Del 1: 3-Hydroxifenylättiksyra: en blodtryckssänkande flavonoidmetabolit

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Regelbundet intag av polyfenolrik mat har förknippats med en mängd olika positiva hälsoeffekter, inklusive förebyggande avhjärt-kärlsjukdomar. Däremot föräldernflavonoider har mestadels låg biotillgänglighet och därför har deras metaboliter antagits vara bioaktiva. En av dessa metaboliter, 3-hydroxifenylättiksyra (3-HPAA), som bildas av tarmmikrobiotan, har tidigare rapporterats utöva vasorelaxerande effekter ex vivo. Syftet med denna studie var att belysa denna effekt in vivo mer och att belysa verkningsmekanismen. 3-HPAA gav upphov till en dosberoende minskning av arteriellt blodtryck när det administrerades iv både som bolus och infusion till spontant hypertensiva råttor. Däremot observerades inga signifikanta förändringar i hjärtfrekvensen. I ex vivo-experiment, där svinhjärtan från ett slakteri användes för att minska behovet av laboratoriedjur, 3-lindrade HPAA förkontrakterade porcina kransartärsegment från svin via en mekanism som delvis var beroende av endotelets integritet. Denna avslappning var signifikant försämrad efter endotelial kväveoxidsyntasinhibering. Däremot påverkade inte blockaden av SKCa- eller IKCa-kanaler, eller muskarina receptorer, 3-HPAA-avslappning. På liknande sätt observerades inga effekter av 3-HPAA på cyklooxygenas eller kalciumkanaler av L-typ. Således minskar 3-HPAAblodtryckin vivo via kärlavslappning, och denna mekanism kan vara baserad på frisättningen av kväveoxid av endotelskiktet.

Nyckelord: flavonoider; tarmmikrobiota;metabolit;3-hydroxifenylättiksyra;blodtryck;vasorelaxation; kranskärlssjukdom; artär; råtta; gris

flavonoids cardiovascular cerebrovasular

1. Introduktion

Hjärt- och kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i världen, med ett uppskattat antal dödsfall som närmar sig 18 miljoner per år. Kranskärlssjukdom och stroke bidrar till cirka 85 procent av dessa dödliga kardiovaskulära händelser [1]. Global mortalitet och sjuklighet har föranlett implementeringen av riktlinjer för förebyggande av kardiovaskulära risker [2]. Detektering av ihållande högt arteriellt blodtryck med efterföljande behandling är en av huvudstrategierna[34]. I själva verket klassificeras högt blodtryck som en viktig riskfaktor för hjärt-kärlsjukdomar. Det orsakas mestadels av ökat systemiskt kärlmotstånd, och detta är ofta relaterat till olika strukturella och funktionella förändringar i kärlsystemet, som stör vaskulär homeostas. I synnerhet är tunica intima i blodkärlen, bildad av ett enda lager av endotelceller, dysfunktionell. Dessutom verkar de vaskulära glatta muskelcellerna ofta mer sammandragna och mindre känsliga för endotelhärledda avslappnande faktorer [5].

Flera studier har gett bevis för de skyddande effekterna av en polyfenolrik kost mot hjärt-kärlsjukdomar. Faktum är att en diet rik på frukt, grönsaker, nötter, choklad eller te, som är rika källor tillflavonoider, har associerats med en minskning av risken för hjärt-kärlsjukdomar [6]. Förutom antioxidanter, antiinflammatoriska, blodplättsdämpande och antimikrobiella egenskaper,flavonoiderbesitter också betydande vasodilatoriska egenskaper [7,8]. Flavonoidintaget över hela världen är dock mycket varierande, och när de väl intagits interagerar dessa föreningar på ett komplext sätt med mag-tarmkanalen. Kortfattat förekommer flavonoider i växter mestadels i form avglykosider. Efter administrering i form av diet hydrolyseras de under matsmältningen och detta möjliggör frisättning av aglykonformen i tunntarmen. Aglykoner kan i sin tur genomgå ämnesomsättning i tunntarmens epitel och senare i levern. Detta resulterar i en mycket dålig biotillgänglighet av moderflavonoider, vilket upprepade gånger bekräftades [9,10]. Den oabsorberade fraktionen passerar emellertid från tunntarmen in i den distala tarmen, där den klyvs av kolonmikrobiotan, vilket leder till produktion av små fenoliska föreningar, inklusive fenylpropionsyra, fenylättiksyra, bensoesyra och hydroxibensener, som sedan absorberas [ 9]. Det är anmärkningsvärt att under de senaste decennierna har det blivit tydligt att de skyddande effekterna av flavonoider i kosten tillskrivs deras metaboliter snarare än deras moderformer [10-12]. Trots det dokumenterade Booth och kollegor även i början av 1950-talet förekomsten av olika flavonoidmetaboliter, nämligen 3,4-dihydroxifenylättiksyra (DHPA), 3-hydroxifenylättiksyra (3-HPAA) och homovanillinsyror i urinen hos olika djurarter efter oralt intag avquercetin[13]; forskning om den biologiska effekten av små fenoliska metaboliter av flavonoider är mycket nyare. Specifikt, under de senaste åren har forskning om flavonoiders metaboliska öde samt studier som rapporterar bioaktiviteter av deras mikroberhärledda metaboliter blivit ett hett och intensivt undersökt ämne inom området. Vår forskargrupp har visat att flera mikrobiella metaboliter, inklusive DHPA,4-metylkatekol och 3-(3-hydroxifenyl)propionsyra, avslappnade råttans aorta sannolikt är fysiologiskt uppnåbara koncentrationer [14,15 ]. Såvitt vi vet är 3-HPAA en av de minst utforskade metaboliterna. Det har dokumenterats vara en metabolit av ett antal fenoliska föreningar inklusive olika klasser av flavonoider såsom flavonoler (quercetin med dess glykosid rutin, kaempferol), isoflavoner och flavanoler (båda oligomera procyanidiner och deras monomera enheter, katekin och epiguretechin) 1) [16-20].

1. Simplified schemes of proposed pathways for microbial degradation of different flavonoids in humans: flavanols (a) and flavonol que

Eftersom 3-HPAA slappnar av glatta muskelceller ex vivo [14], syftade denna studie till att testa om denna metabolit kan orsaka en minskning av arteriellt blodtryck in vivo och att upptäcka dess verkningsmekanism i en serie mekanistiska experiment .

10flavonoids blood lipid lowering

2. Material och metoder

2.1. Djur

In vivo-experimenten utfördes på spontant hypertensiva råttor (SHR) erhållna från den tjeckiska vetenskapsakademin, Prag, Tjeckien. Djuren föddes upp i djuranläggningen vid Farmaceutiska fakulteten och hölls vid en konstant temperatur på 23-25 grad med en 12 timmars mörker/ljus-cykel. Råttor fick en standarddiet och kranvatten ad libitum. Studien (reg. nr.4937 2019-9) godkändes av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott, i enlighet med The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicerad av US National Institutes of Health (8:e upplagan, reviderad 2011, ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Kemikalier

Pentobarbital, natriumnitroprussid, dimetylsulfoxid (DMSO), L-Nw-nitro arginin metylester(L-NAME), atropin, TRAM-34/1-[(2-klorfenyl)difenylmetyl] -1H-pyrazol, indometacin, nifedipin, bradykinin, KCl, CaCl och UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-hexahydro-5,27 :13,18:21,24-trieteno-11,7-meteno-7H-dibenso[b,m][1,5,12,16]tetraazacyklotrikosin{{ 29}},13-diumtrifluoroacetathydrat köptes från Sigma-Aldrich (Steinheim, Tyskland). Bay K8644 erhölls från Axon Medchem BV (Groningen, Nederländerna). Den testade metaboliten 3-HPAA köptes från Toronto Research Chemicals (Toronto, ON, Kanada). NaCl, NaHCO3 och D-glukos tillhandahölls av PENTA sro (Prag, Tjeckien). MgSO4.7H2O köptes från Erba Lachema sro (Brno, Tjeckien) och KH2PO4 från Dr. Kulich Pharma sro (Hradec Kralové, Tjeckien) Republik). Saltlösning köptes från Baxter Czech spol. sro (Prag, Tjeckien) och heparin från Zentiva (Prag, Tjeckien).

Natriumnitroprussid, L-NAME och atropin löstes i destillerat vatten. Stamlösningar av TRAM-34（1 mM） och UCL-1684（100 μM） framställdes som vattenlösningar kompletterade med 20 procent respektive 10 procent DMSO. En stamlösning av indometacin (1 mM) framställdes också i 10 procent DMSO/vatten, och Bay K8644 (10 mM) och nifedipin (10 mM) löstes i ren DMSO. Den slutliga koncentrationen av DMSO i vävnadskammaren var alltid<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3. In vivo-experiment

Tolv SHR-råttor (medelvikt 356 ± 21 g, blodtryck under narkos 211±64/152±45 mmHg, hjärtfrekvens 381 ± 37 bpm) bedövades ip med pentobarbital (50 mg. kg-). Tryckgivaren MLTO380/D var kopplad till den vänstra gemensamma halspulsådern, och arteriellt blodtryck med hjärtfrekvens registrerades med en Power Lab-enhet ansluten till LabChart 7-programvaran (ADInstruments, Sydney, Australien). Den vänstra saphenusvenen kanylerades för intravenös administrering av en bolus eller en infusion. Efter operationen tilläts varje råtta stabiliseras i 15 minuter före experimentet. 3-HPAA löstes upp i koksaltlösning och administrerades enligt två protokoll:(1) som en enda bolusdos från 0.001 till 10 mg kg{{18 }}(volymen som applicerades var alltid 0,1 mL, n=8); eller (2) som fyra efterföljande 5 minuter långa infusioner vid doserna 0,05, 0,25,1 och 5 mg.kg-1.min-1 （n=4） i infusionshastigheten på 50μL per minut med "Genie" Kent sprutpump (Kent Scientific Corporation, Torrington, CT, USA) (Figur 2a). I båda protokollen gavs alltid nästa dos efter att blodtrycket var stabilt i minst 5 minuter. Som kontroll behandlades varje djur med saltlösning under samma förhållanden innan den första administreringen av 3-HPAA utfördes. Efter mätningen avlivades varje råtta med iv KCl (1 ml, 1 mol·L-). Kroppstemperaturen under experimentet hölls vid 36,5 ± 0,5 grader med användning av en värmeplatta.

Graphical scheme of the performed experiments.

flavonoids antioxidant

2.4.Ex Vivo-experiment

2.4.1. Vävnadsberedning

Ex vivo-experimenten utfördes på porcina kransartärringsegment (Figur 2b). Svinhjärtan (n= 11) erhölls från ett lokalt slakteri. Grisar var friska djur av båda könen, från standarduppfödning och under veterinärkontroll, avsedda för konsumtion. Hjärtan bearbetades för experimentet cirka 4 timmar efter slakten av djuret. Hjärtorna nedsänktes i Krebs-lösningen och den vänstra cirkumflexa kransartären skars ut omedelbart, nedsänktes återigen i Krebs-lösningen och rengjordes från vidhäftande fett, bindväv och blod. Efteråt skars den renade kransartären till cylindriska ringar med en längd av ungefär 3 mm. För vissa mekanistiska experiment stördes endotelskiktet mekaniskt genom att försiktigt gnugga den luminala ytan med pincett. Ringarna hölls i vävnadsbad fyllda med Krebs-lösningen under syresatta förhållanden (95 procent O och 5 procent CO2) vid 37 grader. Varje artärring hängdes mellan två trådkrokar av rostfritt stål, en av dem fäst vid en hållare och den andra ansluten till en givare och dator utrustad med SPEL Advanced Kymograph Software, v3.2 (Experimetria Ltd., Budapest, Ungern). Detta arrangemang möjliggör mätning av isometrisk spänning. Preparaten utjämnades vid en spänning på 2 g under 40 minuter, under vilken Krebs-lösningen ersattes var 10:e minut. Därefter sattes spänningen till 1 g (baslinje), varje vävnadsbad fylldes med 5 ml av Krebs-lösningen, och följande livsduglighetstest utfördes: koronarringarna drogs samman med KCl (slutkoncentrationen inuti badet var 40 mM), och när platån uppnåddes tillsattes bradykinin (300 nM) för att bekräfta intakt endotel eller blottade ringar. Därefter tvättades kranskärlsringarna flera gånger med Krebs-lösningen.

2.4.2. Bekräftelse av den vasodilaterande aktiviteten av 3-HPAA på porcina kransartären

Den vasorelaxerande aktiviteten mättes på KCl-förkontrakterade (40 mM) artärringar (Figur 2b). När platån hade nåtts tillsattes3-HPAA kumulativt till badet i koncentrationer från 100 μM till 1 mM.3-HPAA bereddes i Krebs-lösningen. Krebs-lösningen utan den testade föreningen sattes till några kranskärlsringar som kontroll med användning av samma procedur. Varje dos applicerades efter stabilisering av det relaxerande svaret orsakat av den tidigare dosen, och natriumnitroprussid (100 μM) användes för att inducera maximal avslappning i alla experiment i slutet av proceduren.

2.4.3. Mekanistiska experiment

I följande experiment studerades mekanismen för kärlvidgande verkan av 3-HPAA på intakta endotelkransringar med användning av kväveoxid (NO) syntasinhibitor, L-NAME（100 μM）; en muskarinreceptorantagonist, atropin （50 μM）; en cyklooxygenas (COX)-hämmare, indometacin (10 μM); eller de mellanliggande och små konduktans Ca2 plus -aktiverade Kt-kanalhämmarna, TRAM-34(10 μM) respektive UCL-1684 (1 μM) (Figur 2b). Atropin eller inhibitorer tillsattes alltid 30 minuter före tillsatsen av KCl (40 mM). Efteråt, i ett separat experiment, undersöktes involveringen av vaskulära Cay1.2 Ca2 plus-kanaler (L-typ) på 3-HPAA-inducerad vasorelaxation genom att förbehandla endoteldekoronära kransringar med 15 mM KCl följt av inkubation med 3-HPAA i en koncentration av 1 mM under 30 min. Sedan applicerades en kalciumkanalaktivator av L-typ, Bay K8644, kumulativt (100 pM-10μM) i mörker för att inducera ett kontraktilt svar. KCl (80 mM) användes för att inducera maximal kontraktion. Ringar inkuberade med motsvarande volym av vehikeln (Krebs-lösningen) användes som negativa kontroller. Dessutom användes ringar inkuberade med den kända kalciumkanalhämmaren nifedipin av L-typ (150 nM) som positiva kontroller. De undersökta målproteinerna och liganderna som används i de mekanistiska experimenten sammanfattas i tabell 1.

Target proteins investigated in the 3-hydroxyphenylacetic acid(3-HPAA) mechanistic studies and the ligands used in the ex vivo experiments on the porcine coronary artery

2.5. Dataanalys

GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) användes för dataanalys. För in vivo-experiment jämfördes skillnader mellan individuella bolusdoser av 3-HPAA och kontroll (saltlösning) med användning av en envägs ANOVA, följt av Dunnetts post hoc-test. För infusioner användes en tvåvägs ANOVA följt av Dunnett post hoc-testet. För de mekanistiska ex vivo-experimenten jämfördes resultaten med användning av ett oparat t-test. För experiment med Bay K8644 användes tvåvägs ANOVA följt av ett Dunnett-test för flera jämförelser. Data visas som medelvärde ± SEM.

flavonoids anti-inflammatory

3. Resultat

3.1. Effekten av 3-HPAA på blodtrycket och hjärtfrekvensen in vivo i SHR

3.1.1. Enstaka bolusadministrering

En signifikant minskning av medel-, systoliskt och diastoliskt blodtryck observerades efter bolusadministrering av {{0}}HPAA i doser från 0.01 till 10mg.kg-' (Figur 3 och S1). Minskningen av systoliskt blodtryck var uppenbar från en dos på 0,1 mg. kg-I (Figur 3a), medan det diastoliska blodtrycket sjönk signifikant även från en 10 gånger lägre dos (0,01 mg. kg-') (Figur 3b). I samma experiment hittades ingen effekt på hjärtfrekvensen vid någon av de 3-HPAA-doser (Figur S2).

Changes in arterial systolic (a) and diastolic (b) blood pressures after bolus i.v. administration of 3-hydroxyphenylacetic acid (doses ranging from 0.001 to 10 mg·kg−1 ) expressed as percent change from the initial value in spontaneously hypertensive rats (n = 8). Significant change: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 vs. sa

3.1.2. Infusionsadministration

De 5 minuter långa infusionerna av 3-HPAA resulterade i en minskning av genomsnittligt, systoliskt och diastoliskt blodtryck (fullständiga resultat i figur S3). Effekten var dosberoende och nådde maximalt ca. 50 procent. Signifikanta förändringar producerades av de två högsta doserna, 1 och 5 mg·kg -1.min-I (Figur 4). Dessutom, i det här fallet, hittades inga signifikanta förändringar i hjärtfrekvensen (Figur S4).

3.2. Bekräftelse av de vasodilaterande egenskaperna hos 3-HPAA på porcin kransartär

I ex vivo-experiment inducerade 3-HPAA vasodilatation av gris kransartär på ett dosberoende sätt (Figur 5). Med undantag för den första dosen observerades vasodilatation. Resultaten var emellertid endast signifikanta för den högsta koncentrationen (1 mM). Samma koncentration användes för ytterligare mekanistisk testning ex vivo.

Figure 4. Effect of 3-hydroxyphenylacetic acid (1 and 5mg.kg-.min-1)infusions on systolic blood pressure(a) and diastolic blood pressure(b)in spontaneously hvpertensive rats (n =4). Significant change: p<0.05.

Figure 5. Confirmation of the vasodilatory effects of 3-hydroxyphenylacetic acid (3-HPAA)in porcine coronary arterial rings (n =6).Data are expressed as % from the maximal relaxation induced by sodium nitroprusside(100 uM).Significant change:***p<0.001 vs.control, ns—not significant.

3.3. Mekanismen för de vaskulära effekterna av 3-HPAA studerade ex vivo på porcin kransartär

För att undersöka mekanismerna bakom den 3-HPAA-inducerade vasodilatationen, jämförde vi dess effekter på endotelintakta och endotelavslöjade kransartärringar hos grisar, förkontrakterade med KCl. Endotelavlägsnandet minskade den vasodilaterande effekten (Figur 6b). Efter detta fynd testades involveringen av endotelial NO. Förbehandling med en hämmare av eNOS, L-NAME (100 uM), resulterade också i en signifikant minskning av 3-HPAA-inducerad vasodilatation (Figur 6c). Däremot analog förbehandling av kranskärlsringar med muskarinreceptorantagonist atropin (50 uM), eller med IKCa- eller SKCa-kanalblockerare, TRAM-34(10 μM) och UCL-1684(1 μM）, respektive, eller med COX-hämmaren, indometacin (10 μM) orsakade inte några förändringar i vasodilatation producerad av 3-HPAA(Figur 6d-g). Slutligen bestämde vi oss för att undersöka om 3-HPAA kan verka genom hämning av Cay1.2-kalciumkanaler (L-typ) på vaskulära glatta muskelceller. Förbehandling av ringarna med 3-HIPAA(1 mM) hade ingen signifikant effekt på kontraktion inducerad av kumulativa doser av Bay K8644（100 pM-10 μM) (Figur 7), medan inkubation med den kända Cav1.2 kalciumkanalhämmaren (L-typ) nifedipin (150 nM) signifikant reducerade sammandragningarna (positiv kontroll).