Fysisk träning hämmar fibrosbildningen vid Alzheimers sjukdom Njure som påverkar TGFB-signalvägarna

edmund.chen@wecistanche.com

INTRODUKTION 

Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste formen av demens, men dess systemiska utseende har börjat diskuteras först under de senaste decennierna. Även om stora ansträngningar har gjorts för att utveckla läkemedel och sjukdomsmodifierande terapier, finns det hittills inga botande förfaranden [1–3]. Bildandet av amyloidplack och onormal funktion av amyloidproteinprekursorer (APP) anses vara första tecken på sjukdomen inte bara i det centrala nervsystemet (CNS) utan även i periferin [4]. Övertygande bevis stöder den centrala rollen för amyloid-B (AB) i patogenesen av AD [5] och påpekar att den minskade clearance av AB är en av nyckelprocesserna i patomekanismen. I AD är flera perifera organ involverade såsom testiklarna [5], pankreas [6] ochnjure[7], som belyser utvecklingen av en komplex systemisk sjukdom med flera mål [8]. Det har bevisats attnjureär inblandad i AB-röjning [9]. Dessutom är serumkoncentrationen av AB signifikant förhöjd i kroniskanjursjukdom (CKD) patienter [10, 11]. AB-ackumulering har också påvisats injure[12], vilket leder till en filtrationsstörning. Korrekt filtrering regleras delvis av transformerande tillväxtfaktor B (TGFB), som är ett mastercytokin i patogenesen avnjur-inflammation och fibros [13], och det är också känt som en viktig faktor i AD-patogenes [14]. I AD spelar TGFB-signalering en roll i mikroglialaktivering och astrocytmedierad neuroprotection [15]. Dessutom påverkar förändrat uttryck av TGFB också inflammationen i CNS och perifera vävnader [13, 16].

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSJUKDOMAR

TGFB har tre isoformer: TGFB1, TGFB2 och TGFB3 [17]. TGFB1 deltar i flera processer såsom fosterutveckling, kontroll av celltillväxt och differentiering, fibros och ärrvävnadsbildning, tumörtillväxt och immunsvar [18]. Det är ett viktigt cytokin vid fibrosbildning i olika organ som levern ochnjure[19]. TGFB1 bildar dimerer, som först binder till TGFB typ II-receptor (TGFRII), sedan aktiverar TGFB-receptor typ I (TGFRI) Ser/Thr-kinas, vilket initierar intracellulärt signalkomplexbildning av Smad-transkriptionsfaktorer. I den kanoniska TGFB-signalvägen fosforyleras Smad2/3-transkriptionsfaktorer och, efter komplexbildning med Smad4, translokeras in i kärnan [20]. Flera gener kan påverkas av TGFB1-aktivering eftersom det inducerar uttrycket av olika kollagener, kontrollerar cellproliferation, påverkar apoptos [20] och reglerar uttryck av matrixmetalloproteinas (MMP) [21]. Den icke-kanoniska TGFB-signalvägen initierar aktiveringen av MAPKes genom fosforylering som i sin tur kan inducera ytterligare TGFB-uttryck [22]. JNK- och p38-kinaser som TGFB-mål identifieras injur-fibros och reglera apoptos [23].

Fysisk aktivitet har visat sig ha positiva effekter hos mänskliga patienter. Träning kan reglera och skjuta upp manifestationen av AD [24, 25] och minskning av AD-biomarkörer som tau och AB i plasma har också rapporterats [25]. Fysisk aktivitet har visat sig minska förekomsten av AD, AD-associerad neuropatologisk börda och kognitiv försämring [26]. Även om många studier har publicerats om fördelarna med fysisk aktivitet på AD-bildning [27], har de intracellulära mekanismerna som är involverade i dessa positiva effekter inte diskuterats i detalj. Det finns ett fåtal djurmodeller där genetiskt modifierade möss med tau- och AB-överuttryck har testats under fysisk träning. I dessa modeller har det bevisats att förhöjd fysisk aktivitet kunde skjuta upp manifestationen av AD [28, 29]. Vidare visades det att långvarig träning av dessa möss hade positiva effekter på perifera organdysfunktioner vid AD. Fysisk aktivitet förändrade PACAP-BMP-överhörningen i ADnjurargenom att normalisera uttrycket av kollagen typ IV och A ackumulering [30]. Dessutom har en detaljerad analys av den skyddande funktionen av träning på Sox9-uttryck i AD-testis publicerats [31]. Aktiv träning påverkar också TGFB-signalering eftersom den undertryckernjur-inflammation och efterföljande fibros [32]. Dessutom är TGFB och dess signalering viktig för benombyggnad hos vuxna som störs injurefibros [33]. Därefter var vår huvudsakliga hypotes att långvarig fysisk träning har en systemisk effekt på TGFB-signalering som kan regleranjurematrisproduktion i AD. Förändringarna av dessa signalvägar kan resultera i minskade njurefibros och normalisera AD-clearance. Därför var vårt mål att belysa sambandet mellan TGFB-signalering och gynnsamma effekter av fysisk träning pånjurefifibros i AD. I våra experiment presenterar vi bevis för att långvarig träning har direkta effekter på TGFB-signalisering injurarav AD-möss. Vidare visar vi att ökad fysisk träning minskarnjurefibros via normalisering av kanonisk och icke-kanonisk TGFB-signalisering.

Nyckelord:Alzheimers sjukdom, fibros, fysisk aktivitet, Smad, njursjukdom; njur-

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURDIALYS

MATERIAL OCH METODER

DjurAlzheimer-transgena hanmöss (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) användes för att följa effekten av AD. Tre månader gamla vildtyp (WT) (ingen transgen modulering och ingen träning) (n=5), Alzheimers transgena möss (AD) (n=5) och tränad AD (TAD) (n=5) möss hölls under ljus/mörker-cykler på 12/12 timmar med mat och vatten ad libitum. Intervalllöpning användes för tränings- och kombinationsgruppen. Tidigare var alla motionerande djur vana vid det motordrivna löpbandet (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) och löphastigheten under 2 veckor. Träningen genomfördes fyra gånger i veckan, under 60 min. Varje träningspass varade i 10 cykler, varje cykel bestod av 4 min högintensiv löpning och 2 min lågintensiv löpning. Löphastigheten med låg intensitet var permanent under experimentet, vilket innebär en hastighet på 10 m/min. Medan högintensiv löphastighet började på 16 m/min och höjdes var tredje vecka med 1 m/min tills 20 m/min nåddes. Kontroll- och näringsgruppen vände sig också till löpbandet och stannade där i 5 min/dag på ett stående löpband [28]. Experiment inleddes med 3-månader gamla djur och avslutades vid 10 månaders ålder. Studien genomfördes i enlighet med etiska riktlinjer (etiskt tillståndsnummer för denna studie: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweis University, Ungern). Phire Animal Tissue Direct PCR Kit användes för genotypning av djuren (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner.

Ljusmikroskopisk morfologiEfter att alla kognitiva tester var klara, sövdes {{0}} månader gamla möss med en intraperitoneal injektion av ketamin (Richter, koncentration: 100 mg/ml)/xylazin (Produlab Pharma, koncentration: 20 mg/ ml) cocktail i en dos av 0,1 ml/10 g kroppsvikt och transkardiellt perfunderad med hepariniserad iskall koksaltlösning [28] ochnjurartogs bort. Vävnadsprover tvättades i PBS tre gånger och fixerades i en 4:1 blandning av absolut etanol och 40 procent formaldehyd, sedan inbäddades i paraffin. För Massons trikromfärgning (Sigma-Aldrich, MO, USA) gjordes seriesnitt och fibrotisk vävnad visualiserades. Färgningsprotokollet utfördes enligt tillverkarens instruktioner. DP74-kamera (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) på Olympus Bx53-mikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) användes för att ta mikrofotografier.

Immunhistokemiutfördes pånjurevävnadsprover från WT, AD-möss och TAD-möss för att visualisera lokaliseringen av Smad2, PCNA (prolifererande cellkärnantigen) och kollagen typ I (Kol. I) [30].Njurarfixerades i en 4:1-blandning av absolut etanol och 40 procent formaldehyd och tvättades i 70 procent etanol. Efter att inbäddningsseriesektioner gjorts, följdes avparaffinering av sköljning i PBS (pH 7,4). Icke-specifika bindningsställen blockerades med 1 procent bovint serumalbumin löst i PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Sektioner inkuberades med polyklonal Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) vid en utspädning av 1:500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) vid en utspädning av 1:800 eller Col. I (Sigma-Aldrich, MO, USA) antikropp vid en utspädning av 1:500 vid 4◦C över natten. Primära antikroppar visualiserades med tillsats av anti-kanin Alexa Fluor 555 sekundär antikropp (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) användes i en utspädning av 1:1000. Prover monterades i Vectashield-monteringsmedium (Vector Laboratories, Peterborough, England) innehållande DAPI (4,6-Diamidino-2-fenylindoldihydroklorid) för nukleär DNA-färgning. Anti-kanin Alexa Fluor 555 användes utan de primära antikropparna för negativ kontroll. Mikrofotografier togs med DP74-kamera (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) på Olympus Bx53-mikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) för visualisering av Col. I. Bilder togs med hjälp av cellSense Entry 1.5-programvaran (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan ) med konstanta kamerainställningar för att möjliggöra jämförelse av FL-fluorescerande signalintensiteter. För Smad2- och PCNA-detektering användes ett Olympus FV3000-konfokalmikroskop (Olympus Co. Tokyo, Japan) som applicerade 60× oljesänkningsobjektiv (NA: 1,42). För excitation användes laserlinjer på 543 nm. Den genomsnittliga pixeltiden var 4Bs. Z-bildserier med 1 m optisk tjocklek spelades in i sekvensiell skanningsläge. Bilder av Alexa555 och DAPI överlagrades med programvaran Adobe Photoshop version 10.0. Kontrasten på bilder ökades lika mycket utan att ändra konstanta inställningar.

RT-PCR-analysNjurarav WT (n=5), AD (n=5) och TAD (n=5) maldes mekaniskt och löstes i Tri zol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ), efter 30 minuters inkubation vid 4◦C och totalt RNA isolerades [30]. RNA skördades i RNasfritt vatten och lagrades vid -70◦C. High Capacity RT-kit användes för omvänd transkription (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). För sekvenserna för de applicerade primerparen och detaljer om polymeraskedjereaktioner, se Tabell 1. Amplifieringar utfördes i en termisk cykler (Labnet MultiGene™ 96-well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA) som följer: 95◦C, 2 min, följt av 35 cykler (denaturering, 94◦C, 30 s, hybridisering i 45 s vid optimerade temperaturer enligt tabell 1; förlängning, 72◦C, 90 s) och sedan 72◦C ,

7 min. Aktin användes som intern kontroll. PCR-produkter analyserades med användning av en 1,2 procent agarosgel innehållande etidiumbromid och dokumenterades med FluorchemE geldocumetary system (ProteinSimple, CA, USA). Optiska densiteter för PCR-produktsignaler bestämdes med hjälp av ImageJ 1,40 g gratisprogram. Före optiska densitetsmätningar gjorde vi individuella kalibreringar på varje mikrofotografi. Sedan ökade vi förstoringen av fotona för att nå individuell pixelstorlek och med frihandsmetoden ringades banor exakt in och mätte områdets integrerade täthet. Pixlarna mättes i 5 oberoende experiment av 3 oberoende operatörer. Signaler jämfördes först med WT-aktinet för en bättre jämförelse av uttrycksskillnader i AD- och TAD-möss. Siffror under fälten visar den statistiska analysen av experimenten där varje separat experiment (minst 5) normaliserades för sin egen aktinsignal och sedan beräknades statistiska skillnader.

Western blot-analys

Njurarav WT (n {{0}}), AD (n=5) och TAD-möss (n=5) tvättades i fysiologisk saltlösning N och lagrades vid –7{{1 0}}◦C. Prover maldes mekaniskt i flytande kväve och uppsamlades i 100 ml homogeniserings-RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)-buffert (150 mM natriumklorid; 1,0 procent NP40, 0,5 procent natriumdeoxicholat; 50 mMTris, pH 8,0) innehållande proteininhibitorer (Aprotininhibitorer). 10 g/ml), 5 mM bensamidin, Leupeptin (10 ug/ml), trypsinhämmare (10 g/ml), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluorid, 1 mM Na-ortovanadat). Pellets sonikerades genom pulserande skur under 30 s vid 40 A (ColeParmer, IL, USA). Totala cellysat för westernblot-analyser framställdes [30]. 20 g protein separerades i 7,5 procent SDS-polyakrylamidgeler för detektering av TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, Klyvd kaspas3, MMP9, kollagen typ I (Kol. I) och aktin. PhosphoSer/Thr-detektionskit (Millipore, Billerica, MA, USA) användes för att detektera fosforyleringsnivån av Ser/Thr-aminosyrasidokedjor. Proteiner blottades på nitrocellulosamembran och exponerades för de primära antikropparna över natten vid 4◦C i spädningen enligt tabell 2. Inkubation följdes av 30 min PBST-tvättning, sedan täcktes membranen med den peroxidaskonjugerade sekundära antikroppen antikanin-IgG i en 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) eller anti-mus IgG i 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) utspädning. För detektion användes förbättrad kemiluminescens (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Aktin användes som intern kontroll. Signaler fångades med en kyld kamera på ett geldokumentärsystem (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, USA). Optiska densiteter av signaler mättes med hjälp av ImageJ 1,40g freeware. Före optiska densitetsmätningar gjorde vi individuella kalibreringar på varje mikrofotografi. Sedan ökade vi förstoringen av fotona för att nå individuell pixelstorlek och med frihandsmetoden ringades banor exakt in och mätte områdets integrerade täthet. Pixlarna mättes i 5 oberoende experiment av 3 oberoende operatörer. Signaler jämfördes först med WT-aktinet för en bättre jämförelse av expressionsskillnader i AD och TAD. Siffrorna under fälten visar den statistiska analysen av experimenten där varje separat experiment (minst 5) normaliserades till sin egen aktinsignal och sedan beräknades statistiska skillnader.

Statistisk analysAlla data är representativa för minst fem oberoende experiment. För alla figurer valdes proverna av samma WT-, AD- och TAD-djur med deras inre kontroll för bättre jämförelse. Endast ett demonstrationsfoto från samma djurgrupp användes i varje figur. Statistisk analys utfördes genom envägsvariansanalys (ANOVA), följt av Tukeys HSD post-hoc-test. Tröskeln för statistiskt signifikanta skillnader jämfört med kontrollprover sattes till ∗p < 0.05="" och="" till="" ad-prov="" #p="">< 0,05.="" ∗="" indikerar="" skillnaderna="" wt="" jämfört="" med="" ad="" och="" tad,="" #="" indikerar="" skillnaderna="" ad="" jämfört="" med="">

RESULTAT

Fysisk aktivitet normaliserade den kanoniska TGF-signalvägen i njurar hos AD-mössUttryck av elementen i den kanoniska TGFB-signalvägen undersöktes i detalj. Protein- och mRNA-uttryck av TGFB1 visade ingen signifikant skillnad närnjurarav WT- och AD-möss jämfördes men det ökade uttrycket hittades i TAD-prover (Fig. 1A, B). Uttryck av TGFRI minskade i AD men fysisk aktivitet normaliserade det (Fig. 1A, B), medan uttrycket av TGFBRII ökade injurarav AD-möss men minskade efter fysisk aktivitet (Fig. 1A, B). I linje med dessa observationer ökade uttrycket av Smad2 i AD-prover och det normaliserades efter fysiskaktivitet (Fig. lA, B). Tvärtom, uttrycket av Smad3 visade en måttlig minskning avnjurarav AD-möss som kompenserades i TAD-prover (Fig. lA, B). Förhöjning av Smad2-positiva signaler sågs i det tubulära systemet i cortex men inte injur-blodkroppar hos AD-möss. Denna höjning reducerades i tubuli av TAD-djur (Fig. IC).

Icke-kanoniska signalvägar modifierades i njurar hos AD-möss efter fysisk aktivitetMAPK-er, såsom ERK, p38 och JNK, utgör en viktig del av icke-kanonisk TGF-signalering [22]. mRNA-uttryck av ERK förändrades intenjurarav AD-möss men visade en minskning av TAD-prover (Fig. 2A). Proteinuttryck av detta kinas var inte i korrelation med mRNA-uttrycket och en stark minskning upptäcktes injurarav AD-möss med en måttlig normalisering efter ökad fysisk aktivitet (Fig. 2B). Den aktiva, fosforylerade formen var intressant förhöjd i AD-prover och visade en liknande minskning avnjurarav TAD-möss (Fig. 2B). mRNA-uttryck av p38 förändrades inte signifikant i några prover (Fig. 2A). Proteinuttryck av p38 ökade kraftigt injurarav AD-möss som delvis kompenserades av fysisk aktivitet (Fig. 2B). Intressant nog visade den mer aktiva fosforylerade formen en minskning av AD-prover som

normaliserades i TAD-djur (Fig. 2B). mRNA-uttryck av JNK reducerades både i AD- och TAD-prover (Fig. 2A). Proteinuttryck av de två isoformerna av JNK detekterades genom western blot-analys. Icke-redundanta funktioner för JNK1 och JNK2 har avslöjats [34] och det upptäcktes en signifikant minskning av 57 kDa isoform och 46 kDa isoform i AD-prover (Fig. 2B). 57 kDa och 46 kDa isoformer visade en förhöjning efter fysisk aktivitet injurarav TAD-möss (Fig. 2B).

Förändrat uttryck av Ser/Thr-fosfataser och modifierad proteinfosforylering i ADFörändrad Ser/Thr-specifik proteinfosfatasuttryck och funktion har visats i AD [35, 36]. Vi upptäckte ett ökat uttryck av PP2B injurarav AD-möss, men det reducerades av fysisk aktivitet (Fig. 2A, B). Tvärtom uppträdde uttrycket av det andra större cellulära Ser/Thr-specifika fosfataset, PP2A, med en kraftig minskning avnjurarav AD-möss (Fig. 2A, B). I TAD-prover ökade mRNA och proteinuttryck av PP2A-katalytisk subenhet (Fig. 2A, B). Undersökning av proteinfosforylering på Ser/Thr-rester visade en stark signal vid 55 kDa injurarav AD-möss, som representerar molekylvikten för tau (Fig. 2C). Ett annat förhöjt band uppträdde vid 10 kDa, vilket motsvarar molekylvikten för den kluvna C-terminalen av APP (Fig. 2C). Fosforyleringen av båda dessa proteiner reducerades vid träning (Fig. 2C).

TGF-signalering påverkade cellcykeln och apoptosSom markörer för cellproliferation övervakades p21- och PCNA-expressionsnivåer. TGFB-aktivering är känd för att inducera uttrycket av p21 [37]. Dessutom resulterar TGFB1-aktivering i förändrad cellproliferation [38]. Därför undersöktes uttryck av prolifererande cellkärnantigen (PCNA). Proteinnivån av p21 var signifikant förhöjd i AD men reducerades i TAD-prover (Fig. 3A, B). PCNA svarade annorlunda: AD orsakade en minskning av proteinuttryck, medan PCNA-protein ökade vid träning (Fig. 3A, B). Immunhistokemi utfördes för att identifiera PCNA-positiva celler och resulterade i minskad immunreaktivitet i tubulära celler i njurar hos AD-möss. Intressant nog visades en normaliserad PCNA-positivitet i tubulära celler i TAD-möss. Inga PCNA-positiva celler upptäcktes injur-blodkroppar (Fig. 3C). Eftersom TGF1-signalering kan påverka apoptos [39], undersöktes den aktiva formen av proapoptotisk kaspas3. Även om ett lätt mRNA-uttryck av caspas3 detekterades i WT-prover, visades inget spjälkat, aktivt kapas3. Tvärtom uppträdde ett starkt mRNA och klyvt kaspas3 i AD-prover, medan ökad fysisk aktivitet minskade uttrycket av det proapoptotiska proteinet (Fig. 3A, B).

Njurfibros nedreglerades av fysisk aktivitetTidigare resultat indikerar möjlig fibros i njurar hos AD-djur. Först undersöktes MMP9-uttryck, som kan regleras via TGFB1-aktivering, [21]. mRNA från MMP9 uttrycktes i alla prover men visade en signifikant ökning endast i njurarna hos TAD-möss. Proteinuttryck av matrismetalloproteinaset var vid detektionsgränsen i WT-prover men visade en signifikant förhöjning hos AD-djur. Överraskande nog ökade aktiv fysisk träning dramatiskt MMP9-uttrycket (Fig. 4A, B). Den andra komponenten i fibrotiska processer är den ökade avsättningen av kollagen typ I injure[40]. I WT-prover detekterades lågt mRNA och proteinuttryck av kollagen typ I men en kraftig ökning visades hos AD-djur. Aktiv fysisk rörelse normaliserade både mRNA och proteinuttryck av kollagen typ I (Fig. 4A, B). Kollagen typ I omger normalt tubuli och är lokaliserad även i interstitium. Med rutin patohistologisk färgning av Massons trikrom representerar blå färg närvaron av någon typ av kollagen, som var synlig runt tubuli,njur-blodkroppar och en liten mängd i interstitium i WT njurar. I AD-prover var en kraftig ansamling synlig i interstitium och i vissa tubuli. Efter fysisk aktivitet minskade mängden kollagen och ingen ackumulering upptäcktes i interstitiet (Fig. 4C). Kollagen typ I immunhistokemi utfördes för att specificera det ackumulerade kollagenet. I WTnjurar, på samma sätt som Massons färgning, uppträdde signaler runt tubuli,njur-blodkroppar och en svag interstitiell signal var också synliga. I prover från AD-möss visades en stark immunopositivitet i interstitium och runt det tubulära systemet. Överraskande nog var en minskning synlig i den interstitiella vävnaden, men en signifikant signal dök upp i den apikala delen av tubuli-epitelcellerna i TAD-djur (Fig. 4D).

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA

DISKUSSION

Även om processen för AD-bildning diskuteras brett i CNS, undersöks inte förändringar och möjliga perifera åtföljande patologier i detalj. Vår huvudsakliga hypotes var detnjurefibros är en möjlig process som påverkar AD manifestation och A-ackumulering. Å andra sidan har långvarig fysisk träning en positiv effekt på AD som kan ha en korrelation med den systemiska förändringen TGFB-signalvägen. Perifera organ har visats vara involverade i AD-patogenes, eftersom bland annat en förändrad metabolisk enzymaktivitet har upptäckts hos AD-patienter [41] och ackumulering har visats i pankreas [42] och injure[30]. Denna systemiska sjukdom som påverkar olika organ gör AD tidig diagnos och botbarhet svår. Clearance av AD från CNS regleras delvis av astrocyter och mikroglia men en del efter att ha passerat genom blod-hjärnbarriären kan avlägsnas i periferin [43]. Detta perifera clearance anses vara ett av de möjliga läkemedelsmålen för att minska AD-koncentrationen i plasma [44]. Utsöndringen av små molekyler från njurarnas proximala tubuli representerar en vital homeostatisk funktion och kan ta del i utsöndringen av toxiner eller proteiner i urinen [45]. Det har visats att AD utsöndras i urinen och kan vara ett diagnostiskt tecken på demens [46]; dessutom kan njurdysfunktion hos äldre öka risken för demens [47], och man fann att serumnivåerna av AD var signifikant högre hos kroniska kroniska sjukdomar [10]. Dessa data indikerar en möjlig funktion avnjurei AD-röjning i periferin. Fysisk träning har visat sig ha positiva effekter på njurfunktionen eftersom den bevarade korrekt glomerulär morfologi och skyddade tubulär sekretion [48]. Ökad fysisk aktivitet har visat sig minska TGFB-signaliseringen i njurarna och fysisk träning kan vara en bra antifibrotisk strategi [32]. Sammantaget kan TGF-aktivering ha en direkt koppling till fysisk aktivitetsrelaterad signalering som kan upprätthålla AD-clearance i periferin. Därför undersökte vi TGFB-signalväg i WT-, AD- och långtidstränade AD-möss.

I den aktuella studien visades det att TGFFRII-uttryck ökade i njurar hos AD-möss och delvis normaliserades i TAD-prover. Den förhöjda TGFBRII indikerar en förbättrad aktivering av TGFB-signalvägen i AD [49]. Det minskade TGF RI-uttrycket visade att TGFbinder med högre affinitet till TGFBRII och homodimerbildning är sannolikt i AD [50]. I likhet med dessa resultat har TGFFRII-homodimerbildning visats i makrofager injur-fibros [51]. Å andra sidan utjämnade långtidsträning uttrycket av TGFB-receptorer, vilket tyder på en heterodimerreceptorkomplexbildning som kan stabiliseras av det förhöjda TGFB1-uttrycket [50]. Dessutom ändrades uttrycket Smad2 och Smad3 kontroversiellt i AD. Smad2 är känt för att aktiveras klassiskt av TGF-receptorer och translokeras in i kärnan medan Smad3 har en distinkt funktion [52]. Det har publicerats att Smad3-nedreglering påverkar fibros [53]. Det normaliserade uttrycket av Smad-transkriptionsfaktorer i TAD-prover indikerar

att fysisk aktivitet återbalanserade TGFB-signalering och minskade dess patobiokemiska aktivering. Den mitogenaktiverade proteinkinasfamiljen (MAPK) som innehåller p38MAPK, JNK och ERK har en interaktion med TGF-signalisering [54]. Förhöjt uttryck av p38 har visats i tubulära epitelceller som inducerar njurfibros och dess blockering kan vara ett bra mål för fibrosbehandling [55]. I AD-möss detekterades ökat p38-proteinuttryck, vilket ytterligare stöder fifibrosbildning. Tvärtom reducerades p38-fosforylering i AD-njurar, vilket indikerar en fibrosstadieberoende aktivering av p38 MAPK [56]. Å andra sidan normaliserade förhöjd fysisk aktivitet delvis både den p38 och den fosforylerade formen i njuren, vilket tyder på en balanserande funktion av träning i p38-medierad fibrosbildning. I likhet med p38-kinas kan hämning av JNK undertrycka fibrosbildning [57]. JNK-aktivering har olika funktioner i olika delar av njuren, såsom glomerulär filtration och interstitiell fibrotisk process [58]. Proteinextraktet i våra experiment som härrör från totalt njurlysat indikerar att JNK under AD-utveckling sannolikt har en distinkt funktion i de tubulära och glomerulära delarna med cellspecifik isotypaktivering i AD-påverkade njurar. TGFB1-inducerad MMP-aktivering rapporterades beroende på p38-funktion [59], medan hämningen av ERK-aktivitet minskade interstitiell fibros [60]. Dessa data stöder starkt distinkta funktioner hos MAPK-familjens medlemmar i patogenesen av njurfibros i AD. Vi upptäckte ett lågt ERK-uttryck i njurar hos AD-möss, medan mängden av dess fosforylerade, aktiva form ökade signifikant. I den experimentella gruppen av möss som deltog i långvarig fysisk träning upptäckte vi normaliserat ERK- och fosfo-ERK-uttryck och en gynnsam effekt pånjurfunktion.Dessa observationer stödjer bidraget av ERK i den fibrotiska transformationen av njurar i AD och visar en överraskande uppenbar positiv påverkan av fysisk träning på njurmorfologi och funktion hos AD-möss. Nyligen har vårt laboratorium bevisat involveringen av ERK i mekanotransduktionen av broskceller under utveckling [61].

TGFBRII-, Smad-, JNK-, p38- och ERK-fosforylering förekommer på Ser-rester [62] som föreslår en möjlig aktivering av Ser/Thr-fosfataser. PP2B dysreglering har visats i AD [35, 63]. Å andra sidan reglerar PP2B inte signifikant fosforylering av tau i hjärnan, även om det kan defosforylera det vid flera fosforyleringsställen [35]. Det andra större cellulära Ser/Thr-fosfataset, PP2A defosforylerar också proteiner på Ser-rester och dess aktivitet reduceras i AD och det kan reglera tau-fosforylering med högre affinitet än PP2B [64]. Ett minskat PP2A, men ett ökat PP2B-uttryck i njurar hos AD-möss visades, på samma sätt som i CNS. Ökad fosforylering på Ser-rester, som ett resultat av minskning av PP2A-uttryck, kan inducera hyperfosforylering av tau-protein eller APP som det förutspåddes i njurar hos AD-möss. Defosforylering av JNK och p38 kan regleras direkt av PP2B [65], därför kan den minskade aktiveringen av dessa kinaser i AD vara konsekvensen av förhöjt PP2B-uttryck. Å andra sidan kan ERK-kinasdefosforylering ske dominant genom PP2A-aktivering [66], därefter kan minskat uttryck av PP2A leda till en ökad ERK-fosforylering i AD. Långtidsträning av AD-möss verkade mot normalisering av PP2B- och PP2A-uttryck, vilket i sin tur verkade flytta Ser/Thr-fosforyleringsnivån för MAPK-enzymer närmare det normala. Den mekaniska belastningen utövade en balanserande effekt på reversibel fosforylering genom involvering av PP2B och PP2A i differentierande kondrocyter också [61].

Aktivering av den icke-kanoniska TGFB-signalvägen reglerar cellproliferation och apoptos. I likhet med våra resultat har p21-positiva celler visats i njurens tubulära system [67], och vi visade också deras ökade uttryck i AD. Denna höjning antyder ett cellcykelstopp i AD medierat av MAPK-aktivering, medan p21 interagerar med PCNA och blockerar celler i cellcykelns S-fas [68]. Vi upptäckte p21-aktivering och en troligt följd stark PCNA-reduktion i det tubulära systemet hos AD-möss. I likhet med våra tidigare fynd normaliserade ökad fysisk aktivitet cellcykeln i cellerna i det tubulära systemet. Å andra sidan har p21 också ett samband med kaspasaktivering och JNK, medan ERK även inducerar kaspas3-klyvning [69, 70]. Caspase3-aktivering har identifierats spela en viktig roll i AD-patogenes via A-ackumulering och kaspasmedierade ABPP-klyvningsinducerade synoptiska störningar [71]. I njurar av AD-möss upptäckte vi höga klyvda kaspas 3-uttryck som indikerar förhöjd apoptos och förlust av funktion hos tubulära och glomerulära celler. Dessa processer kan främja ackumuleringen av AD i njurens interstitium som vi har visat tidigare [30].

CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURINFEKTION

TGFB-medierad signalisering har visat sig öka kollagenuttryck och ackumulering i interstitium [40]. Enligt dessa resultat i njurar av AD-möss visade vi ett signifikant förhöjt kollagen typ I-uttryck ackumulerat i interstitium. Dessa data tyder starkt på att förändrad kanonisk och icke-kanonisk TGFB-signalisering i AD spelar en avgörande roll vid njurfifibros [18, 72]. Tvärtom minskade långvarig träning lokaliseringen av interstitiell kollagen typ I åtminstone delvis genom att återbalansera TGFB-signaliseringen. Minskad fifibros kan inducera AD-clearance och minska dessnjur-ackumulering som vi har visat tidigare [30]. Denna hypotes stöddes av våra fynd, eftersom fysisk träning resulterade i ackumulering av kollagen typ I i ​​tubulära epitelceller, vilket påvisades i njurar hos TAD-möss vilket antydde kollagennedbrytningsprocessen. MMP9 kan aktiveras av TGFB-signalering i njuren [73] och resulterar i nedbrytning av matrixfibriller. Även om MMP har både hämmande och stimulerande roller vid fibros, anses MMP9 som ett profibrotiskt medel som medieras av TGFB-aktivering [74]. Tvärtom har det visat sig att MMP9 kan spela en reglerande roll vid kollagen typ I-nedbrytning i njuren [75]. I njurar hos AD-möss visade vi ett förhöjt MMP9-uttryck som tyder på dess funktion i fibrotisk process kontrollerad av TGFB-signalkaskad. Å andra sidan mättes ytterligare höjning efter långvarig träning, vilket kan vara orsaken till den kraftiga minskningen av uttryck och tubulärt utseende av kollagen typ I. Vid mekanisk stimulans har vårt laboratorium visat att MMP9-uttrycket var förhöjt i primära kondrogena kulturer [76], och liknande resultat har publicerats i ärrvävnadsbildning där mekanisk kompression ökade uttrycket av MMP9 [77]. Vid akut njurskada har förhöjning av MMP9 anti-apoptotisk funktion och skyddar S3-delen av proximala tubuli [78]. Dessutom har skjuvspänningsaktiverad TGFB-signalväg och minskad fifibrosbildning också upptäckts i lungorna [79]. Dessutom inducerade mekanisk stress i lungepitelceller ombyggnaden av ECM via aktivering av MMP9 och förändra kollagenuttryck [80]. Därför kan vi dra slutsatsen att ökad fysisk aktivitet inducerar ombyggnad av matrisproduktion via modulerande TGFB-signalisering inte bara lokalt utan också systemiskt. Begränsningarna i vårt arbete är att transgena möss kan ha en snabbare AD-bildning och njurfunktionen undersöks inte i detalj. Det måste undersökas ytterligare att endast den TGFB-inducerade matrisproduktionen förändras i fibrotiska njurar hos AD-möss eller regleringen av natrium- och kaliumbalansen och AD-clearance är också involverad i långvarig träning. Dessutom kan ansamling av kollagen typ I i ​​urinen också följas ytterligare för att förbättra att långvarig fysisk träning vid AD leder till minskning av njurfibros. Å andra sidan bevisade vi in ​​vivo att långvarig fysisk träning har en systemisk effekt på kanonisk och icke-kanonisk TGFB-signalering. In vivo visade vi att fysisk träning minskade bildandet av njurfifibros vid AD, vilket har en positiv effekt på manifestationen av sjukdomen. Sammanfattningsvis tyder våra data på att aktiveringen av TGFB-signalvägar spelar en orsakande roll i den fibrotiska transformationen av njurar hos AD-möss. Som ett mycket enkelt tillvägagångssätt för att uppnå positiva förändringar i detta tillstånd rekommenderar vi långvarig fysisk träning, eftersom det kunde normalisera uttrycket och fosforyleringen av medlemmar av kanoniska och icke-kanoniska TGFB-signalvägar och resulterade i förbättring av njurfifibros. Dessutom kan fysisk träning som hämmar fifibrosen återbalansera njurfunktionen och kan inducera en förhöjd clearance av systemisk AD i AD.