Faderns nikotin förbättrar rädslaminnet, minskar nikotinadministrationen och förändrar Hippocampus genetiska och neurala funktion hos avkommor

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2Department of Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4Institutionen för neurobiologi och beteende, University of California Irvine, Irvine, Kalifornien

5Bioinformatik, biokemi och molekylärbiologi, Penn State University, University Park, PA

6 Institutionen för psykologi, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstrakt

Nikotinbruk är fortfarande mycket utbrett med tobak och e-cigarettprodukter som konsumeras över hela världen. Men ökande bevis på transgenerationellt epigenetiskt arv tyder på att nikotinanvändning kan förändra beteende och neurobiologi i efterföljande generationer. Vi testade effekterna av kronisk faderlig nikotinexponering i C57BL6/J-möss på rädslakonditionering hos F1- och F2-avkommor, såväl som betingad rädslautrotning och spontan återhämtning, självadministration av nikotin, hippocampus kolinerg funktion, RNA-uttryck och DNA-metylering i F1 avkomma. Faderns nikotinexponering associerades med förbättrad kontextuell och cued rädslakonditionering och spontan återhämtning av släckta rädslor. Vidare reducerades nikotinförstärkningen hos möss av nikotin, som bedömts i ett självadministrationsparadigm. Dessa beteendefenotyper kopplades med förändrat svar på nikotin, uppreglerad hippocampus nikotinacetylkolinreceptorbindning, minskade framkallade hippocampala kolinerga strömmar och förändrad metylering och uttryck av hippocampala gener relaterade till neural utveckling och plasticitet. Analys av genuttryck antyder effekter på flera generationer på bredare gennätverk som potentiellt är involverade i neuroplasticitet och psykiska störningar. Förändringarna i rädslakonditionering antyder på liknande sätt fenotyper som är analoga med ångeststörningar som liknar posttraumatisk stress.

NYCKELORD: kolinerg, hippocampus, inlärning, multigenerationell, nikotin, transgenerationell

effekterna av cistanche

1. INTRODUKTION

Ackumulerande bevis tyder på att effekterna av exponering för missbruk av droger sträcker sig bortom individen för att påverka fysiologiska och beteendemässiga fenotyper hos oexponerade avkommor.1-3 Karakterisering av nikotinets effekter över generationer är avgörande med tanke på förekomsten av användning av tobaksprodukter4 och den dramatiska ökningen av e-cigarettanvändning.5 Genom sina effekter på hjärnans kolinerga system ger nikotinexponering markanta förändringar i hjärnans funktion som kan ligga bakom nikotinberoende och bidra till ökad risk för psykiatriska störningar, inklusive depression6 och ångest.7 Epigenetiska modifieringar nedströms kolinerg aktivering kan tillåta ihållande effekter på cellulär och kretsfunktion.8,9 Tills nyligen trodde man att dessa epigenetiska modifieringar raderades vid etableringen av könslinjen och sålunda sekvestrerade från efterföljande generationer. Emellertid kan epigenetiska modifieringar, inklusive DNA-metylering, posttranslationella histonmodifieringar och icke-kodande RNA, förvärvade i en generation, ärvas i nästa generation.10,11 Dessa epigenetiska modifieringar kan förmedla multigenerationella och transgenerationella effekter av föräldrarnas nikotinexponering på avkommans beteende och neurobiologi .

Gnagarstudier från flera oberoende laboratorier har börjat identifiera multigenerationella och transgenerationella konsekvenser av föräldrarnas nikotinexponering. Detta arbete har hittills identifierat effekter av föräldrarnas nikotinexponering på depressiva och ångestliknande fenotyper,1 kognitiv flexibilitet,2 ADHD-liknande beteenden,3 och genuttryck.1,2 De multigenerationella och transgenerationella konsekvenserna av nikotinexponering kan påverka endofenotyper som är involverade i nikotinberoende och mental hälsa. Vi har till exempel visat att nikotinexponering modulerar kontextuell rädsla, en modell av hippocampusberoende rädslalärning som är relaterad till sårbarhet för psykiska störningar som posttraumatisk stressyndrom (PTSD) och beroende.12-14 Nikotins sjukdom. effekter på inlärning av kontextuell rädsla moduleras av hippocampus.15,16 Vi har funnit att akut nikotinexponering förstärker hippocampusberoende inlärning av rädsla,15,17 försämrar utrotning av kontextuell rädsla,18,19 och förstärker spontan återhämtning av kontextuell rädsla efter utrotning.18 Emellertid har de multigenerationella och transgenerationella effekterna av faderns nikotinexponering på dessa fenotyper inte studerats. Dessutom har inga tidigare studier karakteriserat nikotinets multigenerationseffekter på kolinerg funktion. Multigenerationellt arv avser fenotyper som uppstår i generationen omedelbart efter exponerade individer, medan transgenerationellt arv består av könslinjemedierat nedärvning av epigenetisk information mellan generationer i frånvaro av direkt miljöpåverkan som leder till fenotypisk variation.11 Här undersökte vi både multigenerationellt arv. och transgenerationella effekter av faderlig nikotinexponering på kontextuell och inlärning av rädsla i F1- och F2-generationen samt på självadministration av nikotin, bindning av hippocampus nikotinacetylkolinreceptor (nAChR), hippocampus kolinerg funktion, hippocampus genuttryck och hippocampus DNA-metylering F1-generationen. Vi antar att faderns nikotinexponering kommer att påverka rädslakonditionering, hippocampus genuttryck och funktion hos avkommor och grand-avkomma.

effekter av cistancheextrakt

2 METODER OCH MATERIAL

2.1 Ämnen

Försökspersonerna var manliga och kvinnliga C57BL/6J-möss (8-20 veckor gamla, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Med undantag för inhysning för haremsuppfödning, var alla djur inhysta i grupp med en 12-timmars ljus/mörkercykel och ad libitum tillgång till mat och vatten. Under självadministrering begränsades försökspersonerna till 85 procent till 90 procent av sin kroppsvikt som äter gratis, och vatten tillfördes ad libitum. Alla beteendetester ägde rum mellan 9:00 AM och 6:00 PM. Alla procedurer utfördes i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkända av Penn State University, Temple University eller University of California Irvine IACUC-kommittéer.

2.2 Faderns nikotinexponering

Hanar (8 veckor) fick 0,9 procent steril koksaltlösning eller nikotinvätetartratsalt (12,6 mg/kg/dag, fri basvikt—Fisher Scientific, Waltham, MA eller MP Biomedical, Santa Ana, CA) löst i 0,9 procent steril koksaltlösning, tillförd subkutant via osmotiska minipumpar (Alzet, modell 1004, Durect, Cupertino, CA) i 28 dagar. Denna dos producerar nikotin- och kotininnivåer i plasma som är jämförbara med de som ses hos måttliga rökare.20,21

2.3 Generering av F1- och F2-möss

Halveringstiden för nikotin hos möss är cirka 6 minuter.22 Det har tidigare visat sig att effekterna av nikotinabstinens försvinner 4 dagar efter nikotinavlägsnande.23-25 Därför, en 4-dagars fördröjning mellan nikotinbehandling och avel implementerades för att säkerställa systemisk eliminering av nikotin före avel. Hanmöss placerades i burar med två naiva C57BL/6 J-honor (8-20 veckor gamla) under 2 veckor för att generera F1-avkommor. F2-möss genererades genom att para naiva F1-hanmöss med naiva honor.

2.4 Rädsla konditionering

Procedurer för rädslakonditionering och utrotning har beskrivits i detalj tidigare.19 I korthet tränades och testades möss i bullerdämpande kammare (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB bakgrundsljud; MED Associates, St. Albans, VT). F1- och F2-möss var rädslakonditionerade med två konditionerade stimuli (CS, 30 s, 85-dB vitt brus)-okonditionerade stimulus (USA, 2 s, 0,57-mA fotchocker) separerade med 120 sekunder. För att undersöka de akuta effekterna av nikotin på rädslakonditionering hos F1- och F2-möss, fick avkomman akut nikotin (0,09 mg/kg, NIC fribasvikt, ip; nikotinvätetartratsalt, Fisher Scientific) eller saltlösning (SAL) 2 till 4 minuter innan till tränings- och testtillfällen. Tjugofyra timmar efter träningen återfördes mössen till träningskontexten i 5 minuter för att bedöma kontextuell frysning. Efter kontextuell testning placerades mössen i distinkta kammare för att bedöma inlärning av rädsla. Experimentörer förblindade för tillstånd som bedömdes frysning, definierat som frånvaron av frivillig rörelse förutom andning, via en opartisk tidsprovtagningsmetod.19 För att undersöka potentiella takeffekter under cued-testning fick en separat kohort av F1-möss identisk träning med endast en CS‐US parning och kontextuell utrotning av rädsla och spontan återhämtning undersöktes också. Utrotning av rädsla inträffade under fem på varandra följande sessioner som började dagen efter kontextuella och cued-rädslatestningar. Efter den sista utrotningssessionen lämnades mössen ostörda i sina hemburar i 7 dagar och testades sedan igen i träningssammanhang för spontan återhämtning. För att avgöra om några observerade skillnader i rädslakonditionering berodde på skillnader i chockkänslighet, ångest eller mer omfattande inlärningsbrist, testades manliga och kvinnliga NIC- och SAL-Sired djur dessutom i ett öppet fält, chockkänslighet, förhöjd plus labyrint ( EPM), och nya paradigm för objektigenkänning (se Stödinformation för fullständiga metoder och resultat).

2.5 Självadministrering av mat och intravenös nikotin

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pellets per session under tre efterföljande sessioner), försökspersonerna kateteriserades i halsvenen under isofluran (1 procent ‐3 procent)/syreånga anestesi, som tidigare beskrivits.26 Möss fick mer än eller lika med 72 timmar att återhämta sig från operationen innan de fick tillträde att svara igen för en matbelöning. Återetableringen av matreagerande säkerställer att mössen har återhämtat sig tillräckligt efter intravenös kirurgi och uppvisar normal operant respons efter en fördröjning av tillgången till de operanta kamrarna. Mössen tilläts sedan förvärva intravenös (IV) nikotin självadministration under 1-timmes dagliga sessioner, 6 till 7 dagar per vecka (nikotinvätetartratsalt löst i 0,9 procent steril koksaltlösning, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infusion, fri basvikt; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotin tillfördes av en Razel sprutpump (Med Associates). Varje session hade två infällbara spakar (en aktiv, en inaktiv). Slutförandet av svarskriterierna på den aktiva spaken resulterade i leverans av en IV nikotininfusion (0.{{20}}3 ml infusionsvolym; schema FR5TO20 sek.). Svar på den inaktiva spaken registrerades men hade inga planerade konsekvenser. Efter åtta insamlingssessioner med 0,03 mg/kg/infusion ändrades infusionsdosen till 0,1 mg/kg/infusion under sex sessioner. För varje dos användes medelintaget för de tre senaste sessionerna för statistiska analyser. Katetrar spolades dagligen med fysiologisk steril koksaltlösning (0,9 % vikt/volym) innehållande heparin (100 USP-enheter/ml). Kateterns öppenhet verifierades med Brevital (metohexitalnatrium, Eli Lilly, Indianapolis, IN) efter självadministrationsfasen för nikotin. För att bedöma återfallsrelaterat beteende testades mössen för inkubation av sug efter sessionen omedelbart efter den sista 0,1 mg/kg/infusionsdosen av IV nikotin självadministrering; i denna procedur tillåts mössen svara på den aktiva spaken men får inga infusioner av nikotin. På den första baslinjeinkubationssessionen (dag 1) placerades mössen i operanta kammare under FR5TO20 sek-schemat med kontingent signalljusaktivering. Därefter hölls mössen i hemmaburar i 20 dagar. På dag 21 av avhållsamhet undersöktes mössen med avseende på inkubation av begär, med det aktiva pekljuset som levererades under schemat FR5TO20 sek. Studier utfördes av experimentörer som var blinda för gruppförhållanden och beteendesvar registrerades automatiskt av MedAssociates-programvaran.

2.6 Nikotinacetylkolinreceptorbindning

En radioligandbindningsanalys16 utfördes med användning av hippocampi från 8 veckor gamla NIC-Sired (5 M och 10F) och SAL-Sired (9 M och 6F) F1-möss. Prover homogeniserades med användning av lysbuffert (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugerades vid 100 000 g i 30 minuter vid 4 grader, återsuspenderades i lysbuffert och centrifugerades igen. Pellets återsuspenderades i Tris/10 procent sackarosbuffert och inkuberades med [3H] Epibatidin ([3H]EB) (~2 nM baserat på 27,28) (specifik aktivitet 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) under 1 timme vid rumstemperatur. [3H]EB valdes för nAChR-bindning, eftersom tidigare resultat visade att hippocampus heteromera 4 2 nAChR medierar effekterna av nikotin på rädslakonditionering.17 Ospecifik bindning utvärderades i närvaro av 300 μM nikotin (nikotinvätetartratsalt) löst i Tris-buffert, fri baskoncentration). [3H]EB-bundna nAChRs filtrerades (24-brunnars cellskördare, Brandel Co, Gaithersburg, MD), och en vätskescintillationsräknare (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) mätte filterradioaktivitet. Specifik bindning uttryckt som fmol/mg vävnad beräknades som skillnaden mellan total och ospecifik bindning.16

2.7 In vivo amperometriska kolinerga inspelningar

En separat kohort av naiva 10- till 20 veckor gamla NIC-Sired och SAL-Sired F1-möss användes för att bedöma förändringar i hippocampus kolinerg transmission med hjälp av amperometri. Keramiskt baserade mikroelektroder (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), med 4 (15 × 333 μm) platinainspelningsplatser arrangerade i par (övre och nedre), belades med kolinoxidas (EG-nummer 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), som rapporterats tidigare.29 Elektroder elektropolymeriserades med meta-fenylendiamin (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) för att öka selektiviteten för att detektera kolinströmmar. Mikroelektroder med en känslighet större än eller lika med 3pA/μM och detektionsgräns mindre än eller lika med 400 nM för kolin användes för att ge ett känsligt index för acetylkolin (ACh) frisättning.30 Djur bedövades med uretan (1,2–1,5) g/kg, ip), och enzymbelagda mikroelektroder sänktes stereotaxiskt till dorsala (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V -2,3 mm) eller ventrala (A/P -3,1 mm, M) /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hippocampus. Ventral och dorsal hippocampus utvärderades separat, eftersom de på olika sätt bidrar till kontextuell rädsla: den ventrala hippocampus (vHPC) har en mer framträdande roll i rädslaassociation och uttryck, medan den dorsala hippocampus (DHCP) är avgörande för kontextuellt minne.31 Ag/ AgCl-referenselektroder implanterades i den kontralaterala rostrala cortexen.

Amperometriska inspelningar utfördes vid 2 Hz genom att applicera en fast potential på plus 0.7 V, och data digitaliserades (FAST-16 potentiostat, Quainton, Nicholasville, KY). Bakgrundsströmmar stabiliserades i 60 minuter, sedan applicerades läkemedel i hippocampus med hjälp av en glaskapillär (spetsdiameter: 15 μm) fäst vid elektroden. Depolarisationsframkallad ACh-frisättning mättes genom att applicera antingen korta pulser av kalium (KCl 70 mM; 100 NL) eller NIC (1 mM fribas, nikotintartrat; 100 NL) vid 2 till 10 psi varannan minut. Registreringar motsvarades för hippocampusregionen (dorsal eller ventral) och läkemedel (kalium eller NIC). Kolinsignalamplituder mättes genom förändringen i ström på den enzymbelagda kanalen från baslinjeström och omvandlades till μM ekvivalenter av kolin baserat på in vitro-kalibrering. Självreferensering användes för att eliminera artefakter genom att subtrahera strömmar från sentinelkanaler.29 Mikroelektrodplacering verifierades genom Nissl-färgning av koronala hippocampussektioner (Figur S1). Genomsnitt av två svar per läkemedelsmanipulation per djur användes för statistisk analys.

2.8 Statistisk analys

Statistiska jämförelser utfördes med SPSS (IBM, Armonk, NY) eller GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Outliers bestämdes av värden 2 standardavvikelser över medelvärdet. Om ett extremvärde upptäcktes ingår informationen i resultatavsnittet. Kriteriet för signifikans sattes till=.05. Statistisk analys utfördes initialt inklusive kön som en faktor för alla experiment som testade både manliga och kvinnliga avkommor. Analyser kollapsade över kön när trevägs- eller tvåvägsinteraktioner med sex inte detekterades (P > 0,05). Data analyserades med t-test, 1-vägs eller 2-vägs ANOVA, beroende på vad som var lämpligt. Signifikanta huvud- eller interaktionseffekter följdes av LSD-post hoc-jämförelser. Upprepade åtgärder ANOVAs följdes av Bonferroni post hoc jämförelse med korrigering för flera jämförelser. Om ojämlika varianser upptäcktes användes Welchs t-test för ojämlika varianser och frihetsgrader avrundades nedåt.

2.9 RNA/DNA-isolering

Vuxna F1-möss (8 veckor gamla; n=3 M och 3 F per grupp) avlivades via cervikal dislokation. Hippocampi dissekerades snabbt i ventrala och dorsala delar (i förhållandet 1:1), slogs samman från vänster och höger sida och frystes snabbt på torris. DNA och RNA samisolerades och renades med ett AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA- och DNA-koncentration och kvalitet utvärderades med hjälp av NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) och Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). För RNA-extraktioner var det lägsta RNA-integritetstalet (RIN) 8,5.

2.10 Transkriptomanalys via

RNA-sekvenseringsbibliotek förbereddes av Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) för 150 bp enkeländsläsningar med hjälp av Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) och sekvenseras på Illumina HiSeq 2500 i snabbkörningsläge (tre på varandra följande körningar med cirka 10 miljoner avläsningar per prov). FASTQ-filer kvalitetskontrollerades via FASTQC och hade genomsnittliga Phred-kvalitetspoäng per läsning högre än 30 (dvs mindre än 0,1 procent sekvenseringsfel). FASTQ-filer anpassades till ett musreferensgenom (mm10; UCSC Genome Browser) med TopHat (v2.1.0)32 på Galaxy Project33. Manschettknappar och Cuffmerge (v2.2.1.0)34 användes för att sammanställa transkript från mappade läsningar och sammanfoga transkriptionsfiler för slutlig transkriptomsammansättning. Falsk discovery rate (FDR) justerade P-värden beräknades för differentiellt genuttryck från NIC-Sired- och SAL-Sired-prover med användning av Cuffdiff (v2.2.1.3),34 med en standard FDR-cut-off på 0,05,35 Transkriptomdatauppsättningar deponerades till Gene Expression Omnibus.

2.11 Anrikningsanalys

Differentiellt uttryckta gener analyserades med hjälp av uppfinningsrikedomsväganalys (IPA, körd i december 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 för att avslöja potentiell anrikning av associativa biologiska nätverk. Körningsparametrar specificerade maximalt 35 molekyler per gennätverk och begränsade analysen till däggdjurs-CNS-vävnad eller cellinjer. Statistisk signifikans för anrikning bestämdes med ett högerstjärtat Fishers exakta test korrigerat för flera tester.

2.12 Riktad bisulfitsekvensering

DNA samisolerat med RNA (se avsnitt 2.9) användes för DNA-metyleringsanalys. RNA-seq identifierade 952 och 162 differentiellt uttryckta gener i vHPC respektive DHCP. De 1010 unika generna från dessa kombinerade listor valdes ut för anrikning i bisulfit-seq med hjälp av ett anpassat SeqCap Epi-anrikningssystem (Roche, Pleasanton, CA, USA; Tabell S1).38 Riktad bisulfit sekvensering utfördes vid Penn State Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility. Bibliotek konstruerades med användning av KAPA Hyper Prep kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Natriumbisulfit-konverterade bibliotek PCR-amplifierades och berikades för utvalda genomiska regioner med hjälp av en anpassad infångningsprobuppsättning (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Infångat DNA sekvenserades på Illumina HiSeq 2500 med användning av 100 nt parad-end-läsningar. FASTQ-filer kvalitetskontrollerades via FASTQC. Illumina-adaptersekvenser togs bort och baser av låg kvalitet trimmades med hjälp av Trimmomatic.39 Bastrimning av låg kvalitet utfördes med ett glidfönster, trimning när den genomsnittliga kvaliteten inom ett fönster med fyra baspar föll under ett tröskelvärde på 20, med en minsta läslängd på 35. Efter trimning hade FASTQ-filerna genomsnittliga Phred-kvalitetspoäng per läsning över 30 (dvs mindre än 0,1 procent sekvenseringsfel). Trimmade avläsningar mappades till musreferensgenomet (mm10) med hjälp av Bowtie240 implementerat i Bismark.41 Metyl_extrakt inom Bismark användes för att extrahera CpG-metyleringsinformation och för att skapa metyleringsrapporter. MethylKit42 användes för analys av differentiellt metylerade regioner (DMR). Metyleringsstatus sammanfattades över icke-överlappande fönster på 500 baspar och differentiell metyleringsanalys utfördes, med en standard FDR på 0,05,35 Dataset har deponerats till Gene Expression Omnibus.

Fördelen med cistancheextrakt

3. RESULTAT

3.1 Faderns nikotin förstärker kontextuell rädslakonditionering och vänder akut nikotinförstärkning av kontextuell rädslakonditionering i F1- och F2-generationsmöss

NIC-sired och SAL-Sired F1 han- och honmöss var rädsla betingade efter akut SAL eller NIC administrering (0.09 mg/kg ip, figur 1A). Fullständig analys av baslinje, pre-CS och CS-frysning ingår i stödjande information. En 3-vägs ANOVA av kontextuell frysning med faderbehandling, akut läkemedelsbehandling och sex som faktorer avslöjade en signifikant far × akut läkemedelsbehandlingsinteraktion (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" eftersom="" det="" inte="" fanns="" någon="" signifikant="" interaktion="" mellan="" kön="" och="" far="" eller="" akut="" läkemedelsbehandling,="" utfördes="" en="" 2-vägs="" anova="" kollapsad="" över="" kön="" och="" avslöjade="" en="" signifikant="" farbehandling="" ×="" akut="" läkemedelsbehandlingsinteraktion="" (f(1,40)="20.96" p="">< 0,001).="" post="" hoc-jämförelser="" indikerade="" att="" saltlösningsbehandlade="" nic-sired="" f1-möss="" uppvisade="" förstärkt="" kontextuell="" rädslakonditionering="" jämfört="" med="" saltlösningsbehandlade="" sal-sired="" f1-möss="" (t20="2.73," p="">< 0,05).="" i="" linje="" med="" tidigare="" fynd="" producerade="" 43="" akut="" nic="" vid="" 0,09="" mg/kg="" förbättrad="" kontextuell="" rädsla="" hos="" sal-sired-möss="" (t22="2.99," p=""><.01). emellertid="" försämrade="" akut="" nic="" vid="" 0,09="" mg/kg="" kontextuell="" rädsla="" hos="" möss="" av="" nic="" (t18="3.36," p=""><.01). sammantaget="" var="" kontextfrysningsnivåerna="" hos="" nic-sired="" nic-möss="" jämförbara="" med="" de="" som="" observerades="" i="" sal-sired="" sal-möss="" vid="" båda="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Dessutom testades manliga och kvinnliga NIC- och SAL-Sired djur i chockkänslighet (Figur S2), förhöjd plus labyrint (EPM, Figur S3), öppet fält och nya objektigenkänningsparadigm (Figur S4, se Stödinformation för fullständiga metoder). och resultat). Med undantag för NIC-Sired-honor i EPM (som visade ökade ångestliknande beteenden) och NIC-Sired-djur i chockkänslighet (som visade minskad röstreaktivitet mot chock, vilket inte skulle förvirra den ökade rädslan för att lära sig flergenerationsfenotypen), inga skillnader upptäcktes mellan NIC- och SAL-Sired-möss.

FIGUR 1 Faderns nikotin förbättrar kontextuell rädslakonditionering och dämpar akut nikotinförstärkning av rädslakonditionering. Kontextuell frysning var signifikant högre i NIC-Sired plus SAL jämfört med SAL-Sired plus SAL-kontroller. Akut nikotin vid 0,09 mg/kg förbättrad kontextuell rädsla hos SAL-Sired men signifikant reducerad kontextuell rädsla conditioning i NIC-Sired djur (n=10-12 per grupp). B, Kontextuell frysning var signifikant högre i NIC-grandsire plus SAL jämfört med SAL-grandsire plus SAL-kontroller (n=9-11 per grupp). Felstaplar indikerar standardfel för medelvärdet (SEM), *P <>

För att avgöra om försämrad kontextuell rädslakonditionering fortsatte in i nästa generation (F2), föddes NIC-farfars- och SAL-farfaders han- och honmöss av F2-möss från naiva F1-hanmöss. Fullständig analys av baslinje, pre-CS och CS-frysning ingår i stödjande information. En 3-vägs ANOVA av kontextuell frysning utfördes med morfarsbehandling, akut läkemedelsbehandling och sex som oberoende faktorer (Figur 1B). Eftersom det inte fanns någon signifikant interaktion mellan kön och far eller akut läkemedelsbehandling, utfördes en 2-vägs ANOVA kollapsad över kön. En signifikant huvudeffekt av fader (F(1,37)=9.88, P < .01)="" hittades,="" och="" post="" hoc-jämförelser="" visade="" att="" nic-farfaders="" möss="" uppvisade="" förstärkt="" kontextuell="" rädslakonditionering="" jämfört="" med="" med="" sal-farfarsmöss="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" dessutom="" hade="" sal-farfarsmöss="" som="" administrerades="" akut="" nic="" förbättrad="" kontextuell="" rädslakonditionering="" (t19="2.41," p="0.026)" men="" akut="" nic="" förbättrade="" inte="" kontextuell="" rädslakonditionering="" hos="">

FIGUR 2 Faderns nikotin förbättrar räddningskonditionering och spontan återhämtning av rädslaminne. För att undersöka potentiella takeffekter under cued-testning fick en separat kohort av F1-möss identisk träning med endast en CS-US-parning. Både kontextuell och cued fear conditioning förstärktes i NIC-Sired-möss jämfört med SAL-Sired-möss tränade med 1 CS-US-parning (n=8-10 per grupp). B, Faderns nikotinexponering påverkade inte utrotningen av kontextuell rädsla men ökade spontant återhämtning av rädslaminnet 7 dagar efter den sista utrotningssessionen (n=8-10 per grupp). Felstaplar indikerar standardfel för medelvärdet (SEM), *P <>

3.2 Faderns nikotin förbättrar cued fear conditioning hos F1 generationens möss

För att undersöka om en takeffekt utesluter upptäckt av gruppskillnader för cued fear conditioning (se stödjande information), tränades en separat grupp av F1-möss med en CS-US-parning. I denna kohort hittades förbättring av kontextuell rädslakonditionering (t7=3.21, P < .05)="" såväl="" som="" cued="" fear="" conditioning="" hos="" nic-sired-möss="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" figur="">

3.3 Faderligt nikotin förbättrar spontan återhämtning av kontextuellt rädslaminne hos F1-generationsmöss

Kohorten av F1-möss som fick en CS-US-parning testades därefter för utrotning och spontan återhämtning av kontextuellt rädslaminne. F1 NIC-Sired möss visade normal rädsla utrotning men visade förbättrad spontan återhämtning av kontextuellt rädsla minne i förhållande till SAL-Sired möss (t7=3.38, P < 0.05;="" figur="">

3.4 Faderns nikotin minskar självadministrationen av nikotin

Innan utbildningen för självadministration av nikotin analyserades försökspersonerna för deras förmåga att lära sig en operant uppgift för att få matbelöning, och inga skillnader observerades (stödjande information, figur S5). För att testa potentiella effekter av nikotinexponering hos far på nikotinförstärkning hos F1-avkommor, utvärderades förvärvet av IV nikotin-självadministrering (0.03 mg/kg/infusion) i en 2-vägs blandad design ANOVA, som identifierade en huvudeffekt av sessionen (F(7 119)=13.60, P < .001)="" och="" en="" session="" ×="" faderbehandlingsinteraktion="" (f(7.119)="5.00," p="">< .001).="" post="" hoc-tester="" visade="" dock="" inte="" några="" statistiskt="" signifikanta="" skillnader="" mellan="" grupperna="" på="" var="" och="" en="" av="" de="" åtta="" förvärvssessionerna="" (figur="" 3a).="" antalet="" aktiva="" och="" inaktiva="" spaktryckningar="" analyserades="" sedan="" för="" att="" fastställa="" om="" grupperna="" bibehöll="" en="" översessionspreferens="" för="" den="" aktiva="" spaken="" under="" förvärvet="" (figur="" 3b),="" vilket="" identifierade="" en="" huvudeffekt="" av="" sessionen="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" och="" en="" session="" ×="" faderbehandlingsinteraktion="" (f(21="" 238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc-analys="" visade="" att="" grupperna="" skilde="" sig="" åt="" den="" första="" dagen="" av="" nikotin="" självadministration.="" nic-sired-gruppen="" uppvisade="" större="" aktiv="" spaktryckning="" jämfört="" med="" sal-sired-gruppen.="" denna="" effekt="" kan="" antingen="" representera="" en="" högre="" nivå="" av="" drogsökande="" beteende="" den="" första="" dagen="" av="" exponeringen,="" uthållighet="" att="" svara="" på="" matbelöning="" och/eller="" minskad="" kognitiv="" flexibilitet="" vid="" övergången="" från="" mat="" till="" drog.="" denna="" skillnad="" kvarstod="" dock="" inte="" under="" ytterligare="" sessioner.="" sal-sired="" möss="" uppvisade="" en="" konsekvent="" statistiskt="" signifikant="" preferens="" för="" den="" aktiva="" spaken="" framför="" sin="" inaktiva="" spak="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" men="" nic-sired="" möss="" uppvisade="" inte="" denna="" bibehållna="" preferens="" för="" sessioner="" 3="" till="">

FIGUR 3 Faderns nikotin minskar självadministrationen av nikotin. En NIC- och SAL-Sired hanmöss (n=9-10 per grupp) skilde sig inte i det totala antalet infusioner som tjänats in för varje session under förvärvsperioden den 0 0,03 mg/kg/infusionsdos. B, Under förvärvet skilde sig antalet aktiva och inaktiva spakpressar signifikant vid den första sessionen, med NIC-Sired möss nikotin som uppvisade ett större antal aktiva spakpressar jämfört med SAL-Sired möss. Men under efterföljande sessioner minskade NIC-Sired-möss svar, vilket resulterade i inga signifikanta skillnader mellan deras aktiva och inaktiva antal spaktryckningar över sessioner 3 till 8. Däremot uppvisade SAL-Sired-djur en konsekvent statistiskt signifikant preferens för den aktiva spaken över sin inaktiva spak. C, Genomsnittligt antal nikotininfusioner över de tre senaste förvärvssessionerna skilde sig inte signifikant mellan NIC- och SAL-Sired-möss. D, Vid en måttlig dos på 0,1 mg/kg/infusion gav NIC-Sired-möss ett betydligt lägre antal nikotininfusioner. E, Inkubation av sugbedömning avslöjade en signifikant ökning av svar på den tidigare aktiva spaken efter 21 dagars avhållsamhet endast för SAL-Sired-möss. Felstaplar indikerar standardfel för medelvärdet (SEM), *P <>

För att ytterligare undersöka potentiella gruppskillnader samtidigt som man kontrollerade för variabilitet under den inledande fasen av förvärvet, undersöktes det genomsnittliga antalet nikotininfusioner för de senaste tre sessionerna, en tidpunkt då försökspersonerna visade mer konsekventa svar för nikotin (Figur 3C). Grupperna skilde sig inte signifikant åt i medelantalet nikotininfusioner (P > .05). Därefter övergick mössen till en 0,1 mg/kg/infusionsdos av nikotin, som tidigare visat sig vara att föredra hos vuxna C57BL6/J-möss.44 Vid denna dos administrerade NIC-Sired-möss ett lägre antal infusioner (t{ {7}}.20, P < .05;="" figur="" 3d).="" för="" inkubation="" av="" sugbeteende,="" som="" anses="" vara="" ett="" mått="" på="" ökat="" läkemedelssökande="" under="" abstinens,="" identifierade="" en="" 2‐vägs="" mixed-design="" anova="" med="" sessions-="" och="" faderbehandling="" huvudeffekten="" av="" sessionen="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" medan="" sal-sired-djur="" uppvisade="" en="" inkubationseffekt="" med="" högre="" svar="" på="" dag="" 21="" av="" abstinens="" jämfört="" med="" dag="" 1,="" visade="" nic-sired-möss="" ingen="" ökning="" i="" nikotinsökande="" beteende="" (p=""><>

3.5 Faderns nikotinexponering förändrar hippocampus kolinerga bindning och funktion

Hippocampus heteromer nAChR-bindning med hög affinitet uppreglerades i NIC-Sired F1-möss (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0,044).="" en="" patient="" (nic-sired)="" togs="" bort="" eftersom="" bindningsvärdena="" var="" två="" standardavvikelser="" över="">

Amperometriska registreringar av kalium- och nikotinframkallade ACh-strömmar bedömdes i F1 dHPC och vHPC. På grund av ojämna provstorlekar per kön ingick inte kön som en preliminär faktor i dessa analyser. KCl-depolarisationsframkallade kolinerga signaler skilde sig inte mellan SAL- och NIC-möss i dHPC (P > 0,05; Figur 4A); lokal nikotinapplicering resulterade dock i en signifikant minskning av kolinerga signalamplituder hos NIC-Sired möss (t8=2.33, P <.05; figur="" 4c).="" i="" vhpc="" minskade="" frisättningen="" av="" ach="" hos="" möss="" med="" nic-sired="" efter="" applicering="" av="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; figur="" 4b)="" eller="" nikotin="" (t8="2.98," p=""><.05 figur="">

FIGUR 4 Faderns nikotin minskar kolinerg signalering i hippocampus. En dHPC-population kolinsignaler framkallade av KCl-inducerad terminal depolarisering. Inga signifikanta skillnader upptäcktes mellan NIC- och SAL-Sired djur (n=5 per grupp). B, vHPC-populationskolinsignaler framkallade av KCl-inducerad terminal depolarisering reducerades i NIC-Sired-möss. C, Nikotin-framkallade populationens dHPC-kolinsignaler reducerades i NIC-Sired-möss. D, Nikotin-framkallade populationens vHPC-kolinsignaler reducerades i NIC-Sired-möss. Inga effekter av sex på kolinerg signalering observerades. Felstaplar indikerar standardfel för medelvärdet (SEM), *P <>

3.6 Faderns nikotinexponering förändrar differentiellt dorsal och ventral hippocampal genuttryck

F1 hippocampus transkriptomanalys via RNA-sekvensering avslöjade 952 differentiellt uttryckta gener i vHPC (FDR=0.05; Tabell S2). Av dessa gener var 612 nedreglerade och 340 uppreglerades i NIC-Sired-möss. I dHPC uttrycktes endast 162 gener differentiellt i NIC-Sired-möss jämfört med SAL-Sired-möss (FDR=0.05). Av dessa 162 gener nedreglerades 86 och 76 uppreglerades. Hundra tre gener med förändrat genuttryck överlappade mellan vHPC och dHPC.

3.7 Faderns nikotinexponering förändrar transkriptionsvägar involverade i nervsystemets utveckling

I vHPC identifierade IPA-analys toppnätverket "Neurologisk sjukdom, organismskada och abnormiteter, celldöd och överlevnad" (poäng=41, tabell S3) och det andra toppnätverket "Nervsystemets utveckling och funktion, vävnadsmorfologi, neurologisk Sjukdom" (poäng=23). De fem bästa kategorierna för molekylära och cellulära funktioner var: "Cellmorfologi" (88 molekyler), "Cellulär sammansättning och organisation" (79 molekyler), "Cellulär utveckling" (96 molekyler), "Cellulär funktion och underhåll" (79 molekyler), och "Cellular Growth and Proliferation" (87 molekyler). De bästa fysiologiska systemutvecklingen och funktionen var "Nervsystemets utveckling och funktion" (175 molekyler), och några av de främsta sjukdomarna och störningsfunktionerna inkluderar "neurologisk sjukdom" (andra, 191 molekyler) och "psykologiska störningar" (fjärde, 90 molekyler) ) (Tabell S4).

Som komplement till IPA-resultaten gav anrikningsanalys med hjälp av Enrichr ytterligare bevis för förändringar i celltillväxt och utveckling i vHPC, med de bästa GO biologiska termerna inklusive "RNA-splitsning", "svar på ovikt protein" och "reglering av celltillväxt" och " proteinstabilisering" (tabell S5). På motsvarande sätt identifierades "spliceosomalt komplex" som en topp GO cellulär term. KEGG-väganalys via Enrichr pekade dessutom på spliceosomfunktion och MAPK-signalering som potentiellt påverkade vägar.

Trots en betydligt kortare lista över differentiellt uttryckta gener i dHPC jämfört med vHPC, identifierades liknande dHPC-berikade vägar och termer (tabellerna S3 och S4). IPA-analys identifierade toppnätverket "Beteende, neurologiska sjukdomar, organismskador och abnormiteter" (poäng=24) och det andra toppnätverket "Neurologiska sjukdomar, organismskador och abnormiteter och psykologiska störningar (poäng=20) .

De fem bästa kategorierna för molekylära och cellulära funktioner i dHPC var "Cellulär utveckling" (29 molekyler), "Cellulär tillväxt och proliferation" (29 molekyler), "Cellmorfologi" (27 molekyler), "Cellulär sammansättning och organisation" (23 molekyler) och "Cellulär funktion och underhåll" (25 molekyler). "Nervsystemets utveckling och funktion" identifierades återigen som en toppberikad term under klassificeringen av fysiologisk systemutveckling och funktion (andra, 44 molekyler). Toppberikade termer under funktionsklassificeringen för sjukdomar och störningar inkluderade "neurologisk sjukdom" (1:a, 51 molekyler) och "psykologiska störningar" (femte, 31 molekyler). Anrikningsanalys med hjälp av Enrichr identifierade flera olika GO-biologiska termer för dHPC jämfört med vHPC, inklusive "reglering av neurondöd" och "hjärnutveckling" (tabell S5), som är komplementär till IPA:s molekylära och cellulära funktion "Celldöd och överlevnad."

För att ytterligare utforska den funktionella rollen för differentiellt uttryckta transkript som överlappar mellan dHPC och vHPC, utvärderades differentiellt uttryckta gener gemensamma för båda regionerna (103 totalt). Överlappande differentiellt uttryckta transkript mellan de två regionerna nedreglerades eller uppreglerades alla i samma riktning, vilket tyder på vanliga förändringar i transkriptionsvägar över hjärnregioner hos möss av NIC. De fem främsta kategorierna för molekylära och cellulära funktioner som identifierades av IPA var "Celldöd och överlevnad" (17 molekyler), "Cellulär rörelse" (10 molekyler), "Cell-till-cell-signalering och interaktion" (17 molekyler), "Cellulär tillväxt". and Proliferation" (18 molekyler) och "Cellmorfologi" (17 molekyler) (tabell S4)

Differentiellt uttryckta gener unika för dHPC och vHPC analyserades därefter separat i IPA för att testa för divergerande neurobiologiska anpassningar mellan de två regionerna (tabell S6). Inga berikade kanoniska vägar överlappade mellan de unika vHPC unika dHPC-analyserna. Toppberikade kanoniska vägar unika för vHPC (44 totalt) inkluderade "Kalciumsignalering" och "Glukokortikoidreceptorsignalering", medan de bästa dHPC-kanoniska vägarna (totalt åtta) inkluderade "Tyroidhormonmetabolism" och "Retinsyramedierad apoptossignalering." Berikade sjukdomar och funktioner som är unika för vHPC (totalt 295) inkluderade "Formation of [Hippocampus] Ammon's Horn" och "Quantity of Cellular Protrusions" medan unikt dHPC-berikade sjukdomar och funktionstermer (111 totalt) inkluderade "Inflammation av vit substans" och "Demyelinisering" ."

3.8 Faderns nikotinexponering förändrar hippocampus DNA-metylering

En målinriktad DNA-metyleringsanalys utfördes för att bestämma om förändrad DNA-metylering i motsvarande regulatoriska regioner stod för det differentiella genuttrycket i NIC-Sired F1-avkomma. Målen inkluderade 1114 differentiellt uttryckta gener identifierade i antingen dHPC eller vHPC. I vHPC detekterades 11 differentiellt metylerade regioner (DMR), varav åtta visade ökad metylering och tre visade minskad metylering (tabell 1). Av de 11 DMR var 10 lokaliserade i regioner associerade med en gen som uppvisade förändrat uttryck i vHPC. I dHPC detekterades 30 DMR, varav 15 visade ökad metylering och 15 visade minskad metylering. Av de 30 DMR var 29 lokaliserade i regioner associerade med en gen som uppvisade förändrat uttryck i dHPC.

Benefit av cistanche echinacoside

4. DISKUSSION

Ökad förståelse för epigenetiska processer i samband med nyare data, inklusive de nuvarande fynden, har utmanat den traditionella förståelsen av arv. Faktorer bortom enbart genotyp kan bestämma fenotyper i efterföljande generationer, och exponeringar inom en generation kanske inte avskiljs från avkomma. Den aktuella studien tyder på att de skadliga hälsoeffekterna av nikotinexponering kan överskrida individuell exponering och påverka efterföljande generationer. Vi identifierade multigenerationella och transgenerationella effekter av preconception faderns nikotinexponering i C57BL/6J möss på Pavlovian rädsla conditioning, vilket resulterade i starkare rädsla minnen i F1 och F2 avkomma. Faderns nikotinexponering resulterade också i minskad självadministration av nikotin och försvagade återfallsrelaterade beteenden, vilket tyder på ett större aversivt svar på nikotin. Till stöd för dessa beteendeskillnader observerades multigenerationella förändringar i hippocampus kolinerg funktion och epigenetiska processer. Tillsammans pekar dessa resultat på förändringar i nervsystemets funktion hos avkomman till nikotinexponerade möss vilket resulterar i förändrade beteendefenotyper.

F1- och F2-avkommor från hanmöss exponerade för nikotin uppvisade förbättrad kontextuell och cued rädslakonditionering. Trots inga skillnader i kontextuell rädsla utrotning mellan NIC- och SAL-Sired F1 möss, NIC-Sired möss visade förbättrad spontan återhämtning av kontextuella rädsla minnen. Viktigt är att inga skillnader i chockkänslighet mellan NIC- och SAL-Sired möss som kunde förklara ökad rädsla konditionering hittades. Förbättrad rädslakonditionering kan antyda generaliserad förbättring av inlärningsprocesser i motsats till modulering av processer mer specifika för rädsla för att lära. Emellertid observerades inga förändringar i nya objektigenkänning, operant matträning eller öppen fältrörelse hos NIC-Sired-möss, även om en könsspecifik effekt av ökad EPM-öppenarmstid i NIC-Sired-honmöss identifierades. Även om detta inte utesluter potentiella modifieringar av andra inlärningssystem eller kognitiva processer, tyder dessa fynd tillsammans på att rädslalärning kan vara mer känslig för multigenerationella och transgenerationella effekter av faderns nikotinexponering. Dessutom tyder dessa fynd på en förändrad kolinerg funktion hos NIC-sired djur. Nikotin modulerar kontextuell rädsla. Medan akut nikotin förstärker konditionering av kontextuell rädsla, 15,45 avbryter abstinens från kronisk nikotin konditionering av kontextuell rädsla.16,21 I denna studie förstärkte akut nikotin kontextuell rädsla hos F1- och F2-möss från möss som behandlats med saltlösning. Däremot störde akut nikotin kontextuell rädsla hos NIC-Sired-möss och hade ingen effekt i NIC-grandsire-möss, vilket kan peka på förändrad kolinerg funktion i hippocampus.

Effekterna av faderns nikotinexponering på efterföljande självadministration av nikotin i F1-generationen pekar också på störd kolinerg funktion. Under förvärvet av IV nikotin-självadministrering vid den lägre dosen skilde sig inte grupperna i antalet nikotininfusioner, även om en ökning av antalet aktiva spakpressar hittades i NIC-Sired-gruppen. Detta tyder på att NIC-Sired-mössen kan ha uppvisat uthållighet när det gäller att svara på matbelöning och/eller minskad kognitiv flexibilitet vid övergången från mat till drog. Det är dock också värt att notera att grupperna inte skilde sig åt på dag 1 av inkubation av begär, vilket representerar en utrotningssession (t.ex. inga nikotininfusioner under sessionen), och därför verkar denna effekt ha varit närvarande när förstärkare är bytte men inte i frånvaro av en förstärkare under en utsläckningssession. NIC-Sired-mössen uppvisade också minskad nikotin-självadministrering vid måttlig dos, vilket stämmer överens med nyligen genomfört arbete som identifierar minskningar av alkohol, kokain och opioidadministrering associerad med föräldrarnas alkohol-, kokain- och morfinexponering (t.ex. Vassoler et al,46 som recenserad i Goldberg och Gould47). Den observerade minskningen av nikotin-självadministrering kan tillskrivas antingen minskad känslighet för de givande effekterna av nikotin och/eller ökad känslighet för de motbjudande effekterna av nikotin. Faktum är att grupperna skilde sig åt vid den måttliga nikotindosen men inte den lägre nikotindosen, vilket stöder uppfattningen om ett ökat aversivt svar med den högre dosen. Intressant nog fann vi också en brist på inkubation av sug på dag 21 i NIC-Sired-möss efter självadministration vid den måttliga dosen, vilket tyder på att minskat nikotinsökande beteende kan relateras till ett aversionsassocierat minne för nikotin. Även om olika neurala substrat kan ligga bakom dessa effekter på nikotinintag och återfallsrelaterat svar, fann en nyligen genomförd studie att minskat DNA-metyltransferas i hippocampus CA1-regionen minskade morfins självadministration.48 Detta fynd, tillsammans med den kända funktionen av kolinerg hippocampus funktion i inlärnings- och minnesprocesser, stödjer ytterligare föreställningen om störd nikotinmedierad bearbetning i hippocampus hos NIC-Sired-möss.

Längs dessa linjer uppvisade NIC-Sired-möss ökad hippocampal nAChR-bindning med hög affinitet. Vi fann också minskningar av kalium-framkallad ACh-frisättning i vHPC såväl som i nikotin-framkallad ACh-frisättning i både dHPC och vHPC av NIC-Sired-djur. Förändringar i depolarisationsframkallad ACh-frisättning återspeglar förändrad kolinerg funktion nedströms receptorbindning, medan förändringar i nikotinframkallad ACh-frisättning återspeglar förändrad nAChR-funktion. Dessa data är i linje med tidigare fynd av uppreglerad nAChR-bindning med hög affinitet efter minskad nAChR-funktion.49 Eftersom både kaliumframkallad och nikotinframkallad ACh-frisättning förändrades i vHPC hos NIC-Sired möss, kan vHPC vara känsligare för de multigenerationella effekterna av faderns nikotinexponering. DHPC är känt för att modulera kontextuell rädsla.31,50 Hämning av vHPC stör både cued och kontextuell rädsla ing51,52 och vHPC kolinerga lesioner försämrar cued fear conditioning.53

Ört cistanche

Vi har också visat att direkt nikotininfusion i dHPC förbättrar kontextuell rädsla, medan infusion till vHPC stör kontextuell rädsla.15 vHPC kan också modulera spontan återhämtning av kontextuella rädslor, eftersom inaktivering av vHPC-prelimbiska kretsar minskar spontan återhämtning av kontextuella rädslor. 54 Även om andra hjärnregioner som är involverade i rädslakonditionering, såsom amygdala,55 också kan påverkas av faderns nikotinexponering, tyder dessa fynd tillsammans med nuvarande data på att förändringar i vHPC-funktionen kan vara ansvariga för förändrad rädslakonditionering hos NIC-Sired möss . Vi antog att de multigenerationella effekterna av faderlig nikotinexponering kan vara relaterade till förändringar i transkriptionseffektorer som verkar uppströms om dessa neurala system. Genomomfattande transkriptionssekvensering i vHPC och dHPC av F1-generationsmöss identifierade 1114 differentiellt uttryckta gener mellan NIC- och SAL-Sired-möss. Denna skillnad var större i vHPC (952) jämfört med dHPC (162), i linje med den större förändringen i vHPC i förhållande till dHPCs kolinerg funktion och förändringar av både kontextuell och cued fear conditioning. Efterföljande väganalys föreslog breda förändringar av transkriptionsvägar associerade med glukokortikoidsignalering och neural utveckling/plasticitet i båda hippocampusregionerna.

För att identifiera potentiella anpassningar specifika för vHPC utfördes väganalys med endast transkript som är specifika för antingen hippocampus subregion. Inga berikade IPA kanoniska vägar överlappade mellan vHPC och dHPC, som är funktionellt distinkta subregioner av hippocampus.31 När gener som överlappade mellan dHPC och vHPC togs bort, inkluderade toppberikade kanoniska vägar unika för vHPC "Glucocorticoid Receptor Signaling", vilket tyder på en unik , ytterligare förändring av glukokortikoidfunktionen i denna region jämfört med dHPC. I syfte att identifiera uppströms epigenetiska regulatorer som kan verka på genuttryck, utförde vi riktad DNA-metyleringssekvensering med hjälp av den sammanställda listan över dHPC och vHPC differentiellt uttryckta gener identifierade från RNA-sekvensering. Överraskande nog hittade vi endast 11 DMR i vHPC och 30 DMR i dHPC mellan NIC- och SAL-Sired djur. Även om detta är oväntat med tanke på det mycket högre antalet differentiellt uttryckta transkript i vHPC, är DNA-metylering bara en av flera regulatoriska faktorer som kan påverka genuttryck och DNA-metylering översätts inte konsekvent till förändrat genuttryck.56 Av de 11 vHPC DMR:erna, sju uppvisade metyleringsmönster i överensstämmelse med riktningen för differentiell transkription (minskad transkription med ökad DNA-metylering och ökad transkription med reducerad metylering). Differentiellt metylerade gener i vHPC inkluderade Fkbp5, Ksr1 och Pnpla2. Intressant nog stördes Fkbp5- och Ksr1-transkriptionen i en beteendemusmodell av PTSD,57 där möss exponerades för en elektrisk fotchock och sedan presenterade situationspåminnelser. Fkbp5 kodar för en glukokortikoidreceptorchaperon vars funktion har associerats med en maladaptiv långvarig stressrespons hos individer med PTSD och andra ångeststörningar.58

Specifikt visar humanstudier att Fkbp5-metylering och transkription korrelerar med svårighetsgraden av PTSD-symtom, så att ökad metylering och minskad transkription förutsäger allvarligare PTSD-symptomologi.59,60 Fkbp5-uttryck modulerar HPA-axelns funktion, vilket tros förmedla dess inblandning i PTSD.59,61 Vårt fynd av förbättrad spontan återhämtning av rädslaminne i samband med dysreglering av transkriptionsvägar associerade med glukokortikoidsignalering hos NIC-Sired-djur kan peka på ökad sårbarhet för PTSD-liknande fenotyper. I dHPC var DMR-mönster i stort sett oförenliga med riktningen för differentiellt transkriptuttryck som hittats av RNA-sekvensering, vilket tyder på att förändringar i vHPC DNA-metylering producerad av faderns nikotinexponering är mer följdriktiga när det gäller att påverka genuttrycket än de i dHPC. Detta är i linje med vår identifiering av ett större antal differentiellt uttryckta transkript och mer överdrivna förändringar i kolinerg transmission i NIC-Sired vHPC jämfört med dHPC. Vårt riktade sekvenseringsmetod kan ha begränsat förmågan att detektera potentiell transkriptionell reglering av distalt metylerade sekvenser. Framtida undersökningar inklusive analys av genomomfattande DNA-metylering, histonmodifieringar och små RNA-uttryck kommer att ge en mer fullständig tolkning av dessa fynd.

En potentiell begränsning av vår nikotinexponeringsdesign är fokus på faderns nikotinexponering för att undersöka den multigenerationella och transgenerationella effekten av nikotinexponering. Även om andra studier som hittade multi/transgenerationella fenotyper efter faderns drogexponering, inklusive kokain46 och morfin,62 inte fann några skillnader i mödravården, är det möjligt att faderns nikotinexponering kan påverka mödravården. Framtida studier som undersöker effekterna på mödravården är motiverade. Eftersom vårt nuvarande fokus låg på faderlig exponering, bör framtida arbete också jämföra effekterna av faderns vs modersexponeringen. Sammantaget ger de nuvarande resultaten en ny förståelse av de multigenerationella och transgenerationella effekterna av nikotinexponering, vilka stöds av en växande litteratur som karakteriserar multigenerationella och transgenerationella effekter av läkemedelsexponering (som granskats i Goldberg och Gould47). Denna studie var den första som testade kontextuell rädslakonditionering hos F1- och F2-avkommor till nikotinexponerade män och identifierade förbättrad rädslminnebildning och spontan återhämtning av rädslminnen. Denna studie var också den första som identifierade förändrad självadministration av nikotin och inkubation av sug hos F1-nikotinexponerade avkommor.

Differentiell metylering i gener associerade med PTSD och HPA-axeldysreglering samt samtidiga störningar i stressrelaterade transkriptionsvägar hittades hos NIC-Sired-möss. Faderns nikotin var också associerat med minskad hippocampus kolinerg funktion och ökad hippocampal nAChR-bindning. Intressant nog visar PTSD-patienter som inte rökte signifikant högre mesiotemporal kortikal högaffinitets nAChR-bindning63, och PTSD är associerad med större rädslakonditionering och spontan återhämtning av släckta rädslaminnen.64 Tillsammans tyder våra fynd på att nikotinexponering kan ha en multigenerationseffekt av öka avkommans mottaglighet för PTSD-liknande symptomologi. Detta fynd tillsammans med andra nya fynd som visar flera generationers effekter av nikotinexponering på kognitiv flexibilitet2 tyder på att de negativa hälsoresultaten av nikotinexponering kastar ett bredare nät än man tidigare trott.

Cistanche-extrakt

REFERENSER

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Faderns nikotinexponering definierar olika beteende i efterföljande generation via hypermetylering av mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Nikotinexponering av hanmöss ger beteendeförsämring hos flera generationer av ättlingar. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transgenerationell överföring av hyperaktivitet i en musmodell av ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Den förändrade offentliga bilden av rökning i USA: 1964–2014. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Användning av elektronisk cigarett bland gymnasieelever och dess samband med cigarettanvändning och rökavvänjning, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 och 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Långsiktiga effekter av kronisk nikotin på känslomässiga och kognitiva beteenden och hippocampus cellmorfologi hos möss: jämförelser av vuxna och ungdomars nikotinexponering. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Samband mellan cigarettrökning och ångestsjukdomar under tonåren och tidig vuxen ålder. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. En epigenetisk mekanism förmedlar utvecklingsmässiga nikotineffekter på neuronala struktur och beteende. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Kolin förbättrar vuxnas inlärningsunderskott och vänder epigenetisk modifiering av kromatinremodelleringsfaktorer relaterade till ungdomars nikotinexponering. Neurobiol Lär Mem. 2018;155:239-248.

10. Fågel A. Uppfattningar om epigenetik. Natur. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Miljö epigenetisk transgenerationellt arv och somatisk epigenetisk mitotisk stabilitet. Epigenetik. 2011;6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Associativ inlärning, hippocampus och nikotinberoende. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotinberoende och psykiatriska störningar. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. nAChR-dysfunktion som ett vanligt substrat för schizofreni och komorbidt nikotinberoende: nuvarande trender och perspektiv. Schizophr Res. 2016;171:1–15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotinreceptorer i den dorsala och ventrala hippocampus modulerar differentiellt kontextuell rädslakonditionering. Hippocampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetisk bakgrund påverkar effekterna av abstinens från kroniskt nikotin på inlärning och högaffinitet för nikotinacetylkolinreceptorbindning i dorsala och ventrala hippocampus. Psykofarmakologi (Berl). 2013;225(1): 201–208.

17. Davis JA, Gould TJ. Effekterna av DHBE och MLA på den nikotininducerade förbättringen av kontextuell rädsla i C57BL/6-möss. Psykofarmakologi (Berl). 2006;184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Pre-adolescent och tonårsmöss är mindre känsliga för effekterna av akut nikotin på utrotning och spontan återhämtning. Brain Res Bull. 2018;138:50-55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akut nikotin fördröjer utrotning av kontextuell rädsla hos möss. Behav Brain Res. 2014;263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Nikotinkemi, metabolism, kinetik och biomarkörer. I: Nikotin psykofarmakologi. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29‐60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Uttag från kronisk nikotin administrering försämrar kontextuell rädsla konditionering i C57BL/6 möss. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. En jämförande studie av dispositionen av nikotin och dess metaboliter i tre inavlade stammar av möss. Drug Metab Dispos. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. Varaktigheten av nikotinabstinensassocierade underskott i kontextuell rädslakonditionering paralleller förändringar i hippocampus högaffinitetsnikotinacetylkolinreceptoruppreglering. Neurofarmakologi. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Nedsättning av kontextuell rädsla utrotning av kronisk nikotin och tillbakadragande från kronisk nikotin är associerad med hippocampus nAChR uppreglering. Neurofarmakologi. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Karakterisering av spontant och utfällt nikotinabstinens hos mus. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulär alfa5 nikotinreceptorsubenhetssignalering styr nikotinintaget. Natur. 2011;471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kvantitativ analys av de heteromera neuronala nikotinreceptorerna i råtthipocampus. J Neurochem. 2010;115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Parallella anxiolytiska effekter och uppreglering av neuronala nikotinacetylkolinreceptorer efter kronisk nikotin och vareniklin. Nicotine Tob Res. 2011;13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontala beta2-subenhetsinnehållande och alfa7 nikotinacetylkolinreceptorer styr differentiellt glutamaterg och kolinerg signalering. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Forebrain kolinerga system och kognition: nya insikter baserade på snabb detektering av kolin spikar med hjälp av enzymbaserade biosensorer. I: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Är dorsala och ventrala hippocampus funktionellt distinkta strukturer? Nervcell. 2010;65(1):7–19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: exakt anpassning av transkriptomer i närvaro av insertioner, deletioner och genfusioner. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Galaxy-plattformen för tillgängliga, reproducerbara och kollaborativa biomedicinska analyser: 2016-uppdatering. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Transkriptsammansättning och kvantifiering med RNA-Seq avslöjar okommenterade transkript och isoformbyte under celldifferentiering. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Att kontrollera den falska upptäckten i beteendegenetisk forskning. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard Jr, Tugendreich S. Orsaksanalys tillvägagångssätt i uppfinningsrikedom Pathway Analysis. Bioinformatik. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: en omfattande genuppsättning anrikningsanalys webbserver 2016 uppdatering. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90‐W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Riktad bisulfitsekvensering med SeqCap epi-anrikningssystemet. Metoder Mol Biol. 2018;1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: en flexibel trimmer för Illumina-sekvensdata. Bioinformatik. 2014;30(15):2114-2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Snabb justering med gapad läsning med Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: en flexibel aligner och metyleringsanropare för Bisulfite-Seq-applikationer. Bioinformatik. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: ett omfattande R-paket för analys av genomomfattande DNA-metyleringsprofiler. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin förbättrar kontextuell rädsla och förbättrar etanolinducerade underskott i kontextuell rädsla. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Intravenös nikotin-självadministrering och cue-inducerad återinsättning hos möss: effekter av nikotindos, hastighet av läkemedelsinfusion och tidigare instrumentell träning. Neurofarmakologi. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotinförstärkning av kontextuell rädsla. Behav Brain Res. 1999;102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Epigenetisk nedärvning av en kokainresistensfenotyp. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Multigenerationella och transgenerationella effekter av faderns exponering för missbruk av droger på beteende- och neurala funktioner. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a i hippocampus CA1 är avgörande vid förvärvet av morfinsjälvadministrering hos råttor. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Nikotiniska kolinerga receptorbindningsställen i hjärnan: reglering in vivo. Vetenskap. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hippocampus lesioner orsakar inlärningsbrist hos inavlade möss i Morris vattenlabyrint och betingad rädsla. Behav Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Den ventrala hippocampus och rädsla konditionering hos råttor: olika anterograd amnesi av rädsla efter infusion av N-metyl-D-aspartat eller dess icke-kompetitiva antagonist MK-801 i den ventrala hippocampus. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Hippocampus och Pavlovian rädsla konditionering hos råttor: muscimolinfusioner i den ventrala, men inte dorsala, hippocampus försämrar förvärvet av villkorad frysning till en auditiv betingad stimulans. Behav Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Störning av mediala septum och diagonala band av Broca kolinerga projektioner till den ventrala hippocampus stör hörselrädsla minnet. Neurobiol Lär Mem. 2018;152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Vägspecifik aktivering av ventrala hippocampusceller som skjuter ut mot den prelimbiska cortex minskar rädsla förnyelse. Neurobiol Lär Mem. 2019;161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Den laterala amygdaloidkärnan: amygdalas sensoriska gränssnitt i rädslakonditionering. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Funktioner av DNA-metylering: öar, startplatser, genkroppar och vidare. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. Region- och tidsberoende genreglering i amygdala och främre cingulate cortex av en PTSD-liknande musmodell. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Pärm EB. Rollen av FKBP5, en co-chaperone av glukokortikoidreceptorn i patogenesen och terapin av affektiva och ångeststörningar. Psykoneuroendokrinologi. 2009;34(Suppl 1): S186‐S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Genetiska markörer för PTSD-risk och motståndskraft bland överlevande från World Trade Center-attackerna. Dis Markers. 2011;30(2-3):101-110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Epigenetiska biomarkörer som prediktorer och korrelat av symtomförbättring efter psykoterapi i stridsveteraner med PTSD. Front Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Genuttrycksmönster associerade med posttraumatisk stressyndrom efter exponering för World Trade Center-attackerna. Biol Psykiatri. 2009;66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Utveckling av ångestliknande beteende via hippocampal IGF-2-signalering hos avkomma till förälders morfinexponering: effekt av berikad miljö. Neuropsykofarmakologi. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. beta2 Nikotinacetylkolinreceptortillgänglighet vid posttraumatisk stressyndrom. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Neurobiologisk grund för misslyckande att återkalla extinktionsminne vid posttraumatisk stressyndrom. Biol Psykiatri. 2009;66(12):1075-1082.