Del tre DsbA-L interagerar med VDAC1 i mitokondrionmedierad tubulär cellapoptos och bidrar till utvecklingen av akut njursjukdom

7. Generering av PT-VDAC1-KO-möss

För att undersöka rollen av VDAC1 i AKI, etablerade vi en musmodell med knockouten av VDAC1 i de proximala tubuli i njurarna. Figur 7a visar avelsprotokollet som används för att generera PT-VDAC1-KO. RT-PCR användes för att genotypa PT-VDAC1-KO-mössen; detta gjordes genom att amplifiera en 416-bp DNA-fragment floxad allel och ett 370-bp DNA-fragment av Cre-genen (Figur 7, b; spår 4 och 6). Vildtypsmössen (PT-VDAC1-WT) saknade Cre-genen (Figur 7, b, spår 2 och 3). Immunoblotanalys visade att expressionsnivåer av VDAC1 i njurbarkarna hos PTVDAC1-KO-mössen var lägre än de i PTVDAC1-WT-mössen efter ischemisk eller skenbehandling (Figur 7c och d). Detta verifierades ytterligare av den immunhistokemiska färgningen av VDAC1 (Figur 7e). Dessa data verifierade att vi framgångsrikt hade etablerat en PT-VDAC1-KO-musmodell.

Figur 7. Skapande och egenskaper för PT-VDAC1-KO-musmodellen. (a, b) Avelsprotokollet för generering av PTVDAC1-KO-möss och PCR-detektion av genotypen av vildtyps- och floxade alleler av VDAC1- och PEPCK-Cre-allelen. (c) Immunoblotanalysen av VDAC1 och b-tubulin med användning av kortikala vävnader i njure från PT-VDAC1-KO och PT-VDAC1-WT kullsyskonmöss efter IR-skada. (d) Analys av gråskalebilden mellan dem. (e) Immunhistokemisk färgning av VDAC1 i njurens kortikala vävnader hos vildtyps- och VDAC1-möss efter IR-skada. Originalförstoring x 400. Scar Bar: 100µM. Varje experiment (c & e) upprepades 6 gånger oberoende med liknande resultat. Envägs ANOVA användes för jämförelser med flera grupper (d). # sid<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Klicka här för att veta Cistanche-fördelarna

8. I/R-inducerad njurskada, tubulär cellapoptos och mitokondriell skada förbättrades hos PTVDAC1-KO-möss

Kullkamrater till PT-VDAC1-WT- och PT-VDAC1-KO-möss behandlades med ischemi (28 min) följt av reperfusionsskada (48 timmar). Vi tog sedan blodprover och njurvävnad för vidare undersökning. Vi fann att PT-VDAC1-KO särskilt undertryckte den I/R-inducerade höjningen av nivåerna av BUN och kreatinin (Figur 8 a och b). För det andra visade histologiska analyser och TUNEL-analyser ytterligare att PT-VDAC1-KO markant försvagade den I/R-inducerade vävnadsskadan och njurcellapoptos (Figur 8 c, d, f och g). För det tredje fann EM-analyser att PT-VDAC1-KO signifikant försvagade I/R-inducerad mitokondriell skada (Figur 8 e och h). Slutligen bekräftade immunblotting att PT-VDAC1-KO-mössen visade minskade nivåer av kluvet kaspas-3, en lägre ackumulering av Bax i mitokondrierna och lägre hastigheter för Cyt-c-frisättning i cytosolen (figur 8 I-o). Dessa data indikerade att VDAC1 också medierade den I/R-inducerade AKI.

Figur 8. Dämpning av IR-inducerad njurskada, tubulär cellapoptos, mitokondrieskada och uttrycket av Bax, Cyt-c och kluvet caspas3 i PT-VDAC1-KO-möss. De bilaterala njurartärerna hos PT-VDAC1-KO- och PT-VDAC1-WT-kullmöss klämdes fast i 28 minuter och släpptes sedan i 48 timmar för att upprätta en IR-modell. (en bulle. (b) Serumkreatinin. (c) Hematoxylin- och eosinfärgning. (d) Representativa sektioner av TUNEL-positiva celler. (e) Elektronmikroskopdetektion av mitokondriemorfologi. (f) Rörskador. (g) Antalet TUNEL-positiva celler. (h) Mitokondriernas skadepoäng. (i) Immunoblotterna analyserar uttrycket av klyvt caspase3, VDAC1 och DsbA-L såväl som uttrycket av BAX och Cyt-c i mitokondriella och cytosoliska fraktioner. b-tubulin och GAPDH användes som hellysat respektive cytosolladdningskontroll. COX IV användes som en mitokondrierladdningskontroll. (j- p) Analys av gråskalebilden mellan dem. Originalförstoring x 400. Scar Bar: 100µM i c & d 20µM i e. Varje experiment (c-e&i) upprepades 6 gånger oberoende med liknande resultat. Envägs ANOVA användes för jämförelser mellan flera grupper (a, b, f-h&j-p). # sid<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Överuttrycket av DsbA-L förvärrad I/R-inducerad njurskada försvagades i PT-VDAC1-KO-möss

av DsbA-L under ischemisk skada. En vecka innan musmodellen av IR etablerades, injicerade vi svansvenen på varje mus med DsbA-L-plasmiden (injektionen genomfördes två gånger under denna vecka). Överuttrycket av DsbA-L förvärrade den IR-inducerade förhöjningen i BUN- och kreatininuttryck, njurskada och njurapoptos; dessa effekter försvagades i PTVDAC1-KO-mössen (Figur 9 a-d, e och f). Immunoblotresultat indikerade vidare att överuttrycket av DsbA-L ökade den IR-inducerade ökningen av klyvt kaspas-3, ackumuleringen av Bax i mitokondrierna och frisättningen av Cyt-c i cytosolen; dessa effekter reducerades i PT-VDAC1-KO-möss (Figur 9 g och h-l). Sammantaget visade dessa resultat ytterligare att VDAC1 medierade effekten av DsbA-L under ischemisk skada.

Figur 9. Överuttrycket av DsbA-L-förvärrad I/R-inducerad njurskada försvagades i PT-VDAC1-KO-möss. PT-VDAC1-KO- och PT-DsbA-L-WT-mössen behandlades med eller utan DsbA-L-plasmid och etablerade sedan en IR-modell. (en bulle. (b) Serumkreatinin. (c) Hematoxylin- och eosinfärgning. (d) Representativa sektioner av TUNEL-positiva celler. (e) Rörskador. (f) Antalet TUNEL-positiva celler. (g) Immunoblotterna analyserade uttrycket av klyvt caspase3, VDAC1 och DsbA-L såväl som uttrycket av BAX och Cyt-c i mitokondriella och cytosoliska fraktioner. b-tubulin och GAPDH användes som hellysat respektive cytosolladdningskontroll. COX IV användes som en mitokondrierladdningskontroll. (h- n) Analys av gråskalebilden mellan dem. Originalförstoring x 400. Scar Bar:100mM. Varje experiment (c-e) upprepades 6 gånger oberoende med liknande resultat. Envägs ANOVA användes för jämförelser mellan flera grupper (a, b och f-n). # sid<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Cistanche tillägg

10. Försvagningen av I/R-inducerad njurskada hos PTDsbA-L-KO-möss reducerades genom överuttrycket av VDAC1

För att ytterligare bekräfta om DsbA-L-förmedlad tubulär skada var beroende av VDAC1, exponerades först kullsvenniga möss av PTDsbA-L-WT- och PT-DsbA-L-KO-möss för I/R-behandling och injicerades sedan via svansvenen med VDAC1-överexpressionsplasmiden. Den I/R-inducerade ökningen av BUN- och kreatininnivåer förbättrades i PT-DsbA-L-KO-mössen; emellertid förhindrades denna effekt av överuttrycket av VDAC1 (Figur 10 a och b). HE- och TUNEL-färgning visade att den relativa omfattningen av IR-inducerad njurvävnadsskada och njurcellsapoptos minskade i PT-DsbAL-KO-möss och att dessa effekter blockerades av överuttrycket av VDAC1 (Figur 10 c-f). Immunblotting visade att PT-DsbA-L-KO-mössen hade lägre nivåer av klyvt kaspas-3, lägre nivåer av Bax-ackumulering i mitokondrierna och lägre hastigheter för Cyt-c-frisättning i cytosolen; emellertid eliminerades dessa effekter genom överuttryck av VDAC1 (Figur 10 g-m). Dessa data stödde det faktum att DsbA-L främjade ischemisk skada på ett sätt som var beroende av VDAC1.

Figur 10. PT-DsbA-L-KO förbättrad IR-inducerad njurskada hos möss minskade genom överuttrycket av VDAC1. PT-DsbA-L-KO- och PT-DsbA-L-WT-mössen behandlades med eller utan VDAC1-plasmid och etablerade sedan en IR-modell. (en bulle. (b) Serumkreatinin. (c) Hematoxylin- och eosinfärgning. (d) Representativa sektioner av TUNEL-positiva celler. (e) Rörskador. (f) Antalet TUNEL-positiva celler. (g) Immunoblotterna analyserade uttrycket av klyvt caspase3, VDAC1 och DsbA-L såväl som uttrycket av BAX och Cyt-c i mitokondriella och cytosoliska fraktioner. b-tubulin och GAPDH användes som hellysat respektive cytosolladdningskontroll. COX IV användes som en mitokondrierladdningskontroll. (hm) Analys av gråskalebilden mellan dem. Originalförstoring x 400. Scar Bar:100mM. Varje experiment (c, d och g) upprepades 6 gånger oberoende med liknande resultat. Envägs ANOVA användes för jämförelser mellan flera grupper (a, b, e, f och h-m). # sid<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. CLP-inducerad njurskada försvagades i PT-DsbA-LKO- eller PT-VDAC1-KO-möss

Sepsisinducerad AKI är en annan vanlig orsak till AKI i klinisk praxis. Kullkamrater av PT-DsbA-L eller VDAC-WT och PT-DsbA-L eller VDAC1-KO utsattes för CLP-modellen och avlivades sedan 18 timmar efter operationen. Resultaten visade att PT-DsbA-L- eller VDAC1- KO-möss markant minskade de CLP-inducerade höjningarna av BUN- och kreatininnivåer, och de ökade nivåerna av njurvävnadsskada och njurcellsapoptos (figur S1 och S2 af-f) ). Immunoblotting bekräftade att PTDsbA-L- eller VDAC1-KO-möss också visade minskade nivåer av kluvet kaspas-3, lägre nivåer av Bax-ackumulering i mitokondrierna och lägre hastigheter för Cyt-c-frisättning i cytosolen (figurer) S1 och S2 g-n). Sammantaget visade dessa data att både DsbA-L och VDAC1 medierade progressionen av septisk AKI.

12. VAN-inducerad njurskada försvagades i PT-DsbAL-KO- eller PT-VDAC1-KO-möss

Vankomycin (VAN)-inducerad AKI är också en viktig modell för AKI. Kullkamraterna till PT-DsbA-L eller VDAC1-WT och PT-DsbA-L eller VDAC1-KO injicerades intraperitonealt med VAN (600 mg/kg) under 7 dagar i följd. Resultaten visade att PT-DsbA-L- eller VDAC1-KO-möss markant minskade den VAN-inducerade höjningen av BUN- och kreatininnivåer, njurvävnadsskada och njurcellsapoptos (figur S3 och S4 an-f). Immunoblotanalyser bekräftade vidare att PTDsbA-L- eller VDAC1-KO-möss också visade minskade nivåer av klyvt kaspas-3, en lägre grad av Bax-ackumulering i mitokondrierna och lägre hastigheter för Cyt-c-frisättning i cytosol (figurerna S3 och S4 g-m). Sammanfattningsvis visade dessa data att både DsbA-L och VDAC1 förmedlade VAN-inducerad AKI.

Cistanche-extrakt

13. DsbA-L-medierad I/R-inducerad HK-2-cellsapoptos var associerad med VDAC1

Resultatet ovan fann att DsbA-L var involverat i BUMPT-cellernas apoptos, men funktionen av DsbA i humana njurrörsceller förblir oklar. DsbA-L siRNA transfekterades in i HK2-celler och exponerades sedan för ATP-utarmning i 2 timmar och återhämtning i 2 timmar. Immunoblotresultaten visade att DsbA-L siRNA avsevärt förbättrade I/R-inducerad ökning av klyvt caspas-3 och VDAC1-uttryck, den ökade ackumuleringen av Bax i mitokondrierna och den ökade produktionen av Cyt-c in i cytosolen ( Figur S5 an- h). Data antydde också att rollen av DsbA-L i HK2-cellapoptos var relaterad till VDAC1 under I/R-behandling.

14. DsbA-L-medierad I/R-inducerad HK-2-cellsapoptos är beroende av VDAC1

För att ytterligare verifiera om rollen av DsbA-L i HK2-cellapoptos är beroende av VDAC1. Först samtransfekterades HK2-celler med DsbA-L siRNA plus med eller utan VDAC1-plasmid och exponerades sedan för ATP-utarmning i 2 timmar och återhämtning i 2 timmar. Immunoblotresultaten indikerade att DsbA-L siRNA markant försvagade I/R-inducerad ökning av klyvt caspas-3 och VDAC1-uttryck, den ökade ackumuleringen av Bax i mitokondrierna och den ökade produktionen av Cyt-c in i cytosolen, denna effekt vändes av överuttrycket av VDAC1-plasmiden (Figur S6a-h). För det andra samtransfekterades HK2-celler med VDAC1 siRNA plus med eller utan DsbA-L-plasmid och exponerades sedan för I(2 h)/R(2 h). Immunoblotresultaten visade att VDAC1 siRNA avsevärt förbättrade I/R-inducerad ökning av klyvt caspas-3 och VDAC1-uttryck, den ökade ackumuleringen av Bax i mitokondrierna och den ökade produktionen av Cyt-c i cytosolen, denna effekt förstärktes inte av överuttrycket av DsbA-L-plasmid (Figur S7a-h). Data verifierade tydligt att VDAC1 medierade pro-apoptosrollen för DsbA-L i HK-2-celler under I/R-behandling.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h och Dongshan Zhang a,b *

en avdelning för akutmedicin, Folkrepubliken Kina

b Emergency Medicine and Difficult Diseases Institute, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Folkrepubliken Kina

c Oftalmologiska avdelningen, Folkrepubliken Kina

d Urinkirurgiska avdelningen, Folkrepubliken Kina

e Department of Chest Surgery, Folkrepubliken Kina

f Department of General Surgery, Andra Xiangya-sjukhuset, Folkrepubliken Kina

g Institutionen för folkhälsa, Central South University, Changsha, Hunan, Folkrepubliken Kina

h Department of Endocrinology, Shenzhen People's Hospital, The Second Clinical Medical College vid Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Folkrepubliken Kina

1 Xiaozhou Li och Jian Pan bidrog lika mycket till denna studie