Del Ⅱ: Tubulär mitokondriell AKT1 aktiveras under ischemi-reperfusionsskada och har en kritisk roll i predisposition för kronisk njursjukdom.
Apr 04, 2023
Förstärkning av njurtubuli mitokondriell AKT1 skyddad mot AKI och efterföljande CKD
Eftersom hämning av AKT1 i njurepitelceller förvärrar njurfunktionen och djurens överlevnad efter IRI, undersökte vi nästa om förbättrad tubulär mitokondriell AKT1-signalering kunde skydda njuren från IRI. För detta ändamål genererade vi en två-gen-muslinje med det tubulära cellspecifika uttrycket av tam-inducerad mitokondrieinriktad konstitutivt aktiv AKT1 (mcaAKT) (KMCAKT-möss) med samma strategi som vi utvecklade för KMDAKT-möss. Western blot-resultat visade att i mitokondrierna hos TAM-KMCAKT-möss uttrycktes konstitutivt aktiv AKT1 specifikt i njuren, medan den var frånvarande och njurspecifik i kontrollmöss. Som tidigare, för att verifiera att mutant AKT1 är lokaliserad till mitokondrier i tubuli, visade immunfluorescensfärgning samlokalisering av mutant AKT1 och mitokondrier. Mutant AKT1 detekterades inte utanför tubuli. för att bedöma mcaAKT-aktivitet jämförde vi AKT1-enzymaktivitet i mitokondrier isolerade från TAM- och majsoljebehandlade möss. Som förväntat ökade njurmitokondriell AKT1-aktivitet signifikant i TAM-KMCAKT-möss.
För att undersöka om förbättring av tubulär mitokondriell AKT1 kunde förbättra resultatet av IRI i TAM-KMCAKT och majsolja-KMCAKT-möss med ensidig IRI medan kontralateral Nx inducerade AKI. serum BUN var förhöjd i majsolja-KMCAKTmöss dag 7 och 45 efter IRI jämfört med TAM-KMCAKT-möss (p=0.03). Cr var signifikant lägre i TAM-KMCAKT-möss dag 2, 7 och 45 efter IRI. Dessa resultat tyder på att förstärkning av mitokondriell AKT i njurtubuli försvagade IRI-inducerad AKI och förbättrade försämringen av njurfunktionen och efterföljande utveckling av CKD. Histologi av dessa möss visade att njurskada var allvarligare hos möss som injicerades med majsolja. Jämfört med TAM KMCAKT-njurar hade den tubulära skadan högre Jablonski-poäng, förlust av tubulär borstkant, tubulär lysis och mer intra-tubulärt luminalt skräp (p=0.038). Masson trikromfärgning visade minskad fibrotisk yta (procent) i TAM-KMCAKT-möss efter IRI (p<0,001). det fanns mindre tubulär skada och lägre KIM-1-uttryck i TAM-KMCAKT-njurarna. TUNEL-analysen visade ökade apoptotiska celler i majsoljaKMCAKTnjurar efter IRI. Hos TAM-KMCAKT-njurar minskade tubulär apoptos med 52 procent och glomerulär apoptos med 46 procent (p=0.0064 och p=0.0021). aktivering av Caspase 3 och 9 hämmades på motsvarande sätt genom aktivering av mitokondriell AKT1 i tubuli. Svårighetsgraden av glomeruloskleros bedömd med PAS-färgning minskade med 38 procent (p=0.001) hos TAM-KMCAKT-möss jämfört med majsoljaKMCAKTmöss 45 dagar efter IRI. Förstärkning av renal tubulär mitokondriell AKT1 skyddar således njuren från IRI-inducerad tubulär apoptos, förhindrar ackumulering av skräp i tubuli och dämpar glomerulär skada efter tubulär skada.
Kaplan-Meier överlevnadsanalys användes för att bedöma om de tidigare nämnda njurhistologiska och funktionella förändringarna kunde sluta sig till överlevnad. Faktum är att överlevnaden för TAMKMCAKT-möss efter IRI var mycket högre än för majsolja KMCAKT-möss (76,9 procent mot 20,8 procent, p<0,001). Detta tyder på detmanipulation av tubulär mitokondriell AKT1-signalering kan betraktas som ett potentiellt mål för att utveckla nya terapeutiska metoder för att förbättra resultaten.
Klicka här för att hämtaCistanche-extraktprodukter
Mitokondriell AKT1-modulerad mitokondrierandning och ATP-produktion i njurtubuli
För att undersöka den direkta rollen av mitokondriell AKT1 i renala tubulära epitelceller, isolerade vi primära renal tubulära epitelceller (RTE) från KMDAKT-möss. Analys av cellpreparat med en antikropp mot den proximala tubulära epitelcellsmarkören aquaporin 1 (aquaporin1) visade att 97 procent av RTE-cellerna uttryckte denna markör (genom direkt cellräkning under mikroskop). 72 timmar efter 4-OH TAM eller vektorbehandling färgades RTE-celler först med mitotisk spårämne rött och immunfärgades sedan med anti-his-tag-antikropp (grön). Det fanns ingen His-Tag-signal i vektorbehandlade celler, i överensstämmelse med den förväntade frånvaron av mdnAKT-uttryck. Däremot har His-Tag detekterats i 4-OH TAM-behandlade celler och samlokaliserats med Mitotracker Red.
För att analysera hur mitokondriell AKT1-signalering reglerar RTE-cellsbioenergetik, använde vi en hippocampal extracellulär analysator för att bedöma mitokondriell funktion. OCR indikerar det uppmätta värdet av oxidativ andning. Den totala basala andningen för KMDAKT RTE-celler behandlade med 4-OH TAM var signifikant högre än kontrollen (p<0.001). den alternativa andningsprofilen för KMDAKT RTE-celler odlade med 4-OH TAM var också högre än kontrollen (p={{0}}.00076). den ATP-beroende andningsprofilen för KMDAKT RTE-celler odlade med 4-OH TAM var signifikant högre än kontrollen (p<0,001). högre protonläckage i 4-OH TAM-behandlade KMDAKT RTE-celler indikerade okopplad andning (p<0,001). minskad ATP-produktion i KMDAKT-härledda RTE-celler efter 4-OH TAM-induktion. tam-inducerad cellulär lipidperoxidation var signifikant högre, vilket tyder på förhöjd ROS. Förändringarna i oxidativ fosforylering orsakades inte av förändringar i mitokondrieinnehållet i dessa celler. Men i TAM-KMDAKT njurar observerade vi högre nivåer av Drp1, en markör för mitokondriell fission, vilket tyder på att mitokondriell dynamik är reglerad. Dessa resultat tyder på att hämning av mitokondriell AKT1-signalering leder till respiratorisk okopplad mitokondriell dysfunktion, vilket tillsammans med minskad ATP-produktion förvärrar apoptos i KMDAKT-njurar under IRI.
Vi undersökte också hur aktiveringen av mitokondriell AKT1 reglerar oxidativ fosforylering i RTE-celler isolerade från KMCAKT. Resultaten visade motsatt effekt av mitokondriell AKT1 jämfört med KMDAKT RTE-celler. Basal andning, alternativ andning, ATP-beroende andning, protonläckage och glykolytisk potential var lägre i celler odlade med 4OH-TAM. Dessa fynd tyder på att aktivering av mitokondriell AKT1 ökar effektiviteten av oxidativ fosforylering och minskar respiratorisk frånkoppling. drp1-analys visade lägre drp1-färgning i TAM-KMCAKT-njurar, vilket ytterligare bekräftar högre drp1 i TAM-KMDAKT-njurar och involveringen av mitokondriell AKT1 i regleringen av mitokondriell dynamik.
Cistanche pulver
Diskussion
Den aktuella studien visar att IRI inducerar akut aktivering och translokation av AKT1 i mitokondrierna hos proximala tubulära epitelceller. Aktivering av mitokondriell AKT1 i den proximala tubuli som svar på IRI verkar representera en självskyddande mekanism under ischemi-reperfusion. Detta beror på att hämning av tubulär mitokondriell AKT1 förvärrar AKI och främjar den efterföljande utvecklingen av CKD efter IRI. Omvänt skyddade förbättrad tubulär mitokondriell AKT1-signalering njuren från IRI och försvagade utvecklingen av CKD. Dessa data identifierar en ny roll för den tubulära mitokondriella AKT1-signalvägen under utvecklingen av njursvikt efter njurischemi-reperfusion.
Mitokondriernas roll i njurtubuli AKI
De flesta av de renala mitokondrierna är belägna i de proximala tubuli. Mitokondrier fungerar som den huvudsakliga organellen som metaboliserar ATP-produktionen av näringsämnen. Mitokondriell AKT1 reglerar cellulär oxidativ fosforylering, ROS-produktion och cellöverlevnad. Som visas i denna studie producerar nedsatt mitokondriell AKT1-signalering okopplad andning och minskar ATP-produktion. Även om renal tubulär apoptos är ett vanligt fynd i olika AKI-modeller, förblir signalvägar uppströms från mitokondrierna ofullständigt förstådda. Renal IRI leder till induktion av apoptotiska gener och aktivering av kaspaser och endonukleaser, vilket bidrar till induktionen av apoptotisk njurtubulär cellskada och död tros vara en nyckelfaktor i utvecklingen av AKI. Dessutom tros tubulär reparation och regenerering vara huvudhändelserna i AKI-återhämtning. Även om den subletala skadan kan vara reversibel, leder tubulär celldöd till den oundvikliga förlusten av tubulär funktion In vitro- och in vivo-modeller, har aktivering av begåvade apoptotiska vägar i AKI inklusive Bcl-2-proteinfamiljen och mitokondriella apoptotiska mekanismer karakteriserats . Frånvaron av mitokondriella transmembrana elektrokemiska gradienter tros vara en nyckelkontrollpunkt för att utlösa apoptos. Mitokondriellt protonläckage, reglerat av mitokondriell AKT1, kombinerat med minskad ATP-syntes i detta energikrävande organ kan bidra till den övergripande balansen av signalering till förmån för apoptos .
Standardiserad Cistanche
Överhörningen mellan renala tubuli och glomerulus
Anatomiskt kan tubulär interstitiell skada leda till förträngning av den glomerulära-tubulära övergången och eventuell bildning av tubulära glomeruli, dvs dysfunktion av glomerulära tubulära epitelceller utan uppenbar koppling till tubuli, kompression och obstruktion av intilliggande tubuli av interstitiell matris och transformation av murala epitelceller till fibroblastliknande celler är potentiella mekanismer för bildning av tubulära glomeruli. Ofullständig reparation av RTE kan förekomma i den proximala RTE, särskilt i S1-regionen, som är känslig för ischemisk skada vid njurskada, vilket leder till tubulär atrofi och interstitiell fibros.
Tubulär skada kan påverka glomerulär filtrationsfunktion genom tubulär-glomerulär återkoppling. Tubulär återkoppling är en fysiologisk överhörningsmekanism mellan tubuli och glomerulus. Lite är känt om händelseförloppet efter AKI och sambandet mellan glomerulär filtrationshastighet och tubulära förändringar. I en klinisk studie antydde omfattande bildning av tubulära glomeruli hos patienter med allvarlig njurartärstenos att kronisk ischemi kan leda till strukturella skador och sönderfall av njurtubuli. Å andra sidan finns det gott om bevis för att renal tubulär dysfunktion kan leda till förlust av tubulär cellpolaritet, förlust av gap junctions, tubulär celldöd, efterföljande tubulär obstruktion och retrograd glomerulär skada.
Våra resultat ger nya insikter om hur mitokondrier är involverade i försvaret mot IRI-inducerad njurskada. hämning av mitokondriell AKT1 under IRI leder till aktivering av kaspaser och tubulär celldöd, vilket kan utlösa retrograd glomerulär apoptos, glomeruloskleros och njurfibros. Aktivering av mitokondriell AKT1 kan spela en viktig roll i övergången från AKI till CKD, eftersom hämning av mitokondriell AKT1 under IRI signifikant påverkar BUN/Cr 45 dagar efter initial IRI.
Övergången från AKI till CKD
Den exakta mekanismen för övergången från AKI till CKD är oklart. Histologiskt är både AKI och CKD förknippade med renal tubulär skada Under många år har det varit känt att renal tubulär interstitiell patologi är ett kännetecken för många typer av CKD. Störning av intracellulär signalering i njurtubuli tros spela en roll i initieringen och progressionen av AKI till CKD.
Vid CKD aktiveras signalvägen för transformerande tillväxtfaktor (TGF) och främjar glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros genom att inducera produktionen av profibrotiska extracellulära matrisproteiner. Rollen för TGF-signalering i AKI är dock inkonsekvent över experimentella modeller. Våra data visar inte. ökat TGF-uttryck. Hypoxi aktiverar hypoxiinducerbar faktor (HIF) för att reglera gentranskription i AKI, och övergripande uttryck av HIF i olika experimentella system utövar en återskyddande effekt men andra studier har misslyckats med att bekräfta den återskyddande rollen för HIF-1.
Cistanche-tillskott
Aktuella bevis tyder på att mitokondrier kan vara nyckelregulatorer i övergången från AKI till CKD. Ablation av pro-apoptotisk BAK och BAX förbättrar ischemisk och cisplatininducerad AKI. hämning av mitokondriell fragmentering har visat sig dämpa svårighetsgraden av ischemisk AKI hos diabetiska möss i en modell av ischemisk och nefrotoxisk AKI associerad med hög aktivering av mitokondriell apoptos CKD-relaterad hämning av mitokondriell funktion och biogenes sensibiliserar njurceller och vävnader mot AKI. återhämtning av AKI. Vid CKD uppstår även renal mitokondriell dysfunktion under uppkomsten och progressionen av CKD. Vid CKD inducerar hög glukos- och albuminöverbelastning apoptotisk mitokondriell signalering i njurceller. Vid diabetes-inducerad experimentell CKD är mitokondriell fragmentering resultatet av patologiska förändringar i mitokondriell fusion och fission.
Identifieringen av renal tubulär interstitiell histopatologi i patogenesen av CKD förskjuter Glomerulus Central-paradigmet för njurskada till ett nytt fokus på den patofysiologiska rollen av den proximala tubuli i AKI och dess patogenes mot CKD,s. Våra resultat tyder på att mitokondriell AKT1 indirekt kan förhindra utvecklingen av glomeruloskleros genom att upprätthålla den strukturella och funktionella integriteten hos njurtubuli. Data som tillhandahålls i denna studie hjälper till att fylla en viktig lucka i kunskap om rollen av proximala renala tubulära mitokondrier i AKI och dess efterföljande övergång till CKD genom att aktivera och translokera AKT1 till mitokondrierna. Framtida studier bör bekräfta rollen av mitokondriell AKT1 i mänsklig njurskada och utforska potentiella mål i den mitokondriella AKT1-signalvägen som kan användas för att förbättra resultatet av njursvikt.
REFERENSER
1. Su CC, Yang JY, Leu HB, et al. Mitokondriell Akt-reglerad mitokondriell apoptossignalering i hjärtmuskelceller. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;302(3):H716–23.
2. Ratliff BB, Rabadi MM, Vasko R, et al. Budbärare utan gränser: förmedlare av systemiskt inflammatoriskt svar i AKI. J Am Soc Nephrol. 2013;24(4):529–36.
3. Basnakian AG, Ueda N, Kaushal GP, et al. DNas I-liknande endonukleas i råttnjurecortex som aktiveras under ischemi/reperfusionsskada. J Am Soc Nephrol. 2002;13(4):1000–7.
4. Bonventre JV, Yang L. Cellulär patofysiologi av ischemisk akut njurskada. J Clin Invest. 2011;121(11):4210–21.
5. Kinsey GR, Sharma R, Okusa MD. Regulatoriska T-celler i AKI. J Am Soc Nephrol. 2013;24(11):1720–6.
6. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofysiologi av ischemisk akut njurskada. Nat Rev Nephrol. 2011;7(4):189–200.
7. Zarjou A, Agarwal A. Sepsis och akut njurskada. J Am Soc Nephrol. 2011;22(6):999–1006.
8. Saikumar P, Dong Z, Patel Y, et al. Roll av hypoxi-inducerad Bax-translokation och cytokrom c-frisättning vid reoxygenationsskada. Onkogen. 1998;17(26):3401–15.
9. Wei Q, Dong G, Chen JK, et al. Bax och Bak har avgörande roller vid ischemisk akut njurskada i globala och proximala tubulusspecifika knockout-musmodeller. Kidney Int. 2013;84(1):138–48.
10. Wolfs TG, De Vries B, Walter S, et al. Apoptotisk celldöd initieras under normotermisk ischemi i mänskliga njurar. Am J Transplantation. 2005;5(1):68–75.
11. Wang J, Wei Q, Wang CY, et al. Minocyklin uppreglerar Bcl-2 och skyddar mot celldöd i mitokondrier. J Biol Chem. 2004;279(19):19948–54.
12. Martinou JC, Green DR. Att bryta mitokondriella barriären. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2(1):63–7.
13. Green DR, Ferguson T, Zitvogel L, et al. Immunogen och tolerogen celldöd. Nat Rev Immunol. 2009;9(5):353–63.
14. Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitokondriell membranpermeabilisering vid celldöd. Physiol Rev. 2007;87(1):99–163.
15. Lan R, Geng H, Singha P, et al. Mitokondriell patologi och glykolytisk förskjutning under proximal tubuliatrofi efter ischemisk AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27(11):3356–67.
16. Yang L, Besschetnova TY, Brooks CR, et al. Epitelcellscykelstopp i G2/M förmedlar njurfibros efter skada. Nat Med. 2010;16(5):535–43, 1p efter 143.
17. Singh P, Okusa MD. Rollen av tubuloglomerulär återkoppling i patogenesen av akut njurskada. Bidra Nephrol. 2011;174:12–21.
18. Morrell ED, Kellum JA, Hallows KR, et al. Epiteltransport under septisk akut njurskada. Nephrol Dial Transplantation. 2014;29(7):1312–9.
19. Weichert W, Paliege A, Provoost AP, et al. Uppreglering av juxtaglomerulär NOS1 och COX-2 föregår glomeruloskleros hos hypertensiva råttor med gulhuva. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;280(4):F706–14.
20. Marcussen N Atubular glomeruli vid njurartärstenos. Lab Invest. 1991;65(5):558–65.
21. Chevalier RL. Den proximala tubuli är det primära målet för skada och progression av njursjukdom: rollen av glomerulotubular junction. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;311(1):F145–61.
22. Forbes MS, Thornhill BA, Chevalier RL. Proximal tubulär skada och snabb bildning av tubulära glomeruli hos möss med unilateral ureteral obstruktion: en ny titt på en gammal modell. Am J Physiol Renal Physiol. 2011;301(1):F110–7.
23. Galarreta CI, Grantham JJ, Forbes MS, et al. Tubulär obstruktion leder till progressiv proximal tubulär skada och tubulära glomeruli vid polycystisk njursjukdom. Am J Pathol. 2014;184(7):1957–66.
24. Grgic I, Campanholle G, Bijol V, et al. Riktad proximal tubuliskada utlöser interstitiell fibros och glomeruloskleros. Kidney Int. 2012;82(2):172–183.
25. Takaori K, Nakamura J, Yamamoto S, et al. Svårighetsgrad och frekvens av proximal tubuliskada bestämmer njurprognosen. J Am Soc Nephrol. 2016;27(8):2393–2406.
26. Linkermann A, Chen G, Dong G, et al. Reglerad celldöd i AKI. J Am Soc Nephrol. 2014;25(12):2689–701.
27. Nath KA. Tubulointerstitiell förändring som en viktig faktor för utvecklingen av njurskada. Am J Kidney Dis. 1992;20(1):1–17.
28. Loeffler I, Wolf G. Transforming growth factor-beta och progression av njursjukdom. Nephrol Dial Transplantation. 2014;29 Suppl 1(i37–i45).
29. Gewin L, Vadivelu S, Neelisetty S, et al. Att ta bort TGF-beta-receptorn dämpar akut proximal tubuliskada. J Am Soc Nephrol. 2012;23(12):2001–11.
30. Eckardt KU, Rosenberger C, Jurgensen JS, et al. Roll av hypoxi i patogenesen av njursjukdom. Blood Purif. 2003;21(3):253–7.
31. Schley G, Klanke B, Schödel J et al. Selektiv stabilisering av HIF-1alfa i tubulära njurceller med 2-oxoglutaratanaloger. Am J Pathol. 2012;181(5):1595–606.
32. Higgins DF, Kimura K, Bernhardt W, et al. Hypoxi främjar fibrogenes in vivo via HIF-1-stimulering av epitel-till-mesenkymal övergång. J Clin Invest. 2007;117(12):3810–20.
33. Jiang M, Pabla N, Murphy R, et al. Nutlin-3 skyddar njurceller under cisplatinbehandling genom att undertrycka Bax/Bak-aktivering. J Biol Chem. 2007;282(4):2636–45.
34. Brooks C, Wei Q, Cho SG, et al. Reglering av mitokondriell dynamik vid akut njurskada i cellodling och gnagarmodeller. J Clin-investeringen. 2009;119(5):1275–85.
35. Brooks C, Cho SG, Wang CY, et al. Fragmenterade mitokondrier är sensibiliserade för Bax-insättning och aktivering under apoptos. Am J Physiol Cell Physiol. 2011;300(3):C447–55.
36. Smith JA, Stallons LJ, Collier JB, et al. Undertryckande av mitokondriell biogenes genom tollliknande receptor 4-beroende mitogenaktiverat proteinkinas/extracellulär signalreglerad kinassignalering vid endotoxin-inducerad akut njurskada. J Pharmacol Exp Ther. 2015;352(2):346–57.
37. Garrett SM, Whitaker RM, Beeson CC, et al. Agonism av 5-hydroxytryptamin 1F-receptorn främjar mitokondriell biogenes och återhämtning från akut njurskada. J Pharmacol Exp Ther. 2014;350(2):257–64.
38. Whitaker RM, Wills LP, Stallons LJ, Schnellmann RG. cGMP-selektiva fosfodiesterashämmare stimulerar mitokondriell biogenes och främjar återhämtning från akut njurskada. J Pharmacol Exp Ther. 2013;347(3):626–34.
39. Granata S, Zaza G, Simone S, et al. Mitokondriell dysreglering och oxidativ stress hos patienter med kronisk njursjukdom. BMC Genomics. 2009;10:388.
40. Li X, Pabla N, Wei Q, et al. PKC-delta främjar njurtubulär cellapoptos associerad med proteinuri. J Am Soc Nephrol. 2010;21(7):1115–24.
41. Wang W, Wang Y, Long J, et al. Mitokondriell fission utlöst av hyperglykemi medieras av ROCK1-aktivering i podocyter och endotelceller. Cell Metab. 2012;15(2):186–200.
42. Lim BJ, Yang J, Zhong J, et al. Tubulointerstitiell fibros kan sensibilisera njuren för efterföljande glomerulär skada. Kidney Int. 2017;92(6):1395–403.
43. Jablonski P, Howden BO, Rae DA, et al. En experimentell modell för bedömning av renal återhämtning från varm ischemi. Transplantation. 1983;35:198–204.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Smaskiga Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
7. Institutionen för diabetes, endokrinologi och metabolism, City of Hope National Medical Center, Duarte, Kalifornien