT) har länge använts som behandling för övergångsmetallförgiftning och för genetiska störningar i metabolismen av en essentiell metalljon som leder till metallens överackumulering [1–3]. Två exempel på det senare är hyperackumulering av koppar vid Wilsons sjukdom [4] och av järn vid ärftlig hemokromatos [5]. Både koppar och järn är katalysatorer för oxidativ stress och är således cytotoxiska i koncentrationer som överstiger cellens och organismens förmåga att "chaperone" dessa redoxaktiva övergångsmetaller [6, 7]. Järnackumulering, i synnerhet, är i stort sett idiopatisk; faktiskt, en ökning av järn är ett kännetecken för en åldrande hjärna [8–10]. Patologiskt är denna hjärnansamling av järn ett kännetecken på mutationer i gener som inte är relaterade till järnmetabolism [11–15] såväl som en mängd andra neurodegenerativa sjukdomar, av vilka några saknar en specifik genetisk koppling såsom åldrande [16], Alzheimers sjukdom [16] 17], Friedreichs ataxi [18] och Parkinsons sjukdom [19]. Som en grupp kan sådana störningar betraktas som neurodegeneration med hjärnansamling av järn (NBIA) även om denna akronym vanligtvis har begränsats till de för vilka en genetisk koppling har identifierats [11, 13, 14].
I fallet med järnöverskott är målet att "rena" kroppen från överskott av järn på grund av en defekt i cellernas järnupptag eller utflöde. Här är målet att konkurrera ut fysiologiska järnkelatorer med läkemedlet; en förening som har god farmakokinetik och hög affinitet för järnhaltigt järn är målläkemedlet. Eftersom kroppen är överfylld med den essentiella metallen, finns det liten oro för att framkalla en brist under behandlingsförloppet. Att behandla cerebral sjukdom med järnkelatbehandling kräver en annan strategi. Detta är inte ett problem med systemisk överbelastning av järn, utan av järnansamling i områden med patologi med skadliga följdsjukdomar nedströms. Åldersrelaterad järnansamling vid Parkinsons sjukdom (PD), till exempel, bidrar potentiellt till oxidativ stressrelaterad cellskada [20]. För mycket labilt järn främjar felveckningen av -synuklein i substantia nigrala neuroner. Användningen av en kelator med hög affinitet kan leda till en viss minskning av järnmängden i hjärnan men kommer med största säkerhet att inducera en järnbrist som åtminstone i den åldrade befolkningen är kontraindicerad med tanke på den systemiska järnbristen som är vanlig för den åldersgruppen [21] . En kelator med optimal affinitet har potential att minska järnackumulering såväl som åtföljande oxidativ stress på grund av överskott av labilt järn och underliggande sjukdomsprocesser.
Cistanche tubulosaochCistanches effekter
En kelator godkänd för användning vid behandling av transfusionsinducerad järnöverbelastning hos talassemipatienter är deferipron (DFP, varumärke Ferriprox) [5, 22]. DFP har också använts för att behandla Friedreichs ataxi [23] och Parkinsons sjukdom [24, 25]. I en metaanalys har DFP visat sig ge betydande minskningar av myokardialt järninnehåll samt ett bättre hjärtskydd hos talassemipatienter än deferoxamin, det klassiska järnkelatbildande medlet [5]. Å andra sidan metaboliseras DFP snabbt av levern [26] och nyare arbete har visat att det kelerar Fe2 plus på det aktiva stället för järnberoende histonlysindemetylaser, en aktivitet som korrelerar med en tidigare okänd cytotoxicitet [27]. Detta fynd understryker en viktig begränsning i användningen av järnkelatbehandling, nämligen läkemedlets konkurrens om fysiologiskt väsentligt järn, oavsett om det är i ett järnlager eller ett protein som hyser en protetisk järnart. Icke desto mindre har DFP till exempel visat effekt i en fas 2-studiebehandling av Parkinsons sjukdom, vilket indikeras av både analytiska (minskad järnbelastning i hjärnan genom T2- viktad MRT) och beteendeindex (kognitiv och motorisk neuronfunktion) [ 24, 25].
DFP:s affinitet för Fe3 plus är dock fortfarande ett problem. Den stabila DFP-järnarten är tris-komplexet, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Medan neutraliteten hos detta komplex är idealisk för att mobilisera järn ut ur cellen, gör stabilitetskonstanten för det, ~1037, DFP till en sann järnrensare; i detta sammanhang är dess hämning av ett järnenzym som lysindemetylas förutsägbar [27]. Denna oro speglar behovet av att utveckla järnkelatorer som har membranpermeabiliteten hos DFP men en betydligt svagare affinitet för både Fe2 plus och Fe3 plus. Detta senare särdrag begränsar läkemedelsfångning av protetisk metall och den termodynamiska potentialen hos kelatbildaren för att katalysera järn-järnautooxidationen som resulterar i produktionen av reaktiva syrearter. I huvudsak katalyserar starka järnkelatorer den prooxidanta egenskapen hos Fe2 plus [29]. I denna studie rapporterar vi hur en sådan järnkelator med måttlig järn- och järnaffinitet modulerar flödet av järn i hjärnans mikrovaskulära endotelceller som bildar blod-hjärnbarriären (BBB).
Cistanche piller
Detta läkemedel, PBT434 [5,7-diklor-2-((metylamino)metyl)-8-hydroxi-3-metylkinazolin-4 (3H)-on, Fig 1A] , bildar ett bis-järnkomplex med log-stabilitetskonstanter på ~11 och ~15 för Fe2 plusoch Fe3 plus, respektive [30]. PBT434 förhindrade förlust av substantia nigra pars compacta (SNpc) neuroner, sänkte ackumulering av nigral-synuklein, minskade PD-sjukdomsmodellrelaterat järninnehåll i mellanhjärnan och räddade motorisk prestanda i två musmodeller av Parkinsons sjukdom utan någon uppenbar utarmning av systemiska järnlager [30]. PBT434 är också effektivt i murina modeller av multipel systematrofi (MSA) [30, 31], en motorisk störning som liknar Parkinsons men som kännetecknas av -synuklein felveckning och efterföljande ackumulering som orsakar bildandet av glia cytoplasmatiska inneslutningar som är kännetecknet sjukdomens patologi [32]. Signifikant reducerade PBT434 markörer för oxidativ stress i mus PD-modeller [30] vilket indikerar att 1) PBT434 riktade järndepåer som annars var förberedda att fungera som prooxidanter och 2) PBT434 inte potentierade denna begynnande oxidationsbaserade cytotoxicitet. PBT434 har genomfört en fas 1-studie på ett tillfredsställande sätt [33].
Arbetet som presenteras här var utformat för att undersöka vilken inverkan PBT434 har på järnhandeln i hjärnans barriärceller, de mikrovaskulära endotelceller som tillsammans med underliggande glia bildar blod-hjärnbarriären. Dessa studier har använt en väl validerad odödlig endotelcellinje i både monolager- och transwell-odlingsformat [34-37]. Det primära syftet med dessa studier var att bestämma kinetiken för järnupptag och utflöde från dessa celler och deras modulering med PBT434. Transwell BBB-modellen användes också för att demonstrera det dubbelriktade PBT434-transcellulära flödet över endotelcellsbarriären. Modellen visade i molekylära termer att PBT434 hämmar järnupptaget genom kelering samtidigt som det stimulerar järnutflödet. Cellavbildningsstudier indikerar att PBT434 kommer åt samma labila järnpool som undersökts av en klassisk Fe2 pluskelatbildare, 2,2'-bipyridin eller bipyridyl, och en fluorescerande sond för järn. Resultaten tyder på en möjlig verkningsmekanism för PBT434 som inkluderar hämning av upptaget av systemiskt järn vid BBB, och efterföljande sekvestrering av hjärnjärn i det interstitiella utrymmet.
Resultat
1. PBT434 har inga cytotoxiska effekter på hjärnans mikrovaskulära endotelceller
För att bestämma ett lämpligt intervall av arbetskoncentrationer för PBT434 i vår cellkultur in vitro använde vi MTT-analysen för att övervaka hBMVEC-mitokondriell funktion som svar på PBT434. Baserat på tidigare rapporter [30], har behandlats med en rad PBT434-koncentrationer upp till 100 μM under 24 timmar. Vi observerade inga signifikanta förändringar i hBMVEC-viabilitet med någon testad koncentration (Fig 2).
2. PBT434 tas snabbt upp och transporteras över hBMVEC-barriären
PBT434 är ett oralt biotillgängligt läkemedel som lätt kan penetrera BBB, vilket framgår av studier utförda på möss och människor [30, 38, 39]. Vi övervakade ackumuleringen av PBT434 i hBMVEC odlad i monolager med användning av 14C-märkt PBT434 som ett radiospårämne. Data indikerade att i den första fasen kom 14C-PBT434 snabbt i jämvikt mellan upptagningsmediet och cellen. Detta initiala upptag följdes av en ytterligare långsam ackumulering under 3 timmar som uppvisade en hastighet av 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Fig 3A). I upptagningsprotokollet släcks upptaget och cellerna tvättas vid 4˚C före bearbetning för 14C-PBT434-ackumulering (metoder). I ett separat experiment undersökte vi utflödet av 14C-PBT434 från hBMVEC efter en laddningsperiod på 30 minuter. I utflödesprotokollet tvättas cellerna vid 25˚C. Data i fig 3B indikerar att i 25˚C-tvättningen förlorades ungefär 92 procent av den cellackumulerade 14C-PBT434 (jfr 550 pmol 14C-PBT434/mg protein i 3A vid 30 min till 43 pmol 14C-PBT434/mg protein vid t=0 i 3B). Det fanns en ytterligare långsam förlust av den återstående 14C-PBT434 (Fig 3B). Data antyder två aspekter av ackumuleringen och utflödet av PBT434 av hBMVEC. Flux över plasmamembranet når snabbt vad som verkar vara en jämvikt vare sig det sker under upptag eller utflöde. Men i båda processerna förekommer det en annan långsammare process. Detta tyder på att inom cellen är en del av cellen PBT434 i en lokal/tillstånd som är i ett kinetiskt stabilt tillståndsförhållande med fraktionen i jämvikt med den extracellulära miljön. Den kinetiska analysen som noteras i Fig 3B uppskattade att denna pool av PBT434 representerades av 27±4 pmol/mg protein i cellysatet när cellerna behandlades med 20 μM reagens.
För att undersöka det transcellulära flödet av PBT434, använde vi en väl validerad in vitro BBB-modell med hjälp av har växt på den apikala sidan av ett transwell-membran [35, 36, 40, 41]. Barriäregenskaperna för dessa transwell-kulturer verifierades genom kvantifiering av deras transendoteliala elektriska resistans (TEER) och impermeabilitet för FITC-märkt dextran (S1 Fig). Vi jämförde 14C-PBT434-upptag vid den luminala (eller apikala, blodsidan) (Fig 4A) med upptag vid det abluminala (eller basolaterala, hjärnsidan) (Fig. 4C) membranet. I samma experiment kvantifierades motsvarande utflöde (transcellulärt flöde) genom uppkomsten av 14C-PBT434 i utflödeskammaren (fig 4 panelerna B och D). Hastigheterna för dessa processer ges i tabell 1. Massdata som illustreras i fig 4 (paneler B och D) visar att nettoflödet av PBT434 över denna modell blod-hjärnbarriär var detsamma i de två riktningarna. Det fanns 976±185 pmol 14C-PBT434 ackumulerade i basalkammaren (fig 4B) och 1033±210 pmol kvantifierades i basalkammaren (fig 4D). Denna nära ekvivalens återspeglades också i de nära likartade hastigheterna för PBT434-utflöde vid de två barriärmembranen (tabell 1). Emellertid fanns det ett signifikant större upptag av PBT434 vid det basolaterala membranet i denna barriärmodell, vilket illustreras av den ~50 procent större förlusten av förening från basalkammaren (Fig 4C) som motsvarade en ~40 procent högre hastighet av skenbart cellupptag (Bord 1). Ett mer robust upptag skulle förutsägas resultera i större ackumulering. Analys av cellerna vid 3 timmar visade att de behöll ~6 μM PBT434 oavsett flödesriktningen. Värdena var 8,1± 1,3 μM (apikalt till basalt) och 4,7±1,2 μM (basalt till apikalt). Som noterats ovan följer denna analys tvättningen av cellerna före lysering och kvantifiering av totalt cellprotein och 14C-PBT434. Dessutom innehöll mediet i den apikala kammaren RPMI plus 10 procent FBS och 10 procent NuSerum medan den basala "hjärnkammaren" endast innehöll RPMI (metoder). En rimlig slutsats var att det större "upptaget" vid basalmembranet reflekterade en cellytadsorption av PBT434 som var begränsad i den apikala kammaren av närvaron av proteinkomponenter i serumet. Vid tvättning av cellerna för ackumulering av PBT434 avlägsnades detta adsorberade material (som registrerades som "upptag"). Att upprepa detta fluxexperiment men med serum i basalkammaren visade att serum verkligen undertryckte denna troliga cellyte-PBT434-adsorption (S2 Fig.).
3. PBT434, till skillnad från bipyridyl, begränsar inte den intracellulära tillgängligheten av labilt järn
Eftersom PBT434 har en mer måttlig affinitet för järn jämfört med klassiska järnkelatorer som deferipron eller bipyridyl, undersökte vi hur den skillnaden återspeglades i PBT434-effekten på den cellulära labila järnpoolen (LIP) av hBMVEC. För att göra detta utnyttjade vi den permeabla, Fe2 plus-specifikt fluorescerande färgämne FerroOrange, som reagerar med välgörande cytoplasmatiskt järn. Vi såg en signifikant ablation av fluorescens i celler när de behandlades med bipyridyl, i överensstämmelse med keleringen av LIP av denna järnkelator med hög affinitet och därmed blockerar verkan av den fluorescerande järnindikatorn (Fig 5A). Däremot konkurrerade inte PBT434 med FerroOrange om Fe2 plus, ett beteende som överensstämmer med dess mer måttliga affinitet [30]. Resultaten visade att PBT434, men inte PBT434-met inaktivt derivat, inducerade en ökning på 34 ± 9 procent i FerroOrange-tillgänglig Fe2 plusvilket tyder på att detta kelatbildande medel mobiliserade järn i cellen utan samtidig toxicitet. Data som presenteras nedan tyder på att detta järn kom från ferritin.
PBT434 har tidigare visat sig återställa utarmat ferroportinproteinuttryck i MPTP-behandlade möss till en nivå som liknar den hos oskadade möss [30]. Detta resultat, tillsammans med ökningen av intracellulär järnfärgning som svar på PBT434, antydde en potentiell effekt på det cellulära järnsvarssystemet och funktionen hos nedströms järnrelaterade proteiner. För att bedöma detta genomförde vi först kvantitativ PCR (qPCR)-analys av PBT434-effekten på mängden av transkripten för flera järnhanteringsproteiner (Fig 6). Medan transkripten för järnutflödesproteinet, ferroportin (Fpn), och de två cytoplasmatiska järnchaperonerna, PCBP1 och 2 var opåverkade, gjorde överflödet av mRNA för transferrinreceptorn (TfR) och ferroxidaset, ceruloplasmin (Cp), det förändra. TfR- och Cp-transkript ökade med 2,8 respektive 3.6-faldigt. Transferrinreceptoruttryck (TfR) är kopplat till det järnkänsliga elementet (IRE) / järnreglerande protein (IRP) systemet [42-44]. Ökningen av TfR-mRNA tyder på att PBT434 konkurrerar med den PCBP1-beroende leveransen av järn för sammansättningen av Fe, S-klustret som omvandlar det regulatoriska IREBP från ett RNA-bindande protein till cytosoliskt akonitas [45]. Således flyttar PBT434 denna regulatoriska modulering mot RNA-bindning och motsvarande hämning av TfR-mRNA-nedbrytning. Vid celljärnbrist regleras Cp-uttrycket delvis av HIF-1 [46]. En ökning av HIF-1-funktionen följer av nedbrytningen av dess hydroxylering genom prolylhydroxylasaktivitet i en järnberoende reaktion [47]. Precis som i fallet med IREBP, verkar PBT434 minska poolen av järn som fungerar som en kofaktor i HIF-1-hydroxylering och nedbrytning. I denna modell ökar ökningen av steady-state-nivån av denna transkriptionsaktivator Cp-transkriptionen.
Med hjälp av en kombination av ELISA-analys och western blotting undersökte vi uttrycket av järnhanterande proteiner i PBT434 eller PBT434-met-behandlat hBMVEC; exempel på WB-analyserna ges i fig 7A. Data visade att mängden TfR-monomer och -dimer ökade signifikant efter 24 timmar liksom Cp (Fig 7B och 7C). Båda ökningarna gick parallellt med den PBT434-beroende ökningen i respektive transkript (Fig 6), däremot var uttrycket av järnutflödesproteinet, Fpn, okänsligt för PBT434-behandling (Fig 7D).
Vi använde ELISA som en ytterligare metod för att kvantifiera veckförändringarna som indikeras av Western blot-data. Således behandlades hBMVEC med PBT434 under 24 timmar och cellysat analyserades med ELISA för TfR (Fig 8A). Den dubbla ökningen av TfR som svar på PBT434-behandling kvantifierad med ELISA var ekvivalent med den som erhölls genom analys av western blottarna (Fig 7B). ELISA användes också för att bedöma överflöd av utsöndrat och GPI-kopplat Cp-protein, med användning av HepG2-celler som en positiv kontroll. När det gäller Cp som utsöndras i tillväxtmedier var detta tillvägagångssätt begränsat genom att sCp-överflöd i både HepG2- och hBMVEC-konditionerade media var vid eller under den nedre känslighetsgränsen för denna analys (S3 Fig.). Det möjliggjorde dock bedömningen av GPI-Cp-överflöd. I denna metod behandlades celler med fosfatidylinositol-specifikt fosfolipas C (PI-PLC), som klyver GPI-ankaret; det sålunda konditionerade mediet koncentrerades och analyserades med Cp-ELISA. Även om detta tillvägagångssätt visade att PBT434 ökade mängden GPI-Cp i HepG2-celler, misslyckades det återigen med att detektera någon Cp frisatt av PI-PLC (Fig 8B). ELISA gav också en direkt metod för kvantifiering av ferritin. För att göra det laddades hBMVEC med 1 uM Fe-citrat under 24 timmar, följt av behandling i frånvaro eller närvaro av PBT434 i ytterligare 1 timme. De resulterande cellysaten utsattes för ELISA-analys för ferritin (fig 8C). I motsats till ökningen av TfR slog behandling med PBT434 ner ferritin (Ft) protein med ~18 procent. Denna förlust av Ft-protein var faktiskt uppenbar efter endast 1 timmes behandling med reagenset. Den tidsmässiga karaktären av detta resultat kan korreleras med ökningen av välgörande Fe2 plus noterat ovan efter en 30 minuters behandling med PBT434. Som diskuterats senare har nedbrytningen av ferritin visats efter behandling med andra cellgenomsläppliga Fe2 plus kelatbildare [48].
4. 55Fe2 plusupptaget hämmas av komplexbildning med PBT434
Med tanke på den snabba jämvikten av PBT434 i hBMVEC inom 30 minuter, i jämförelse med det långsamma, bifasiska upptaget och jämvikten av Fe2 plus över 24 timmar [49], antog vi att PBT434 och Fe2 plus inte delade samma upptagningsmekanism. För att testa detta inkuberades monolager med radiomärkt 55Fe2 plus i frånvaro eller närvaro av PBT434 eller PBT434-met, och 55Fe2 plus-upptag under 3 timmar övervakades (Fig 9A). PBT434 minskade signifikant hastigheten för 55Fe2 plus upptag, såväl som minskade den totala ackumuleringen av 55Fe2 plus i cellysat (Fig 9C). Denna effekt sågs inte med PBT434-met. Jämförelse av PBT434 till 55Fe upptagshastigheter indikerar att PBT434 och Fe2 plus tas upp av separata transportvägar. Vidare antyder hämningen av 55Fe-upptaget i närvaro av PBT434 men inte PBT434-met att ett extracellulärt PBT434-järnkomplex inte är en ligand för järntransportörerna i hBMVEC, nämligen ZIP8, och ZIP14.
Cistanche-tillskott
För att ytterligare undersöka rollen av PBT434 i järnackumulering, testade vi effekten dess förexponering hade på 55Fe2 plus upptag. Celler förbehandlade med PBT434 som, efter tvättning, exponerades för 55Fe2 plus visade en ökning i upptagningshastigheten och ackumuleringen av 55Fe2 plus efter 3 timmar (Fig 9, panel B och D). Denna ökade ackumulering bibehölls i minst 24 timmar. Dessa data tyder på att förexponering av celler för PBT434 övergående potentierar järnupptaget. Oväntat visade PBT434-förbehandlingen också en ökning av både upptag och ackumulering (Fig 9B), men denna effekt var inte lika signifikant eller ihållande som den som visades av PBT434.
Vi har visat att upptaget av järn från 59Fe-transferrin stöds av ferri-reduktion och ferropermeation vid plasmamembranet av har [50, 51]. Ett experimentellt resultat till stöd för denna TBI-järnupptagsmodell var nedbrytningen av detta upptag genom hämning av extracytoplasmatisk ferrireduktasaktivitet; ett annat resultat var en 60-procentig hämning av TBI-järnupptaget av ferrozin, ett starkt järnhaltigt kelatmedel [50]. Den senare strategin användes för att visa att PBT434, men inte PBT{10}}uppfyllde, också hämmade TBI-järnupptaget (Fig 10).
5. PBT434 stimulerar Fpn-beroende 55Fe2 plus efflux
PBT434 har cirka 20 procent av deferiprons förmåga att producera en uppenbar stimulering av Fe2 plus utflöde från neuronala celler [30]. Vi bedömde utflödet av 55Fe2 plus från hBMVEC i frånvaro eller närvaro av PBT434 i kontrollceller eller celler behandlade med en mini-hepcidin, PR73. Hepcidin är ett peptidhormon som finns både systemiskt och i hjärnans interstitium som binder till Fpn och riktar sig mot transportören för nedbrytning. Effekterna av hepcidin på järnexportfunktionen hos Fpn har studerats omfattande [52–54]. Vi har tidigare visat utflöde av Fe2 plus från hBMVEC är Fpn-beroende [35, 49]. PR73 har en EC50 på ~4 nM för Fpn-nedbrytning i en GFP-reporteranalys [55]. hBMVEC i monolager laddades med 55Fe2 plus under 24 timmar i frånvaro eller närvaro av PR73. 55Fe-utflöde kvantifierades sedan under en 5 timmars period i fortsatt frånvaro eller närvaro av PR73 i kombination med frånvaro och närvaro av PBT434 (Fig 11). Medan PR73 slog ner 55Fe-utflödet från både kontroll- och PBT-434--behandlade kulturer, undertryckte PBT434 delvis hämningen på grund av mini-hepcidin. I frånvaro av PBT434 slogs järnutflödet från de PR73-behandlade kulturerna ned med ~75 procent medan nedbrytningen i de PBT434-behandlade kulturerna endast var ~50 procent (Fig 11 och Tabell 2). Två slutsatser kan dras från dessa resultat. För det första nedreglerar knockdownen av Fpn av PR73 55Fe-utflödet i närvaro och frånvaro av PBT434. För det andra, under båda tillstånden, stöder PBT434 en betydande om än liten stimulering av järnutflöde.
Referenser
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Syntetiska och naturliga järnkelatorer: terapeutisk potential och klinisk användning. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.
2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Nya perspektiv inom järnkelationsterapi för behandling av neurodegenerativa sjukdomar. Läkemedel (Basel). 2018; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marco V. Metallkelationsterapi och Parkinsons sjukdom: En kritisk granskning av termodynamiken för komplex bildning mellan relevanta metalljoner och lovande eller etablerade droger. Biomolekyler. 2019; 9(7).
4. Hedera P. Uppdatering om den kliniska behandlingen av Wilsons sjukdom. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Jämförande effekt och säkerhet för deferoxamin, deferipron och deferasirox vid svår talassemi: en metaanalys av 16 randomiserade kontrollerade studier. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalytiska metaller, askorbat och fria radikaler: kombinationer att undvika. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oxidativ stress: en nyckelmodulator vid neurodegenerativa sjukdomar. Molekyler. 2019; 24(8).
8. Ashraf A, Clark M, So PW. Iron Mans åldrande. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. R2* kartläggning för hjärnjärn: associationer med kognition vid normalt åldrande. Neurobiol åldrande. 2015; 36(2):925–32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Järn, hjärnans åldrande och neurodegenerativa störningar. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. Klassificering och molekylär patogenes av NBIA-syndrom. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneration med järnansamling i hjärnan: uppdatering om patogena mekanismer. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.
13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneration med hjärnansamlingsstörningar: värdefulla modeller som syftar till att förstå patogenesen av järnavsättning. Läkemedel (Basel). 2019; 12(1).
14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneration med hjärnansamling av järn: genetisk mångfald och patofysiologiska mekanismer. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneration med järnansamling i hjärnan: en översikt. Iran J Child Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Stamcellsmodellering av neuroferritinopati avslöjar järn som en avgörande faktor för åldrande och ferroptos under neuronalt åldrande. Stamcellsrapporter. 2019; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Järn och Alzheimers sjukdom: från patogenes till terapeutiska konsekvenser. Front Neurosci. 2018; 12:632.
18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Järnets roll i Friedreichs ataxi: Insikter från studier i mänskliga vävnader och cell- och djurmodeller. Front Neurosci. 2019; 13:75.
19. Puschmann A. Nya gener som orsakar ärftlig Parkinsons sjukdom eller Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Inriktning på järnmetabolism i läkemedelsupptäckt och leverans. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalens av anemi hos personer 65 år och äldre i USA: bevis för en hög andel oförklarlig anemi. Blod. 2004; 104 (8):2263-8.
22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Behandling med deferasirox, deferipron och desferrioxamin hos patienter med major talassemi: Järn- och funktionsjämförelse i hjärtat bestäms av kvantitativ magnetisk resonanstomografi. Hematologica. 2011; 96(1):41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferipron i Friedreich-ataxi: en 6-månads randomiserad kontrollerad studie. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Järnkelering i hjärnan av deferipron i randomiserad dubbelblind placebokontrollerad klinisk studie i fas 2 vid Parkinsons sjukdom. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Inriktning på kelatjärn som en terapeutisk modalitet vid Parkinsons sjukdom. Antioxid redoxsignal. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Urinmetaboliska profiler hos människor och råttor av 1,2-dimetyl- och 1,2-dietylsubstituerade 3-hydroxipyridin-4-oner. Läkemedelsmetabolism och disposition. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferipron: Panselektiv studie av histonlysin-demetylas-hämningsaktivitet och strukturaktivitetsrelationer. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.
28. Hider R. Den senaste utvecklingen fokuserade på oralt aktiva järnkelatorer. Talassemi rapporter. 2014; 4 (2).
29. Kosman DJ. Järnmetabolism i aerober: hantera järnhydrolys och autooxidation av järn. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Den nya föreningen PBT434 förhindrar järnmedierad neurodegeneration och alfa-synukleintoxicitet i flera modeller av Parkinsons sjukdom. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, redaktörer. PBT434 bevarar dopaminerga neuroner, minskar alfa-synukleinoligomerisering och förbättrar motorisk funktion i en transgen murin multipelsystematrofimodell. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ USA.
32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Från grundläggande mekanismer till experimentell terapi. Parkinsonism relaterad sjukdom. 2020; 73:94–104.
33. Dawson VL, Dawson TM. Lovande sjukdomsmodifierande terapier för Parkinsons sjukdom. Vetenskap translationell medicin. 2019; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Jämförande studie av fyra odödliga kapillära endotelcellinjer i mänsklig hjärna, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 och BB19, och optimering av odlingsförhållanden, för en in vitro-blod-hjärnbarriärmodell för läkemedelspermeabilitetsstudier. Vätskor och barriärer i CNS. 2013; 10(1):33.
35. McCarthy RC, Kosman DJ. Glialcellsceruloplasmin och hepcidin reglerar differentiellt järnutflöde från hjärnans mikrovaskulära endotelceller. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.
36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. De lösta bärarna ZIP8 och ZIP14 reglerar ackumulering av mangan i hjärnans mikrovaskulära endotelceller och kontrollerar hjärnans mangannivåer. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.
37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bakteriell invasion och transcytos i transfekterade mikrovaskulära endotelceller från mänsklig hjärna. Mikrob Pathog. 2001; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A First in Human Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation (S4.001). Neurologi. 2019; 92(15 Tillägg):S4.001.
39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. En fas 1-studie av PBT434, en ny liten molekylhämmare av synuklein-aggregation, hos vuxna och äldre vuxna volontärer (4871). Neurologi. 2020; 94(15 Tillägg):4871.
40. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktivering av C6-glioblastomcell-ceruloplasminuttryck av angränsande humanhjärnens endotelhärledda interleukiner i ett in vitro-blod-hjärnbarriärmodellsystem. Cellkommunikation och signalering: CCS. 2014; 12:65.
41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP modulerar järnutflöde från hjärnans mikrovaskulära endotelceller genom att stabilisera järnexportören ferroportin. EMBO rapporterar. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Två till Tango: Reglering av däggdjursjärnmetabolism. Cell. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Zhou ZD, Tan EK. Järnreglerande protein (IRP)-järnkänsligt element (IRE) signalväg i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Molekylär neurodegeneration. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112
44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Järnmetabolism i hjärnan och dess störning vid neurologiska sjukdomar. J Neural Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Ett PCBP1-BolA2-chaperonkomplex levererar järn för cytosolisk [2Fe-2S]-klustersammansättning. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Roll av hypoxi-inducerbar faktor -1 i transkriptionell aktivering av ceruloplasmin genom järnbrist. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Proteinhydroxidering med hypoxiinducerbar faktor (HIF) Hydroxylaser: unika eller allestädes närvarande? Celler. 2019; 8(5).
48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Ferroportin-medierad mobilisering av ferritinjärn föregår ferritinnedbrytning av proteasomen. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.
49. McCarthy RC, Kosman DJ. Ferroportin och exocytoplasmisk ferroxidasaktivitet krävs för järnutflöde av endotelceller i hjärnans mikrovaskulära celler. Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(24):17932–40.
50. McCarthy RC, Kosman DJ. Mekanistisk analys av järnackumulering av endotelceller av BBB. Biometaller. 2012; 25(4):665–75.
51. Kosman DJ. Telos av metallo-reduktion och metallo-oxidation i eukaryot järn- och kopparhandel. Metallomics. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Struktur-funktionsanalys av ferroportin definierar bindningsstället och en alternativ verkningsmekanism för hepcidin. Blod. 2018; 131(8):899-910.
53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin och järnhomeostas. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Hepcidin-inducerad endocytos av ferroportin är beroende av ferroportin ubiquitination. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tiolderivatiserade minihepcidiner bibehåller biologisk aktivitet. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.
Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman
Institutionen för biokemi, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York i Buffalo, Buffalo, NY, USA
