Phloretin undertrycker neuroinflammation genom autofagi-medierad Nrf2-aktivering i makrofager

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt

Bakgrund: Makrofager spelar en dubbel roll vid neuroinflammatoriska sjukdomar som multipel skleros (MS). De är involverade i lesionsdebut och progression men kan också främja upplösningen avinflammationoch reparation av skadad vävnad. I denna studie undersöker vi om och hurfloretin, en flavonoid som finns rikligt i äpplen och jordgubbar, sänker den inflammatoriska fenotypen av makrofager och dämparneuroinflammation.

Metoder: Transkriptionella förändringar i musbenmärgshärledda makrofager vid exponering för floretin utvärderades genom bulk-RNA-sekvensering. Underliggande vägar relaterade till inflammation, oxidativ stressrespons och autofagi validerades med kvantitativ PCR, fluorescens- och absorbansanalyser, nukleär faktor erytroid 2-relaterade faktor 2 (Nrf2) knockoutmöss, western blot och immunfluorescens. Den experimentella modellen för autoimmun encefalomyelit (EAE) användes för att studera effekten av floretin på neuroinflammation in vivo och bekräfta underliggande mekanismer.

Resultat: Vi visar att floretin minskar den inflammatoriska fenotypen av makrofager och markant undertrycker neuroinflammation i EAE. Phloretin förmedlar sin effekt genom att aktivera Nr2-signalvägen. Nrf2-aktivering tillskrevs 5'AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK)-beroende aktivering av autofagi och efterföljande kelch-liknande ECH-associerad protein 1(Keap1) nedbrytning.

Slutsatser: Denna studie öppnar framtidsperspektiv för floretin som en terapeutisk strategi för neuroinflammatoriska sjukdomar som MS.

Provregistrering: Inte tillämpbar.

Nyckelord: Phloretin, Makrofager, Neuroinflammation, Multipel skleros, Autoimmunitet

Klicka här för att lära dig mer information

Bakgrund

Aktiv multipel skleros (MS) lesioner kännetecknas av närvaron av mångamakrofager[1-5]. Tidiga studier visade att makrofager antar en pro-inflammatorisk fenotyp i MS-lesioner och därigenom främjarneuroinflammation, demyelinisering och neurodegeneration. Sjukdomsfrämjande effektorfunktioner inkluderar presentationen av antigener härledda från centrala nervsystemet (CNS) till autoreaktiva T-celler och produktionen av inflammatoriska mediatorer såsom pro-inflammatoriska cytokiner, reaktiva syrearter (ROS) och kväveoxid (NO)[ 6,7]. På senare tid har det visat sig att makrofager också har fördelaktiga funktioner i MS-lesioner eftersom de kan omforma sin fenotyp till en som vanligtvis är associerad med immunsuppression och CNS-reparation. Denna skyddande fenotyp kännetecknas av en minskad produktion av pro-inflammatoriska mediatorer, produktion av antiinflammatoriska mediatorer och tillväxtfaktorer och aktivering av antioxidativa vägar såsom den nukleära faktorn erytroid 2-relaterade faktor 2(Nrf2) vägen [8-14]. Eftersom makrofagernas inflammatoriska status har kopplats till progressionen av MS och utvecklingen av kroniska aktiva lesioner, anses att driva makrofager till en fördelaktig fenotyp vara en lovande strategi för att begränsa progressionen av MS [15].

Kostkomponenter driver makrofagfunktion och neuroinflammation [16]. I synnerhet är familjen av flavonoider alltmer erkänd för att innehålla lovande föreningar som påverkar patogena vägar och modulerar fenotypen av immunceller såsom makrofager[17,18]. Flavonoider bildar en av de största fytonäringsfamiljerna som innehåller över 8000 fenolföreningar med olika bioaktivitet. Flera medlemmar av flavonoidfamiljen uppvisar antiinflammatoriska och antioxidativa effekter på makrofager [19-21]. Flavonoiden phloretin är en medlem av dihydrochalcones och finns i vanliga frukter som äpplen och jordgubbar. Phloretin är känt för att utöva immunmodulerande egenskaper och används ofta för hudvård på grund av dess antioxidativa egenskaper [22-24]. Dessutom är floretin en glukostransportör (GLUT) hämmare, en egenskap som påverkar fenotypen av makrofager eftersom makrofagaktivering drivs av GLUT [25, 26]. Sammantaget gör dessa egenskaper floretin till en lovande förening för att modulera fenotypen av makrofager och neuroinflammation. I denna studie visar vi att phloretin driver makrofager mot en mindre inflammatorisk fenotyp och lindrar neuroinflammation i den experimentella autoimmuna encefalomyelitmodellen (EAE). RNA-sekvensering och funktionella experiment identifierade Nrf2-vägen som ett nav och drivkraft för denna skyddande makrofagfenotyp inducerad av floretin. AMPK-beroende aktivering av autofagimaskineriet och efterföljande SQSTMl/p62-förmedlad (hädanefter kallad p62) nedbrytning av Keapl, en adapter som underlättar proteasomal Nrf2-nedbrytning, visade sig ligga bakom Nrf2-aktivering i makrofager. Dessa fynd visar att floretin har potential att användas i terapeutiska strategier för neuroinflammatoriska störningar.

Metoder

Antikroppar och kemiska reagenser

Phloretin(Sigma Aldrich) löstes i 50 mM KOH till en 15 mM stamlösning och lagrades vid -20 grad. Ytterligare utspädningar gjordes i ett RPMI1640 (Gibco)-medium. För in vivo-behandling löstes floretin i 1 N NaOH, varefter pH återjusterades till 7,2 med 1 N HCL, och lösningen späddes ytterligare i fysiologiskt vatten för att erhålla en koncentration av 50 mg/kg. BML-275(1 μM, Santa Cruz Biotechnology) tillsattes 1 timme före floretinbehandling för att hämma AMPK-aktivering. Bafilomycin A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) tillsattes 2 timmar före uppsamling för att blockera fusionen av autofagosomer och lysosomer. Lipopolysackarid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) användes för att stimulera celler för inflammatorisk fenotypning. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) användes för att inducera ROS-produktion. Följande antikroppar användes för western blöt: mus anti- -aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), mus anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), kanin anti-AMPK (1:1000;5831S, Cell Signaling Technology), kanin anti-fosforylerad AMPK(1:1000; 2535S, Cell Signaling Technology), kanin anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), kanin anti-p62(1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Följande antikroppar användes för immunfluorescens: rått-anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), rått-anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), kanin-anti-LC3 (1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), kanin anti-p62 (1:500;23214,Cell Signaling Technology), kanin anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), kanin anti-TMEM119(1) :100, ab209064,Abcam). Lämpliga sekundära antikroppar köptes från Invitrogen.

Möss

Vildtyp(WT) C57BL/6JOlaHsd-möss köptes från Envigo. Djuren utfodrades med en vanlig diet och inhystes i djuranläggningen vid Biomedical Research Institute vid Hasselt University. Alla experiment utfördes enligt institutionella riktlinjer och godkändes av den etiska kommittén för djurförsök vid Hasselt University.

Cell kultur

Benmärgshärleddmakrofager(BMDMs) isolerades från WT och Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd möss, köpta från Envigo och tillhandahållna av RIEN BRC enligt en MTA till Prof S. Kerdine-Römer respektive [27,28]. BMDM erhölls som beskrivits tidigare [29]. I korta skenbens- och lårbensbenmärgsceller från 12-veckogamla WT- och Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd-möss odlades i 10-cm petriplattor i en koncentration av 10×106 celler/ platta, i RPMI1640-medium kompletterat med 10 procent fetalt kalvserum (FCS, Gibco), 50 U/ml penicillin (Invitro-gen), 50 U/ml streptomyciner (Invitrogen) och 15 procent L929-konditionerat medium (LCM) ). Efter differentiering lossades BMDM vid 37 grader med 10 mM EDTA i PBS (Gibco) och odlades (0,5×10 grader celler/ml) i RPM1640 kompletterat med 10 procent FCS, 50 U/ml penicillin, 50 U/ml streptomycin och 5 procent LCM ( 37 grader C, 5 procent CO2). Mikrogliakulturer isolerades från hjärnor från postnatala P1-3 C57BL/6/OlaHsd-ungar. Efter att hjärnstammen, plexus åderhinnan och hjärnhinnorna avlägsnats, dissocierades hjärnorna mekaniskt och smältes enzymatiskt i 15 minuter med 1 x trypsin (Gibco) vid 37 grader. Därefter såddes cellsuspensionen ut i DMEM, ett medium med hög glukoshalt (Sigma) kompletterat med 30 procent LCM, 10 procent FCS, 50 U/ml penicillin och 50 U/ml streptomycin i T75-odlingskolvar. Två till 3 dagar senare utfördes ett fullständigt mediumbyte. Blandade gliakulturer skakades (230 rpm, 3h, 37 grader) efter 6-7 dagar för att erhålla rena mikrogliakulturer.

RNA-sekvensering

Celler förbehandlades med floretin (50 μM) i 20 timmar och LPS-stimulerade (100 ng/ml) i 6 timmar. Celllys utfördes med användning av Qiazol Lysis-reagens (Qiagen). RNA extraherades från celler med användning av RNeasy mini kit (Qiagen). Prover bearbetades sedan av Genomics Core Leuven (Belgien). Biblioteksförberedelser utfördes med Lexogens QuantSeq-kit för att generera Illumina-kompatibla bibliotek. Bibliotek sekvenserades på Illumina HiSeq4000 sekvenseringssystem. Splitsningsmedveten anpassning utfördes med STAR v2.6.1b[30]. Kvantifiering av avläsningar per gen utfördes med HT-seq Count v2.7.14. Räknebaserad differentialexpressionsanalys gjordes med R-baserad (The R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österrike) Bioconductor-paket DESeq2. En lista över differentiellt uttryckta gener valdes ut vid ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitativ omvänd transkriptions-PCR

Celler förbehandlades med floretin (50 μM) i 20 timmar och LPS-stimulerades (100 ng/ml) i 6 timmar. Lysering utfördes med användning av Qiazol Lysis-reagens (Qiagen). RNA extraherades med användning av RNeasy mini-kit (Qiagen). RNA-koncentration och kvalitet bestämdes med en Nano-drop-spektrofotometer (Isogen Life Science). cDNA-syntes utfördes med hjälp av Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) enligt tillverkarens instruktioner. qPCR utfördes på ett StepOne-Plus" Real-Time PCR-system (Applied Biosystems) med en SYBR grön blandning innehållande 1× SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM primers (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA och nukleasfritt vatten Den jämförande Ct-metoden användes för att kvantifiera genuttryck Data normaliserades till de mest stabila referensgenerna cyklin A och hypoxantin-fosforibosyltransferas 1. Primersekvenser finns tillgängliga på begäran.

Bestämning av reaktiva syreämnen

Celler förbehandlades med floretin (50 uM) under 2 timmar. Efteråt stimulerades celler med PMA (15 min, 100 ng/ml) och ROS-produktion mättes med användning av den fluorescerande sonden 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat vid 10 μM i PBS under 30 min. Fluorescens mättes med användning av fluorescens FLUOstar optima mikroplattläsare (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) (excitation: 495 nm, emission: 529 nm).

Mätningar av kväveoxid

Celler förbehandlades med floretin (50 μM) i 2 timmar. Efteråt stimulerades celler med LPS (24 timmar, 100 ng/ml). NO övervakades indirekt med hjälp av Griess reagensnitritmätsats (Abcam). Kortfattat reagerar nitrat med sulfanilamid och N-(1-naftyl)etylen-diamin-dihydroklorid för att producera ett rosa azofärgämne. Absorbansen av detta azoderivat mättes sedan vid 540 nm med användning av en mikroplattläsare (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Celler behandlades med floretin（5{{10}} μM） och LPS（100 ng/ml) i 1 timme eller 24 timmar för att bestämma AMPK-aktivering eller p62-, LC3- respektive Keapl-proteinnivåer. Celler lyserades med användning av RIPA-buffert (150 mM NaCl, 1 procent Triton X-100, 0,5 procent natriumdeoxicholat, 1 procent SDS, 50 mM Tris) och separerades via natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores. Geler överfördes till ett PVDF-membran (VWR) och blottar blockerades under 1 timme i 5 procent bovint serumalbumin i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,1 procent Tween-20(TBS-T). Membran sonderades med primära antikroppar över natten vid 4 "C, tvättades med TBS-T och inkuberades med motsvarande sekundära pepparrotsperoxidasmärkta antikropp i 1 timme vid rumstemperatur (RT). Immunoreaktiva signaler detekterades med förstärkt kemiluminescens (ECL Plus, Thermo Fisher) med användning av Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) Densiteterna för banden bestämdes med hjälp av ImageJ.

Immunfluorescens

Ryggmärgskryosektioner lufttorkades och fixerades i iskall aceton i 10 minuter vid - 20 grader. Mus BMDMs odlades på täckglas och fixerades i iskall metanol i 10 minuter vid -20 grad. Sektioner och BMDM blockerades i 30 minuter med Dako proteinblock (Agi-lent). Efteråt inkuberades de över natten vid 4"C med primära antikroppar, tvättades och inkuberades med lämpliga sekundära antikroppar i 1 timme vid RT. Bilder av ryggmärgsvävnaden togs med hjälp av ett Nikon Eclipse 80i-mikroskop (10× objektiv) och NIS Programvaran Elements BR 3.10 (Nikon). Bilder av BMDM färgade för p62, LC3 och Keapl togs med Zeiss LSM 880 konfokalmikroskop och Airyscan-korrigerades (63× objektiv).P62-och LC3- positiva puncta bestämdes genom halvautomatisk puncta analys image J. Kort sagt, efter att bilden gjorts binär och celler valts ut för hand analyserades puncta per cell. P62 och Keapl kolokalisering utfördes med hjälp av en kolokaliseringspipeline i programvaran CellProfiler [31 ]. Bilderna som visas i figurerna är digitalt förbättrade.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeutisk inställning). Möss vägdes och poängsattes dagligen för neurologiska tecken på sjukdomen enligt tillverkarens EAE-poängguide för mus:0:inga kliniska symtom,0.5:svansspetsen är slapp, 1:slapp svans , 1.5: halt svans och bakbenshämning 2: halt svans och svaghet i bakbenen, 2.5: halt svans och släpande bakben, 3: halt svans och fullständig förlamning av bakbenen, 3.5: halt svans och fullständig förlamning av bakbenen ben och mus kan inte räta upp sig när de placeras på sidan, 4: förlamning av diafragman, 5: död av EAE.

Statistisk analys

GraphPad Prism användes för att statistiskt analysera data, som representeras som medel±sem D'Agostino och Pear-son omnibus normalitetstest användes för att testa för normal distribution. Tvåsidigt oparat Students t-test (med Welchs korrigering vid behov) användes för normalfördelade data. Mann-Whitney-analysen användes för data som inte klarade normalitetstestet.p-värden<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Resultat

Transkriptionsförändringar associerade med floretinbehandling av makrofager

För att fastställa potentiella antiinflammatoriska effekter och identifiera underliggande mekanismer för floretinbehandling på makrofager, utförde vi sekvensering av RNA i bulk (kompletterande Fig. 1). Väganalys av aktiverade makrofager behandlade med floretin visade att differentiellt uttryckta gener var överrepresenterade i kanoniska vägar relaterade tillinflammation, såsom iNOS(z-poäng:-2.449), toll-like receptor(z-score:-2.236), interferonsignalering (z-poäng:- 2), och reaktionsväg för akut fas (z-poäng:- 1.633)(Fig.1A, B). I likhet med kanonisk väganalys förutspådde uppströmsanalys av RNA-seq-data att floretin minskade aktiveringen av viktiga pro-inflammatoriska transkriptionsregulatorer som IRF7 (z-poäng:2.229), IRF1(z-poäng:-2. 025)och STAT1(z-poäng:-2.022)(Fig. 1D). Förutom att nedreglera pro-inflammatoriska vägar för makrofager, visade RNA-seq-analys av floretinbehandlade makrofager att floretin, bland andra vägar, aktivt aktiverade Nrf2-vägen (z-poäng: 1,897), vilket framgår av uppreglering av Nrf2-associerad gener såsom mafG och proxy (Fig. 1A, C). Ännu mer identifierades Nrf2(NFE2L2) som den mest aktiverade uppströms transkriptionsregulatorn (z-poäng: 2,801), och reglering av ROS-nivåer identifierades som en av de mest uppreglerade biologiska funktionerna i floretinbehandlade BMDMs (z-poäng: 2,008) (Fig. ID, E). Sammantaget visar fynden att floretin aktiverar Nrf2 och undertrycker den inflammatoriska fenotypen av makrofager.

Nrf2-vägen kontrollerar fenotypen av floretinbehandlade makrofager

Därefter validerade vi den antiinflammatoriska effekten av phloretin och bestämde om det modulerar den inflammatoriska fenotypen av makrofager genom att verka på Nrf2. Minskade ROS-nivåer observerades i floretinbehandlade WT BMDM stimulerade med PMA (Fig. 2A). Dessutom observerades minskad NO-produktion och mRNA-nivåer av pro-inflammatoriska gener NOS2, I-6, COX2 och I-12 i floretinbehandlade WT BMDM stimulerade med LPS (Fig. 2B, C). I relation till den avgörande rollen för Nrf2 för att inducera en mindre inflammatorisk fenotyp, visar våra data att phloretin aktiverar Nrf2-svarsgener HO1 och NQO1 i WT men inte Nrf2 KO BMDM stimulerade med LPS (Fig. 2D). Dessutom minskade floretinbehandling ROS-produktion i WT men inte i Nrf2 KO BMDMs (Fig. 2E). Förutom att kontrollera antioxidativa svar, rapporteras Nrf2 undertrycka den inflammatoriska fenotypen av makrofager [12]. Till stöd för det senare kunde floretin inte minska uttrycket av pro-inflammatoriska gener NOS2, IL-6, COX2 , och IL-12 i aktiverade Nrf2-deficienta BMDMs (Fig. 2F). Sammantaget indikerar dessa resultat att Nrf2 driver det floretinmedierade inflammatoriska fenotypskiftet av makrofager.

Phloretin främjar AMPK-aktivering

Phloretin är en väldefinierad GLUT-hämmare och nyare studier visar vikten av GLUT-medierat glukosupptag för makrofagaktivering [26,32]. Därför bestämde vi om phloretin kunde aktivera energisensorn AMPK, som aktiveras vid låga energi-/glukosnivåer. Våra resultat visar att floretinbehandling leder till AMPK-fosforylering och aktivering (Fig. 3A, B). Dessutom förhindrar tillägget av AMPK-hämmaren BML-275 till stor del AMPK-aktivering i floretinbehandlade BMDM (Fig. 3A, B). Ännu mer visar våra fynd att AMPK-aktivering är väsentlig för att floretin ska undertrycka ROS-produktion, vilket visas av högre ROS-nivåer i BMDMs behandlade med både phloretin och AMPK-hämmare jämfört med BMDMs behandlade med enbart phloretin (Fig. 3C). Totalt tyder våra data på att floretin-inducerad AMPK-aktivering är avgörande för att driva makrofager mot en mindre inflammatorisk fenotyp.

Phloretin stimulerar autofagi på ett AMPK-beroende sätt

Eftersom AMPK-aktivering är relaterad till aktiveringen av kataboliska processer som svar på näringsbrist [33], undersökte vi nästa om phloretin kan aktivera autofagi. Autofagi är en konserverad katabolisk process som induceras vid svält och andra stressreaktioner, vilket främjar den lysosomala nedbrytningen av intracellulär last sekvestrerad i vesiklar som kallas autofagosomer. RNA-seq-analys förutspådde autofagi som en av de nedströms biologiska processerna som visade ökad aktivitet i floretinbehandlade BMDMs (z-poäng: 0.779) (Fig. 4A). Dessutom visade immunocytokemisk analys av BMDMs behandlade med phloretin och autofaginhibitorn bafilomycin Al ökad ackumulering av autofagimarkörerna MAP1LC3/LC3 (mikrotubuli-associerat protein 1 lätt kedja 3) och p62 jämfört med bafilomycin A1-behandlade BMDMs (FigDMs) 4B-D), vilket indikerar ökat autofagiskt flöde vid floretinbehandling [34]. Vid induktion av autofagi omvandlas LC3 från LC3I-formen till den lipiderade LC3I-formen, vilket korrelerar med antalet autofagosomer. I linje med detta bestämdes högre proteinnivåer av LC3II och p62 i floretin-stimulerade BMDMs genom western blöt (Fig. 4E, F). Intressant nog förhindrades denna ökning av p62 och LC3II av floretin genom att behandla BMDM med AMPK-hämmaren BML-275(Fig.4E-F). Sammantaget visar våra data att floretin stimulerar autofagi på ett AMPK-beroende sätt.

Phloretin aktiverar Nrf2-vägen genom autofagi-medierad Keap1-nedbrytning

Våra data visar att phloretin aktiverar Nrf2 och stimulerar autofagi i makrofager. Intressant nog kan autofagireceptorn p62 konkurrera med Nrf2 för bindning till Keapl, adaptern som underlättar Nrf2 ubiquitination och nedbrytning under normala förhållanden. Denna p62-förmedlade dissociation av Keap1/Nrf2 kommer därför att förhindra Nrf2-nedbrytning och så småningom leda till Nrf2-aktivering [35]. Av denna anledning bestämde vi om phloretin främjar p62/Keapl-interaktion och därigenom aktiverar Nrf2-vägen. Här visar vi att floretin aktiverar Nrf2-vägen genom p62-medierad Keapl-nedbrytning i makrofager. Genom att använda högupplöst Airyscan konfokalmikroskopi kombinerat med kolokaliseringsanalys visar vi att floretin stimulerar interaktionen mellan p62 och Keapl, vilket visas av ett ökat värde på kolokaliseringsparametern (Pearsons koefficient) i floretinbehandlade BMDM (Fig. 5A) , B). Dessutom visar våra fynd att lägre proteinnivåer av Keapl finns i floretinbehandlade BMDM, vilket bekräftar nedbrytning av Keapl (Fig. 5C). För att bekräfta att nedbrytningen är autofagiberoende lade vi till autofaginhibitorn bafilomycin A1 till floretinbehandlad BMDM. Intressant nog vändes denna minskning av Keapl genom behandling med bafilomycin Al (Fig. 5C). Dessa resultat bekräftades med western blöt, som visade en minskning av Keapl-proteinnivåer i floretinbehandlade BMDMs som förhindrades av bafilomycin Al (Fig. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), minskade floretin sjukdomens svårighetsgrad (Fig. 6B). Minskad sjukdomsallvarlighet hos floretinbehandlade djur åtföljdes av ett minskat uttryck av inflammatoriska gener MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 och CXCL2 i ryggmärgen (Fig. 6C). Dessutom hittades en minskad mängd F4/80t-celler i ryggmärgen hos floretinbehandlade djur (Fig. 6E, F). Eftersom både F4/80*microglia och F4/80* makrofager bidrar till neuroinflammation, visade en mer djupgående analys att floretin markant minskade mängden F480 plus TMEMl19-

makrofager i EAE-möss (kompletterande Fig. 2 DF) medan en icke-signifikant trend observerades mot en reduktion i F480 plus TMEMl19 plus mikroglia. I enlighet med detta fynd undertryckte floretin produktionen av inflammatoriska mediatorer i mikroglia men denna undertryckning var mindre uttalad jämfört med makrofager (kompletterande Fig. 2 AC). Dessa fynd tyder på att EAE-förbättring av floretin huvudsakligen är makrofagdriven. Förutom att minska uttrycket av inflammatoriska gener, ökade floretin uttrycket av antiinflammatoriska och neurotrofiska faktorer, dvs. IL-4, CNTF och IGF-1 i ryggmärgen hos EAE-djur (Fig. 6D) ). Dessa fynd tyder starkt på att floretin minskar EAE-sjukdomens svårighetsgrad genom att driva makrofager mot en sjukdomslösande fenotyp. I linje med våra tidigare fynd in vitro upptäckte vi också förhöjd Nrf2-signalering i CNS hos floretinbehandlade EAE-djur, vilket indikeras av ökat mRNA-uttryck av Nrf2 och dess nedströmsmål NQO1 och GPX1 (Fig. 6G). Sammantaget visar dessa data att floretin undertrycker neuroinflammation i både en profylaktisk och terapeutisk miljö. Dessutom indikerar våra fynd att phloretin kan minska neuroinflammation genom att undertrycka de inflammatoriska egenskaperna hos makrofager genom Nrf2-aktivering.

Diskussion

I den här studien visar vi att floretin driver makrofager mot en mindre inflammatorisk fenotyp på ett Nrf2-beroende sätt. AMPK-beroende aktivering av autofagi och efterföljande Keapl-nedbrytning visade sig ligga bakom Nrf2-aktivering av floretin. Dessutom bekräftar vi de antiinflammatoriska effekterna av floretin i en EAE-modell där det minskar sjukdomens svårighetsgrad och lindrar makrofagberoendeneuroinflammation.

Vi visar att floretin undertrycker den inflammatoriska fenotypen av makrofager. Detta är i linje med resultaten av Wei-Tien Chang et al. som visade att floretin har antiinflammatoriska egenskaper i en makrofagcellinje [36]. Vi visar att induktionen av detta fenotypskifte är beroende av Nrf2. Nrf2 är en mästerregulator av antioxidativa svar och dess aktivering är känd för att driva makrofager mot en antiinflammatorisk fenotyp [1l, 12, 37]. Dessutom har flera studier definierat att Nrf2-aktivering dämpar neuroinflammation och neurodegeneration vid CNS-störningar [{{10 }}]. Men även om våra resultat visar att Nrf2 ligger bakom fenotypförskjutningen av floretinbehandlade makrofager, visade RNA-sekvenseringsdata att, bland Nrf2-aktivering, andra vägar uppreglerades. I synnerhet är uppregleringen av PPAR-vägen av intresse på grund av dess antiinflammatoriska egenskaper och överhörning med Nrf2 [41-45]. Dessutom, eftersom floretin är en väldefinierad GLUT-hämmare och att byta till glykolys är en avgörande metabolisk händelse för makrofagaktivering, kan fenotypförändringar också delvis induceras av direkta metaboliska effekter av floretin på dessa glukostransportörer [46,47]. Mer forskning är motiverad för att definiera relevansen av PPAR i floretin-inducerad Nrf2-aktivering och i vilken grad floretin-inducerad immunmodulering påverkas av direkta metaboliska förändringar. Sammantaget visar våra resultat tydligt att Nrf2-aktivering spelar en viktig roll i den phloretin-medierade fenotypbytet.

Våra resultat tyder på att Nrf2-aktivering av phloretin förmedlas av AMPK-aktivering. AMPK spelar en avgörande roll för att återställa cellulär energihomeostas i fallet med påfrestningar som utarmar ATP vilket resulterar i ökat ADP: ATP-förhållande, och kopplar därigenom på alternativa kataboliska vägar som genererar ATP, samtidigt som de stänger av anabola vägar som konsumerar ATP [48]. På motsvarande sätt är floretin en väletablerad GLUT-hämmare och sänker cellulära glukosnivåer [49-51]. Flera studier visade att AMPK-aktivering i makrofager inducerar en immunsuppressiv fenotyp, vilket bekräftar våra resultat som visar att AMPK-aktivering är avgörande för att floretin ska sänka inflammation [52,53]. Våra data överensstämmer också med tidigare studier där floretin har visats aktivera AMPK i andra celltyper inklusive adipocyter och endotelceller [50, 54-56]. Phloretin kan aktivera AMPK indirekt genom att öka AMP och sänka ATP-nivåerna, eftersom AMP och ATP allosteriskt stimulerar respektive hämmar AMPK-aktivering [48, 57]. Ändå kan CaMKK, som är ett kinas uppströms om AMPK, främja AMPK-aktivering som svar på ökade cellulära Ca2 plus-nivåer utan någon förändring i AMP/ATP-nivåer [58]. Dessutom, med tanke på det breda nätverket av samspelet mellan AMPK och upp- och nedströms vägar, behövs ytterligare forskning för att klargöra den underliggande mekanismen för floretin-inducerad AMPK-aktivering.

Våra data tyder på att floretin-medierad AMPK-aktivering stimulerar autofagi i makrofager. Som nämnts ovan är AMPK-aktivering en självskyddande process som syftar till att återställa cellens energibalans [48]. Även om ingen studie någonsin har visat att floretin kunde stimulera fenotypen av makrofager genom att främja autofagi, har vissa studier ändå visat en effekt av floretin på autofagivägar i cancerceller och hepatocyter [59-61]. Dessutom visar olika studier att nedströms kataboliska processer av AMPK-aktivering kan aktivera autofagi [60, 62, 63]. Intressant nog, som svar på glukossvält, induceras AMPK-medierad autofagi av fosforylering av den viktiga autofagiinitiatorn unc-51 som autofagiaktiverande kinas [64,65]. Med avseende på detta spekulerar vi att AMPK stimulerar autofagi för att återställa ATP från cellulära komponenter som svar på floretin-inducerad glukosutarmning. Men glukossvält kan också aktivera autofagi på ett AMPK-oberoende sätt [66-68]. Därför är mer forskning nödvändig för att avgöra om autofagiaktivering av phloretin också sker delvis oberoende av AMPK.

Nyligen genomförda studier visade vikten av autofagi för att driva den funktionella makrofagfenotypen. I detta sammanhang har dysreglering av autofagi i makrofager särskilt kopplats till uppkomsten av ateroskleros och neurologiska sjukdomar [69-72]. Här tillhandahåller vi en koppling mellan floretinbehandling, autofagi-induktion och Nrf2-aktivering genom att visa att phloretin främjar Nrf2-aktivering via p62-medierad nedbrytning av Keap1. Tills nyligen betraktades en ökning av p62 puncta som ett tecken på minskad autofagi eftersom p62 bryts ned i autofagosomer vid aktivering av autofagi [34]. I relation till detta har p62-ackumulering kopplats till autofagdysfunktion i aterosklerotiska lesioner [73]. Denna uppfattning har dock utmanats under de senaste åren och man tror nu att p62 är nödvändigt för bildandet av autofagosomer och att en ökning av p62-nivåer parallellt med en ökning av LC3Il puncta kan vara ett tecken på autofagi-induktion [74]. Därför, tillsammans med floretins förmåga att aktivera AMPK och dess kända roll i autofagiaktivering, tyder våra resultat på att P62- och LC3-ackumuleringen vid bafilomycin A1-behandling i floretinstimulerade makrofager beror på ökat autofagiskt flöde och inte på försämrad autofagi. Intressant nog, Lee Y et al. visade nyligen att, förutom att aktivera Nrf2, är p62-bindning till Keapl också involverad i autofagosombildning, vilket tyder på att floretinmedierad autofagiaktivering är direkt kopplad till ökad p62-aktivitet å ena sidan, men också till mer Keapl-p62-interaktion å andra sidan [ 75]. Keapl är en adapter av Cullin-3-baserat ubiquitinligas som bildar en homodimer med Nrf2 vid homeostatiska förhållanden, och därigenom främjar Nrf2 ubiquitination och proteasomal nedbrytning [76]. Störning av Keapl-Nrf2-komplexet leder till Nrf2-stabilisering och translokation till kärnan [77, 78]. Det är väldokumenterat att störningar av detta komplex sker antingen via modifiering av Keapl-cysteinrester av elektrofila molekyler, direkt interaktion mellan små molekyler med Keapl eller p62-förmedlad Keapl-nedbrytning [35]. Ying Y et al. föreslår en direkt interaktion mellan floretin och Keapl baserat på i silico-experiment, vilket sedan leder till aktivering av Nrf2-vägen i en kardiomyocytcellinje [79]. Här etablerade vi en ytterligare autofagi-relaterad mekanism genom vilken phloretin aktiverar Nrf2.

Genom att använda EAE-modellen fastställde vi att floretin lindrar neuroinflammation in vivo. Våra data tyder starkt på att floretin förbättrar EAE genom att undertrycka det inflammatoriska svaret som medieras av makrofager och aktivera Nrf2-vägen. I andra sjukdomsmodeller rapporterades även floretin utöva neuroprotektiva och immunmodulerande egenskaper. I synnerhet visade sig floretin aktivera Nrf2-vägen i hjärnan vid cerebral ischemi och minska amyloid beta-ackumulering i råttmodellen för Alzheimers sjukdom [80-84]. Phloretin kan också påverka andra immunceller in vivo, eftersom denna förening har visat sig hämma T-cells- och dendritiska cellaktivering in vitro [85, 86]. Med tanke på att neuroinflammation i EAE-modellen inte är rent makrofagberoende, skulle det vara av intresse att definiera i vilken utsträckning minskningen av neuroinflammation medieras av andra immunceller. Med avseende på detta, även om våra data tyder på att EAE-förbättring huvudsakligen drivs av makrofager och är mindre beroende av mikrogliamodulering, behövs ytterligare experiment för att klargöra i vilken utsträckning phloretin påverkar mikroglia i neuroinflammatoriska sjukdomar. Sammantaget visar våra resultat att floretin minskar neuroinflammation genom att påverka fenotypen av makrofager, vilket visar den terapeutiska potentialen hos phloretin för neuroinflammatoriska störningar.

Slutsatser

Vår studie visar att floretin är ett potent immunmodulerande medel som modulerar de inflammatoriska egenskaperna hos makrofager vid neuroinflammatoriska störningar. Aktivering av Nrf2-vägen, medierad av AMPK-beroende autofagiaktivering och efterföljande Keapl-nedbrytning, etablerades för att driva detta fenotypskifte. Därför är floretin ett lovande naturligt förekommande medel som kan användas för att sänka den inflammatoriska bördan av neuroinflammatoriska sjukdomar som MS.

Referenser

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Dihydromyricetin förbättrar skumcellbildning via LXRalpha-ABCA1/ABCG1-beroende kolesterolutflöde i makrofager. Biomed Pharmacother. 2018;101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et al. Antocyaniner inducerar kolesterolutflöde från mus peritoneala makrofager: rollen för den peroxisomproliferatoraktiverade receptorn {gamma}-lever X-receptorn {alfa}-ABCA1-vägen. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Quercetin förbättrar ABCA1-uttryck och kolesterolutflöde genom ap38-beroende väg i makrofager. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Fysiologin hos skummande fagocyter vid multipel skleros. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofager undergrupper och mikroglia vid multipel skleros. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multipel skleros: mekanismer och immunterapi. Nervcell. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et al. Stearoyl-CoA-desaturas-1 försämrar de reparativa egenskaperna hos makrofager och mikroglia i hjärnan. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Myelin-fagocytoserande makrofager modulerar autoreaktiv T-cellsproliferation. J Neuroinflammation. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Myelin-härledda lipider modulerar makrofagaktivitet genom aktivering av lever X-receptor. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et al. Myelin förändrar den inflammatoriska fenotypen av makrofager genom att aktivera PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.