Porcint placentaextrakt ökar de cellulära NAD-nivåerna i mänskliga epidermala keratinocyter

Bästa örter för anti-aging-växtbaserade Cistanche

Nikotinamidadenindinukleotid(NAD) är en klassisk kofaktor för många redoxreaktioner och finns i alla levande celler i de oxiderade (NAD plus ) och reducerade (NADH) formerna. NAD plus är också känt som ett väsentligt samsubstrat för NAD plus-konsumerande enzymer som sirtuin (SIRT) och poly ADP-ribospolymeras (PARP). Eftersom dessa enzymer spelar en central roll i olika biologiska processer, inklusive DNA-reparation, mitokondriell metabolism och stressresistens, påverkar obalanserad NAD-homeostas deras centrala processer1. NAD-nivåer i vävnader/organ minskar med åldern, vilket resulterar i obalanserad NAD-homeostas2–6. Därför finns det nu enighet om att bibehållande av NAD-nivåer leder till förebyggande och behandling av åldrande och åldersrelaterade sjukdomar7. NAD biosyntetiseras via en mängd olika vägar, inklusive de novo biosyntes från tryptofan, Preiss-Handler-vägen från nikotinsyra och räddningsvägen från nikotinamid (NAM)8. Hos däggdjur är räddningsvägen den viktigaste vägen för att upprätthålla cellulära NAD-nivåer9. På denna väg omvandlas NAM till nikotinamidmononukleotid (NMN) av NAM-fosforibosyltransferas (NAMPT) och omvandlas sedan till NAD av NMN-adenylyltransferaser. Nikotinamidribosid (NR) omvandlas till NMN av NR-kinaser och integreras sedan i räddningsvägen. NAD-intermediära metaboliter, såsom NMN och NR, har visat sig höja NAD-nivåerna i olika celler och vävnader och förbättra åldersrelaterade sjukdomar10,11.

Placentalextrakt (PE) har använts i stor utsträckning inom traditionell medicin för sårläkning. PE är en rik källa till många bioaktiva komponenter, inklusive aminosyror, nukleinsyror, fettsyror, mineraler, vitaminer, hormoner, bioaktiva peptider, cytokiner och tillväxtfaktorer. Det är känt att ha olika farmakologiska aktiviteter, såsom antiinflammatoriska, antioxiderande, regenerativa och immunmodulerande effekter12. Subkutana och intramuskulära injektioner av human PE (HPE) har således använts kliniskt för behandling av flera sjukdomar, inklusive klimakteriebesvär och kronisk leversjukdom13. Dessutom används HPE kliniskt som ett anti-rynkmedel främst i asiatiska länder på grund av dess effekter på celltillväxt och kollagensyntes14. Eftersom användningen av HPE är begränsad till medicinska tillämpningar i vissa länder som Japan, utvecklades porcin PE (PPE) nyligen som ett alternativ till HPE och användes som en råingrediens i hälsokost och kosmetika. En in vivo-studie med en muskontaktdermatitmodell visade att aktuell PPE har antiinflammatoriska och antioxidativa effekter på huden15. Kliniska studier har rapporterat att topikal PPE är fördelaktigt för behandling av kroniska icke-läkande sår och för att förhindra rynkor16,17. Dessutom genomfördes en randomiserad, dubbelblind, placebokontrollerad klinisk prövning på friska vuxna kvinnor för att validera hudfördelarna med oralt intag av PPE och visade att hudtillståndet för gruppen som fick PPE förbättrades signifikant18. Dessa rapporter stödjer konceptet att PPE-behandling kan lindra eller förhindra hudens åldrande.

PE har konventionellt använts som enanti-aging medel, och talrika kliniska studier har etablerat dessanti-aging egenskaper. Den mekanism som ligger bakom anti-aging effekterna av PE är dock fortfarande oklar. Denna rapport visade att PPE innehåller flera NAD-prekursorer, såsom NMN och NR, och ökar intracellulära NAD-nivåer i normala humana epidermala keratinocyter (NHEK). Våra fynd ger nya insikter i mekanismen genom vilken PE utövar sina anti-aging-effekter genom att upprätthålla intracellulär NAD-homeostas.

Resultat

PPE ökar intracellulära NAD-nivåer. För att undersöka om PPE förändrar cellulära NAD-tillstånd, odlade vi NHEKs i ett medium kompletterat med PPE och kvantifierade deras intracellulära NAD plus- och NADH-nivåer. Resultaten visade att PPE signifikant ökade mängden av både NAD plus och NADH i NHEKs på ett dosberoende sätt (Fig. 1A). Den totala NAD-nivån (NAD plus plus NADH) för cellerna behandlade med 1 mg/ml PPE var ungefär 1,5 gånger högre än den för obehandlade celler (Fig. 1A). Dessutom, i ett tidsförloppsexperiment, observerades signifikant höjning av NAD plus, NADH och totala NAD-nivåer efter 4 timmars behandling med 1 mg/ml PPE (Fig. 1B). Te {{10}}(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analys bekräftade att {{20} },5–2 mg/mL PPE hade ingen effekt på cellernas metaboliska aktivitet, medan 5 mg/mL PPE eller den positiva kontrollen (0,2 procent Triton X-100 [TX-100]) uppvisade signifikant celltoxicitet (Fig. IC). Eftersom NAD knappast detekterades i PPE själv (data visas inte), verkade den NAD-producerande effekten av PPE inte bero på inflödet av PPE-härledd NAD till NHEK. Således tyder dessa resultat på att PPE kan öka intracellulära NAD-nivåer. Aktiva ingredienser i PPE är små molekyler, inte proteiner. För att avgöra om PPE ökar cellulär NAD-biosyntes via NAMPT-reaktionen i NAD-räddningsvägen, utförde vi en NAD-återvinningsanalys med hjälp av NAMPT-hämmaren FK866 (Fig. 2A). FK866 minskade de totala NAD-nivåerna avsevärt 24 timmar efter tillsats (Fig. 2B).

Intressant nog, trots frånvaron av NAMPT-aktivitet inom NHEK, inducerade PPE-undertryckt FK{{0}} utarmning av NAD på ett dosberoende sätt (Fig. 2B). Många rapporter har visat att PE innehåller proteiner som cytokiner och tillväxtfaktorer13,19,20. Därför antog vi att vissa bioaktiva proteiner eller svin NAMPT som finns i PPE kan förbättra intracellulär NAD-biosyntes i NHEK. För att bekräfta vår hypotes separerade vi PPE i fraktioner med hög och låg molekylvikt (HMW, LMW) med hjälp av en centrifugalfilteranordning (cutoff: 3 kDa). Eftersom NAD-återvinningsanalysen med FK866 visade effekten av PPE på NAD-biosyntes tydligare än i frånvaro av FK866 (fig. 1A och 2B), fortsatte vi att identifiera de aktiva ingredienserna i PPE använder denna analys. Oväntat krävde HMW-PPE en hög koncentration på 1 mg/ml för signifikant återställande av NAD-nivåer, medan LMW-PPE tydligt förbättrade den FK866-inducerade NAD-utarmningen även vid en låg koncentration på 0,25 mg/ml (Fig. 2C och D). Således tyder dessa resultat på att de primära aktiva ingredienserna i PPE är små molekyler på mindre än 3 kDa, snarare än proteiner såsom tillväxtfaktorer och cytokiner.

PPE innehåller NAD-prekursorer, såsom NMN och NR. Vi fraktionerade ytterligare LMW-PPE i 12 fraktioner med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och undersökte vilken fraktion som bidrog till återställandet av FK866-inducerad NAD-utarmning. Ett typiskt HPLC-kromatogram av LMW-PPE visas i fig. 3A. NAD-återvinningsanalysen visade att endast fraktion 3 tydligt ökade NAD-nivåer i FK866-behandlade NHEKs (Fig. 3B). NAD-prekursorer, såsom NMN och NR, höjer intracellulära NAD-nivåer utan NAMPT-intervention i olika cellinjer inklusive NHEKs10,21. Eftersom LMW-PPE fortfarande ökade NAD-innehållet i NHEK, även när NAMPT hämmades av FK866, antog vi att NAD-prekursorer som finns i PPE förbättrar intracellulär NAD-produktion. För att testa denna hypotes analyserade vi fraktion 3 med vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för att detektera NAD-prekursorerna. Resultaten visade att tre jontoppar i överensstämmelse med NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) och NAM (m/z 123→80) detekterades i fraktion 3 ( Fig. 3C). Kvantifieringsanalyserna visade att koncentrationen av NMN, NR och NAM i hela PPE var 0,22, 17,62 respektive 0,14 ng/mg (tabell 1). Dessa resultat tyder på att minst tre NAD-prekursorer, NMN, NR och NAM, finns i PPE och deltar i intracellulär NAD-förstärkning.

Figur 2. PPE förbättrar utarmningen av NAD av FK866 i NHEK. (A) Räddningsvägen för NAD-biosyntes. Te NHEKs förbehandlades med FK866 i 30 minuter och inkuberades med hel-PPE (B), HMW-PPE (C) eller LMW-PPE (D) vid de angivna koncentrationerna i 24 timmar. De totala NAD-nivåerna bestämdes med användning av NAD plus/NADH-analyskitet. †s<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Topisk administrering av PPE på rekonstruerad human epidermis ökar NAD-nivåerna i vävnader. De primära aktiva ingredienserna i den NAD-förstärkande effekten av PPE är små molekyler, som kan förväntas ha högre transdermal absorberbarhet än större proteiner såsom tillväxtfaktorer. Därför verkar topisk applicering av PPE på huden vara ett lämpligt alternativ för att öka NAD-nivåerna i hudvävnader. För att undersöka om topisk administrering av PPE påverkar NAD-nivåer i epidermis under stratum corneum, behandlades den 3-dimensionella rekonstruerade mänskliga epidermis (RHE) med PPE på stratum corneum-sidan och odlades i ett medium med närvaro eller frånvaro av FK866 (fig. 4A). Topisk applicering av PPE ökade NAD-nivåerna med 9,1 procent (ej signifikant) respektive 7,3 procent (signifikant) i frånvaro eller närvaro av FK866 (Fig. 4B). PPE hade ingen effekt på cellernas metaboliska aktivitet när den testades upp till 10 mg/ml, medan 1 procent TX-100 minskade markant (Fig. 4C). Dessa resultat tyder på att de aktiva ingredienserna i PPE kan infiltrera subcorneal huden och öka hudens NAD-nivåer utan att orsaka skadliga effekter.

Fråga för mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950