Fytokemisk analys, in vitro antiproliferativ, antioxidant del 1

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

Bakgrund:Rumex rothschildianus är den enda medlemmen av en unik sektion av släktet Rumex, i familjen Polygonaceae. Denna art är en mycket sällsynt liten tvåbo ettårig, endemisk till Palestina som traditionellt används som föda och för behandling av olika sjukdomar. Därför syftade den aktuella undersökningen till att screena de kemiska beståndsdelarna, antioxidanter, anti-a-amylas, anti-a-glukosidas, förutse och cytotoxiska effekter av fyra lösningsmedelsfraktioner av R. rothschildianus-löven.

Metoder:Torkat pulver av R. rothschildianus-blad extraherades i fyra lösningsmedel med olika polaritet. Flera kvalitativa och kvantitativa fytokemiska tester utfördes för att bestämma komponenterna i extrakten. Den kolorimetriska analysen användes för kvantitativ bestämning av fenoler, flavonoider och tanniner. In vitro-analyser utfördes för att utvärdera extrakten för antioxidant, anti-a-amylas, anti-a-glukosidas och förutse hämmande aktiviteter, såväl som cytotoxicitet genom MTS-analys mot cervikal carcinomcelllinje (HeLa) och bröstcancercellinje (MCF7).

immunity2

Klicka här för att veta mer

Resultat:Acetonfraktionen av R. rothschildianus-bladen visade den mest signifikantaantioxidantaktivitet, på grund av att ha det högsta innehållet av flavonoider och fenoler, med ett ICso-värde på 6,3±0,4 ug/ml, jämfört med 3,1±0,9 ug/ml för Trolox, och ang. lipasinhiberingsaktivitet acetonfraktionen visade den mest potenta aktiviteten med ett ICso-värde på 26,3±{{10}},6 ug/ml, i jämförelse med orlistat positiv kontroll ICso 12,3 ug/ml. Samma extrakt var den mest potenta hämmaren av a-amylas och a-glukosidas, med ICso-värden på 19,1±0,7 ug/ml respektive 54,9±0,3 ug/ml, jämfört med till 28,8, 37,1±0,3 ug/och akarbos, respektive. Hexanfraktionen visade 99,9 procent hämning av HeLa-celler och 97,4 procent hämning för MCF7-celler.

Slutsats:Acetonfraktionen av R. rothschildianus-löven kan utgöra en källa till bioaktiva föreningar för behandling av oxidativ stress. På liknande sätt indikerar hexanfraktionen den lovande antitumörpotentialen hos R. rothschildianus. Uppenbarligen behöver dessa initiala indikationer ytterligare rening av potentiellt aktiva föreningar, och slutligen, in vivo-studier för att bestämma deras effektivitet.

Nyckelord:Rumex rothschildianus, Antioxidant, Lipas, Amylas, Trolox, Fytokemi, Anti-proliferativ aktivitet

Bakgrund

Växter har använts som terapier sedan urminnes tider. Rötter, frön, bark, löv och blommor har alla använts för avhjälpande syften. I dag finns syntetiska läkemedel tillgängliga och är effektiva vid behandling av ett brett spektrum av sjukdomar; Men vissa människor föredrar fortfarande växtbaserade läkemedel eftersom de anses vara mindre skadliga för människokroppen [1,2]. Medicinalväxter är per definition källan till fytokemiska föreningar som har terapeutiska aktiviteter. Dessa egenskaper är beroende av närvaron av olika sekundära metaboliter, såsom fenoler, terpenoider och alkaloider [3]. Rumex rothschildianus Aarons. är den enda medlemmen av en unik sektion av släktet Rumex, i familjen Polygonaceae. Denna art är en mycket sällsynt liten tvåboårig, endemisk i Palestina. Den har en medelhöjd på 45 cm och kännetecknas av upprättstående stjälkar som håller radikala bladskaftsblad, som är kort-hastata vid basen och korta spetsiga i spetsen. Blommor har en diameter på 3-4 mm, medan pistillatblommor är cirka 2 mm i diameter med ett koriaceous membranaktigt lager [4]. Rumex spp. är utbredda i olika regioner i Turkiet och representeras av 22 arter. Några av de vanligaste arterna är R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus och R. caucasicus är fleråriga växter fördelade i mellersta och östra Anatolien på en höjd av {{10 }} m över havet. Rumex-släktet har använts i stor utsträckning inom traditionell medicin i Turkiet för att behandla sjukdomar, såsom förstoppning, diarré och eksem [5, 6]. Släktet har också vissa laxerande, diuretiska, febernedsättande, sårläkande och antiinflammatoriska effekter. Många människor i den östra delen av Turkiet använder de unga bladen av Rumex spp. som konserveringsmedel i ost, samt ger matarom [7].

immunity4

En mängd forskning har utförts på Rumex-arter, till exempel att antimikrobiella aktiviteter har rapporterats för vissa arter. Vissa bioaktiva fytokemikalier har tidigare hittats i Rumex vicarious L, såsom karotenoider, tokoferoler, polyfenoler, flavonoider och askorbinsyra, som har en roll som antioxidanter och naturliga avgiftningsmedel. Kostintaget av antioxidantfytokemikalier, som karotenoider,fenoler, ochflavonoiderkan skydda mot icke-smittsamma sjukdomar hos människor, såsom cancer, hjärt-kärlsjukdomar och andra hälsoproblem relaterade till oxidativ stress [5, 8]. Skadliga fria radikaler är kända för att spela en viktig roll i många stora hälsoproblem, såsom cancer, hjärt-kärlsjukdomar, reumatoid artrit, grå starr,Alzheimers sjukdom, och andra degenerativa sjukdomar relaterade till åldrande. Antioxidanter är fördelaktiga komponenter som neutraliserar dessa fria radikaler innan de kan attackera celler, och därför förhindrar de skador på cellproteiner, lipider ochkolhydrater. En mängd både naturliga och syntetiska antioxidanter har föreslagits för behandling av mänskliga sjukdomar. Ett sådant intresse för antioxidanters roll för människors hälsa har föranlett forskning inom matvetenskap och medicinska örter, som utvärderar örternas funktion som antioxidanter. Antioxidantverkan inkluderar fria radikalfångande kapacitet, hämning av lipidperoxidation, metalljonskelaterande förmåga och även reducerande kapacitet [9,10].

Cancer är ett av de mest globala hälsoproblemen. Utvecklingen och upptäckten av ny medicin mot cancer är fortfarande extremt viktig på grund av olika faktorer. Dessa faktorer inkluderar behandlingar som kan orsaka stora biverkningar eller kan vara ganska dyra. Alternativ som är säkrare biologiskt och billigare är fortfarande mycket önskvärda [11-14].

immunity3

Flera växtarter anses vara potentiella källor till bioaktiva molekyler såsom atropin från Belladonna-blad, kokain från kokablad, vinkristin från Vinca-växt och många andra som fortfarande spelar en viktig roll i modern medicin [15,16].

Användbara terapeutiska effekter kan komma från blandning av sekundära produkter som finns i medicinalväxter. Dessa föreningar är mestadels sekundära metaboliter, som alkaloider, steroider, tanniner, flavonoider och fenoler, som syntetiseras och deponeras i specifika delar av dessa växter [17,18]. Den aktuella studien undersöker in vitro anti-a-amylas, anti- -glukosidas, anti-lipas, anti-proliferativ och antioxidant aktiviteter av olika fraktioner som extraherats från R. rothschildianus-löven.

Metoder

Växtmaterial, kemikalier och instrument

R. rothschildianus-löven skördades från västra regioner i Palestina, mellan februari och mars 2018. De identifierades av Dr. Nidal Jaradat, från Pharmacognosy Laboratory vid An-Najah National University, under kupongprovskoden Pharm-PCT{{3} }. Alla kemikalier köptes från Sigma-Aldrich. En spektrofotometer-UV/Visible (Jenway grad 7135, Stafford-shire, Storbritannien), filterpapper (Whitman No. 1, Washington, USA), skakapparat (Memmert 531-25-1, Stockholm, Sverige), rotavap-apparat (Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, Tyskland), kvarn (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Kina), elektronisk balans (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polen), frystork-BT85 (Millrock Technology, Kina) och kryo-exsickator (Mill-rock-teknologi, BT85, Kingston, USA) användes.

Beredning av extrakt och fraktionering

Torkat pulver av R. rothschildianus-blad extraherades genom att tillsätta lösningsmedel sekventiellt baserat på deras polaritet, med början med det opolära lösningsmedlet hexan, och sedan aceton (ett polärt aprotiskt organiskt lösningsmedel), metanol (polär alkohol) och slutligen destillerat vatten (a polärt protiskt lösningsmedel). För varje extraktion placerades cirka 25 g malda torkade löv i 0.51 hexan i 72 timmar i en skakanordning med 100 varv per minut vid 25 grader. Först ersattes hexanen med 0,5 L aceton, och därefter involverade utbyte ekvivalenta volymer metanol och vatten. Inkubationer i lösningsmedlen var såsom beskrivits ovan för hexan. Varje organisk fraktion filtrerades och koncentrerades under vakuum på en rotationsindunstare, medan den vattenhaltiga fraktionen torkades med användning av en frystork. Slutligen lagrades alla råfraktioner vid 4 grader [19,20].

Utbytet av varje fraktion beräknades med hjälp av följande formel:

Preliminär fytokemisk bedömning

Fytokemiska screeningtester av R. rothschildianus löv i fyra fraktioner utfördes för att identifiera aktiva sekundära metaboliter. De kvalitativa resultaten uttrycktes som (plus) för närvaron och (-) för frånvaron av bioaktiva fytokemikalier[10,21].

Bestämning av total fenolhalt (TPC)

Förfarandet för att bestämma TPC baserades på det enligt Cheung et al. TPC uttrycktes i milligram gallussyraekvivalenter per gram torrvikt av blad (mg GA/g torrvikt). Nyberedd 7,5 procent natriumkarbonatlösning gjordes genom att placera 7,5 g Na2CO3 i en mätkolv och justera volymen till 100 ml med destillerat vatten. En standardreferenslösning (gallsyralösning) framställdes genom att lösa 100 mg gallussyra i destillerat vatten till en slutlig volym av 100 ml. Från detta utfördes en serieutspädning för att erhålla lösningar av gallussyra vid 100, 70, 50, 40 och 10 ug/ml）. Stamlösningarna av fraktionerna från löv framställdes genom att lösa 100 mg växtextrakt i destillerat vatten och justerades till en total volym av 100 ml. Reaktionsblandningar framställdes genom att blanda 0,5 ml av varje fraktionslösning med 2,5 ml av 10 procent Folin-Ciocalteus reagens, som löstes i vatten med 2,5 ml 7,5 procent natriumbikarbonat. Provrören inkuberades i 45 minuter vid 45 grader. Sedan mättes absorbansen för var och en i en spektrofotometer vid en våglängd av 765 nm. Arbetsproverna preparerades i tre exemplar för varje analytiskt försök, från vilket medelvärdena och standardavvikelsen beräknades [21].

Bestämning av total flavonoidhalt (TFC)

TFC i de fyra R. rothschildianus-bladfraktionerna bedömdes med användning av en kalibreringskurva av rutin (standardreferensförening). Resultaten uttrycktes som milligram rutinekvivalent per gram torrvikt av bladextrakt (mg RU/g torrvikt). En kalibreringskurva för rutin upprättades med hjälp av serieutspädningar genererade från en stamlösning på 1{{10}}0 ug/ml. För att göra stamlösningen löstes 10 mg rutin i 10 ml destillerat vatten och späddes sedan till 100 ml. Därefter späddes stamlösningen för att tillhandahålla rutin vid koncentrationer av 10, 30, 40, 50, 70 och 100 ug/ml. För beredning av arbetslösning blandades 0,5 ml av varje fraktionslösning med 3 ml metanol, 0,2 ml 10 procent AlCl3, 0,2 ml IM kaliumacetat och 5 ml destillerat vatten och inkuberades sedan vid rumstemperatur under 30 minuter. De föregående stegen upprepades för var och en av fraktionerna, varefter absorbansen mättes vid en våglängd av 415 nm. För en blankkontroll sattes en arbetslösning med destillerat vatten i stället för provextraktet. Proverna preparerades i tre exemplar för varje analytiskt försök, från vilket medelvärdena och standardavvikelsen beräknades [22].

Improve immunity

Bestämning av total tanninhalt (TTC) Protokollet av Sun et al. användes för att bestämma TTC i de fyra R. rothschildianus-bladfraktionerna, vilket är det vanligast använda förfarandet. Katekin användes som referensförening för att konstruera en kalibreringskurva. En 100 ug/ml stamlösning i metanol framställdes, från vilken en spädningsserie genererades för att ge katekinkoncentrationer på 10, 30, 50, 70 och 100 ug/ml. En 4-procentig lösning av vanillin i metanol framställdes färskt. Stamlösningar av fraktionerna vid 100 ug/ml framställdes med användning av metanol som lösningsmedel. För arbetslösningen blandades 0,5 ml av varje fraktionslösning med 3 ml vanillinlösning och 1,5 ml koncentrerad HCl. Blandningen fick stå i 15 minuter och sedan mättes absorbansen vid 500 nm med användning av en arbetslösning som satts upp med metanol i stället för provextraktet som ett blankprov. Alla arbetsprover analyserades i tre exemplar, från vilka medel- och standardavvikelsevärdena beräknades. Totalt tannin i varje fraktion uttrycktes i termer av katekinekvivalenter (mg CAE/g torrvikt av blad)[23].

Antioxidantaktivitetsmetod

Den fria 2,2-difenyl-picrylhydrazyl (DPPH)-radikalavskiljningsanalysen användes för att mäta antioxidantaktivitet i de olika fraktionerna av R. rothschildianus-löven. En 1000 ug/ml stamlösning av varje växtfraktion framställdes i metanol. Dessutom framställdes också en 1000 ug/ml lösning av Trolox (referensstandarden). En utspädningsserie framställdes från stamlösningarna för varje fraktion, vilket gav sex serieutspädningar vid 2, 5, 10, 20, 50 och 100 ug/ml. En ml av varje extraktspädning blandades med 1 ml 0,002 g/ml DPPH i metanol. En ml metanol tillsattes för att ge en slutlig arbetsvolym av 3 ml. DPPH-lösningen var nyberedd, eftersom den var mycket känslig för ljus. Blindkontrollen av seriekoncentrationerna var DPPH i metanol i ett förhållande av 1:2, utan tillsats av ett extrakt. Alla arbetslösningar inkuberades vid rumstemperatur (25 grader) i mörker under ca 30 min. Optiska densiteter mättes sedan med en spektrofotometer vid en våglängd av 517 nm. Följande ekvation användes för att beräkna procentuell DPPH-inhibering för varje växtfraktion, med Trolox som standardförening:

där Ag är den registrerade absorbansen för blindlösningen och Ats är den registrerade absorbansen för den testade provlösningen [21].

Assay för hämning av lipas i bukspottkörteln hos svin

Stamlösningar på 500 ug/ml gjordes från varje växtfraktion i 10 procent DMSO. Från dessa gjordes en utspädningsserie med fem koncentrationer på 50,100,200, 300 och 400 ug/ml. En 1 mg/ml stamlösning av svinpankreatisk lipas i Tris-HCl-buffert bereddes färskt precis före användning. Substratet, p-nitrofenylbutyrat (PNPB) framställdes genom att lösa 20,9 mg i 2 ml acetonitril. För varje arbetslösning blandades 0,1 ml bukspottkörtellipas från svin med 0,2 ml växtfraktion från varje medlem av utspädningsserien. Tris-HCl tillsattes för att göra slutvolymen av arbetslösningarna 1 ml, och de inkuberades vid 37 grader C under 15 minuter. Efter inkubation sattes 0,1 ml p-nitrofenylbutyratlösning till varje provrör. Blandningen inkuberades sedan i ytterligare 30 minuter vid 37 grader. Pankreatisk lipasaktivitet bestämdes genom att mäta hydrolysen av PNPB till p-nitrofenolat vid 410 nm, med användning av en UV-spektrofotometer. Samma procedur upprepades med användning av orlistat som en standardreferensförening. Den procentuella lipasinhiberingen av växtfraktioner beräknades med följande ekvation:

där Ap är den registrerade absorbansen för blindlösningen och Ats är den registrerade absorbansen för den testade provlösningen [24]. a-amylasinhiberande analys

A100 mg av varje fraktion löstes i några millimeter 10 procent DMSO och löstes sedan ytterligare upp till 100 ml i 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4,0,006M NaCl, pH 6,9 för att slutligen ge stamlösningar med koncentrationer av 1000 ug/ml. Från dessa framställdes följande spädningar av 10, 50, 70, 100 och 500 ug/ml, med användning av 10 % DMSO som utspädningsmedel. En 0,2 ml volym av 2 enheter/ml gris pankreas-amylas blandades med 0,2 ml

växtfraktion och inkuberades under 10min vid 30 grader. Efter inkubation tillsattes 0,2 ml av en nyberedd 1-procentig stärkelselösning i vatten, och rören inkuberades sedan i minst tre minuter till. Vid denna tidpunkt stoppades reaktionen genom tillsats av 0,2 ml 3,5-dinitro salicylsyra (DNSA) färgreagens och späddes med 5 ml destillerat vatten innan den värmdes till 90 grader i 10 minuter i vatten bad. Blandningen kyldes sedan till rumstemperatur och absorbansen mättes vid 540 nm. Blindkontrollen framställdes med användning av samma kvantiteter som beskrivits ovan, men växtfraktionen ersattes med 0,2 ml buffert. Akarbos användes som standardreferens enligt proceduren som beskrivits ovan. a-amylas-hämmande aktivitet beräknades med användning av följande ekvation: