Prediktiv betydelse av njurmyeloidrelaterat protein 8-uttryck hos patienter med fetma eller typ 2-diabetes associerade njursjukdomar

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹, Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵, Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Institutionen för medicin och klinisk vetenskap, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan,

²Medical Innovation Center, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan,

³Institutionen för EBM-forskning, Institutet för avancemang av klinisk och translationell vetenskap, Kyoto University Hospital, Kyoto, Japan,

⁴Nefrologiska avdelningen, Osaka Röda Korsets sjukhus, Osaka, Japan,

5 avdelningen för nefrologi och hypertoni, Osaka City General Hospital, Osaka, Japan,

6 Institutionen för farmakologi, Kagawa University Medical School, Kagawa, Japan

Abstrakt

Bakgrund och mål: Vi har rapporterat att tollliknande receptor 4 (TLR4) och en av dess endogena ligander, myeloidrelaterat protein 8 (MRP8 eller S100A8), spelar en viktig roll i utvecklingen av diabetisk nefropati hos möss. Syftet med denna studie var att utvärdera betydelsen avnjureMRP8 uttryck hos patienter medfetma- eller typ 2 diabetesrelateradnjursjukdomar. Metoder: Hos diabetiker, fetma eller kontrollpersoner bestämdes MRP8-mRNA- och proteinuttrycksnivåer i njurbiopsiprover med realtids-RT-PCR och immunhistokemi (n=28 respektive 65) och deras associationer med baslinjen och prognostiska parametrar analyserades. Effekter av MRP8 på pro-inflammatoriska genuttryck undersöktes med hjälp av makrofager. Resultat:NjureMRP8-gen- och proteinuttrycksnivåer var förhöjda i överviktiga eller diabetikergrupper jämfört med kontrollgruppen. Bland alla försökspersoner, genom univariat linjär regressionsanalys, var glomerulärt MRP8-positivt cellantal och tubulointerstitiellt MRP8-positivt område vid baslinjen båda korrelerade, inte bara med olika kända riskfaktorer för diabetisk nefropati (t.ex. som systoliskt blodtryck, proteinuri och serumkreatinin) men också med omfattningen av glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros. Oberoende faktorer som förutsäger urinproteinnivåer ett år senare undersöktes med multivariat analys, och de inkluderade glomerulär MRP8-positivt cellantal (b=0.59, P,0.001), proteinuri (b=0.37, P=0.002) och systoliskt blodtryck (b=0.21, P=0.04) vid baslinjen, efter justering för känd risk faktorer. MRP8-proteinuttryck observerades i CD68-positiva makrofager och atrofiska tubuli. I odlade musmakrofager utlöste MRP8-proteininducerade proinflammatoriska cytokinuttryck också autoinduktion av MRP8 på ett TLR-4-beroende sätt.

Slutsatser: Glomerulärt MRP8-uttryck verkar vara associerat med progressionen av proteinuri hos patienter med fetma eller typ 2-diabetes, möjligen genom att inducera inflammatoriska förändringar i makrofager genom TLR4-signalering.

Effekter av cistanche: behandling av njursjukdomar

Introduktion

Kronisk inflammation spelar en viktig roll i patogenesen av diabetes ellerfetmaoch dess kardiovaskulära komplikationer [1]. Inblandningen av medfödda immunreceptorer och de endogena liganderna i processen med kronisk inflammation har varit inblandad. Myeloidrelaterat protein 8 (MRP8, även känd som S100A8 eller calgranulin A) identifierades ursprungligen som ett cytoplasmatiskt kalciumbindande protein i neutrofiler och monocyter [2] och har blivit allmänt erkänt som en potent endogen ligand för tollliknande receptor 4 (TLR4) ) vid olika sjukdomar inklusive septisk chock, vaskulära och autoimmuna sjukdomar [3,4,5]. Vi har nyligen föreslagit att MRP8/TLR4-signalering spelar en viktig roll i hyperlipidemi-inducerad progression av diabetisk nefropati [6]. Glomerulära makrofager och uppsamlingskanalceller är viktiga källor till MRP8 i musmodeller av diabetisk nefropati[6] respektive njurfibros [7]. Plasmanivåer av MRP8, som vanligtvis bildar ett heterodimert komplex med en bindningspartner MRP14 i blodomloppet, ökar hos överviktiga personer [8,9]. Det har dock inte förekommit några rapporter som undersöker det renala uttrycket av MRP8 hos patienter med fetma ellertyp2 diabetesoch dess samband med njurprognos.

Syftet med denna studie var att bestämma mRNA och proteinuttrycksnivåer av MRP8 injureav japanska patienter med diabetisk nefropati (DN),fetma-relaterad glomerulopati (ORG), nefrotiskt syndrom med minimal förändring (MCNS) eller mindre glomerulär abnormitet (MGA), som alla diagnostiserades genom njurbiopsi, och för att utvärdera om njur-MRP8-uttryck kan förutsäga njurresultat.

Cistanche kan förbättra njurfunktionen

Material och metoder

Etikförklaring

Den mänskliga studien genomfördes enligt principerna i Helsingforsdeklarationen och godkändes av de etiska kommittéerna för mänsklig forskning vid Kyoto University Graduate School of Medicine respektive Osaka City General Hospital. Alla deltagare gav skriftligt informerat samtycke. Djurstudieprotokollet godkändes av Animal ResearchCommittee vid Kyoto University Graduate School of Medicine (tillståndsnummer: Med Kyo 13318). All djurkirurgi utfördes under natriumpentobarbitalbedövning och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidande.

Studera ämnen

Proteinuriska patienter medfetmaeller typ 2-diabetes som genomgick njurbiopsi inkluderades i denna studie. Patienter med infektionssjukdomar, cancer, leversjukdom eller kollagensjukdom exkluderades. Proteinuri definierades som urinprotein större än 0,5 g/g kreatinin eller urinalbumin större än 300 mg/g kreatinin i minst två på varandra följande mätningar.Fetmadefinierades som ett kroppsmassaindex (BMI) större än 25.0 (kg/m²). Typ 2-diabetes diagnostiserades i enlighet med Världshälsoorganisationens kriterier. Biokemiska mätningar vid intagning för njurbiopsi användes som baslinjekarakteristika för tvärsnittsanalys. Uppskattad glomerulär filtrationshastighet (eGFR) beräknades med hjälp av en förenklad prediktionsekvation som föreslagits av Japanese Society of Nephrology: eGFR (ml/min/1,73 m)²)=1946 [ålder (år)]20.287 6 [serumkreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (för kvinnor), vilket är en validerad lokal modifiering av MDRD [ 10]. Serumkoncentrationerna av kreatinin mättes med användning av en enzymatisk metod.

För immunhistokemi analyserades 65 japanska patienter som genomgick njurbiopsi vid Institutionen för medicin och klinisk vetenskap, Kyoto University Hospital mellan 2000 och 2011. Biopsibeprövade diagnoser av alla patienter under denna period listas i tabell S1 i fil S1. De försökspersoner som undersöktes i detta arbete inkluderade DN (n=19), ORG (n=10) och icke-överviktiga, icke-diabeteskontrollpersoner som diagnostiserades som MGA(n=19) eller MCNS (n=17). Vissa fall i dessa kategorier exkluderades eftersom tillgängliga restprover innehöll mindre än 10 glomeruli. Definitionen av DN bestod av (1) mer än 5 års varaktighet efter uppkomsten av diabetes, (2) förekomst av mikro- eller makroalbuminuri, (3) kompatibla histopatologiska förändringar med DN såsom glomerulär basalmembranförtjockning, mesangial expansion, nodulär skleros (Kimmelstiel-Wilson nodules) och/eller arteriolar hyalinos, och (4) uteslutning av andra orsaker till njursjukdomar [11]. ORG definierades morfologiskt som fokal segmentell glomeruloskleros och/eller glomerulomegali hos patienter med bådafetmaoch proteinuri, vars definitioner beskrevs ovan [12,13].

För mRNA-expressionsanalys uteslöts prover av låg kvalitet, i vilka18S ribosomala RNA (rRNA)-nivåer var lägre än detektionskänslighetsgränsen genom realtids-RT-PCR. De inskrivna försökspersonerna bestod av 22 patienter med typ 2-diabetes som genomgick njurbiopsi på Osaka City General Hospital mellan 2000 och 2010, och 6 icke-diabeteskontrollpersoner som hade biopsibeprövad MGA.

Tabellerna 1 och 2 sammanfattar de kliniska baslinjeegenskaperna för patienterna som undersöktes med immunhistokemisk respektive genuttrycksanalys. För ljusmikroskopi bearbetades vävnadsproverna enligt standardprocedurer. Sektioner färgades med hematoxylin-eosin, periodic acid-Schiff, periodic-syra metenamin silver eller Masson trichrome (Fig. S1). Förhållandet mellan antalet glomeruli med global skleros bland totalt glomeruli och de relativa områdena för tubulointerstitiell fibros utvärderades oberoende av två patologer som inte var medvetna om diagnos och kliniska data.

Effekter av cistanche: behandling av njursjukdomar

Definition av njurresultat

Följande två prognostiska indikatorer undersöktes med linjär regression respektive logistisk regressionsanalys: (1) omfattningen av proteinuri uppmätt ett år efter biopsi och (2) njurhändelse definierad som den årliga ökningen av serumkreatinin med 0,50 procent från baslinjen eller initiering av kronisk dialys.

Immunhistokemi

Immunhistokemi av MRP8 och CD68 utfördes med användning avnjuresektioner (tjocklek 4 mm) fixerade med 4 procent buffrad paraformaldehyd. Efter antigenåtervinning med citratbuffert, inkuberades njursektioner med 10 procent getserum, följt av mus anti-human MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Schweiz)[14] eller mus anti-human CD68 antikroppar (1:50) ; DAKO, Ely, Storbritannien), respektive. Primära antikroppar visualiserades med pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp och 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid (Dako USA, Carpinteria, CA). Kärnor motfärgades med hematoxylin. MRP8-positiva celler räknades i mer än 10 glomeruli, och MRP8-positiv yta i tubulointerstitium mättes kvantitativt för att erhålla ett genomsnitt för varje försöksperson med hjälp av MetaMorph 7.5-programvaran (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA) ). Samlokalisering av CD68- och MRP8-positiva celler utvärderades med seriella sektioner. Det fanns varken MRP8- eller CD68-signal i negativa kontroller färgade utan första antikropp (Fig. S2). Genom preinkubation av anti-MRP8-antikropp med 20 molärt överskott av rekombinant humant MRP8-protein (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) vid 4uC över natten, var färgningen markant reducerad, om inte helt, vilket ytterligare stöder antikroppens specificitet (Fig. S3) .

Cistanche för att behandla njure

Utvärdering av mRNA-uttryck

Frystanjuresektioner separerades i glomeruli och nonglomerulus vävnader genom laser capture mikro-dissektion (LM200; Olympus, Tokyo, Japan) som tidigare beskrivits [15]. Totalt RNA extraherades med RNeasy mini-kit (Qiagen, Tokyo, Japan). mRNA-expressionsnivåer bestämdes med TaqMan realtids-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [16,17]. Uttrycksnivåer för alla gener normaliserades av 18S rRNA (intern kontroll) nivåer. Se tabell S2 i fil S1 för primer- och sondsekvenser. Eukaryot 18S rRNA detekterades med förutvecklade TaqMan-analysreagenser (Applied Biosystems).

Tabell 1. Kliniska baslinjeegenskaper hos patienter vid njurbiopsi som analyserades för uttryck av MRP8-protein med immunhistokemi.

MGA: mindre glomerulär abnormitet, MCNS: nefrotiskt syndrom med minimal förändring, ORG:fetma-relaterad glomerulopati, DN: diabetisk nefropati, BMI: body mass index, BUN: blod urea kväve, CRP: C-reaktivt protein. Data är medel 6 SD. *Övergripande skillnader mellan MGA-, MCNS-, ORG- och DN-grupper jämfördes av ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 behandling av makrofager

Benmärgshärledda makrofager genererades från vildtyp eller TLR4 knockout (KO) möss [18] på C57BL/6J genetisk bakgrund (Oriental BioService, Kyoto, Japan) som beskrivits tidigare [6]. Kortfattat, efter lysering av röda blodkroppar, återsuspenderades benmärgsceller i ett medium innehållande 20 procent fetalt kalvserum och 50 ng/ml rekombinant human makrofag-kolonistimulerande faktor (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) och odlades vid 37uC i 5 procent CO2-atmosfär. På dag 7 inkuberades makrofager med rekombinant mus MRP8 (Abnova, Taipei, Taiwan) eller vehikel under 4 timmar. Polymyxin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan) sattes till varje brunn för att minimera kontaminering av endotoxin som beskrivits tidigare [3,19]. Noendotoxin detekterades vid vilken koncentration av MRP8 som helst som testades härefter inkubation med 25 mg/ml polymyxin B med ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Totalt RNA från celler extraherades med RNeasy MiniKit, och mRNA-expressionsnivåer av interleukin-1 beta (IL-1b), tumörnekrosfaktor-alfa (TNFa) och MRP8 bestämdes av TaqMan i realtid RT-PCR. Uttrycksnivåer för alla gener normaliserades av GAPDH-nivåer hos gnagare (intern kontroll, förutvecklade TaqMan-analysreagenser). Primer- och probsekvenser för realtids-PCR listas i tabell S2 i fil S1.

Statistisk analys

Data uttrycks som medelvärde 6 SD, eller medelvärde 695 procent konfidensintervall (CI) när så är lämpligt. För jämförelsen mellan fyra grupper användes envägs eller tvåvägs ANOVA med Bonferronis post-hoc analys, och kategoriska variabler jämfördes med x2 test. Elevens oparade t-test användes för jämförelse mellan två grupper efter behov. Spearman-korrelationskoefficienter uppskattades för att bestämma samband mellan två variabler. För att undersöka effekterna av baslinjekovariater som bestämmer omfattningen av glomerulärt eller tubulointerstitiellt MRP8-uttryck eller urinproteinnivåer ett år efter biopsi, utfördes univariata och multivariata linjära regressionsanalyser. Logistisk regressionsanalys användes för att analysera förklarande variabler som förutsäger förekomsten av njurhändelser. All data analyserades med hjälp av StatView 5.0 programvara (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA). P-värden,0.05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

Effekter av cistanche: behandling av njursjukdomar

Resultat

Vi jämförde MRP8 proteinuttrycksnivåer injurebland DN, ORG och icke-överviktiga, icke-diabetiska kontrollgrupper (MGA och CNS). Immunhistokemisk analys visade att både glomerulär MRP8-positivt cellantal (Fig. 1A) och tubulointerstitiell MRP8-positiv area (Fig. 1B) i DN var signifikant större än de i andra grupper inklusive MGA, MCNS, och ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tabell 2. Kliniska baslinjeegenskaper för patienter vid njurbiopsi som analyserades för MRP8-mRNA-uttryck med realtids-RT-PCR.

Associationerna mellannjureMRP8-signaler och kliniska baslinjeparametrar vid tidpunkten för njurbiopsi analyserades i tvärsnitt (tabell 3). Genom univariat analys var uttrycket av glomerulärt och/eller tubulointerstitiellt MRP8-protein signifikant korrelerat till ålder, systoliskt och diastoliskt blodtryck, urinprotein, serumnivåer av kreatinin, BUN- och HDL-kolesterol, eGFR, och omfattningen av global glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros. Dessa parametrar undersöktes ytterligare genom multivariat analys efter att ha exkluderat diastoliskt blodtryck, eGFR och BUN på grund av kollinearitet. Procentandelen av tubulointerstitiell fibros var oberoende korrelerad med glomeruläraMRP8-signaler (b=0.62, justerad P=0.02) och tubulointerstitialMRP8-signaler (b=0.85, justerad P 0,001), respektive. Dessutom var tubulointerstitiell MRP8-signaler också oberoende korrelerade med proteinuri vid baslinje (b=0.20, justerad P=0.01). Spridda plotanalyser mellan MRP8-signaler i glomeruli eller tubulointerstitium och kliniska parametrar indikerade att MCNS-gruppen hade ett distinkt distributionsmönster från andra grupper, särskilt vad gäller urinprotein och serum-LDL-kolesterolnivåer (Fig. S5A–D, S6A–D). Uteslutning av MCNS-grupp förbättrade korrelationen mellan MRP8-signaler och urinprotein eller serum-LDL-kolesterolnivåer (Fig. S5E-F, S6E-F). Därför genomförde vi en delanalys som exkluderade MCNS-patienter och fann att urinprotein var en oberoende faktor korrelerad med glomerulära MRP8-signaler genom multivariat analys (tabell 4; b=0.36, justerad P=0.03 ).

Därefter utförde vi linjär regression eller logistisk regressionsanalys för att identifiera förklarande faktorer som förutsäger njurresultat som var omfattningen av proteinuri ett år senare och njurhändelser inom ett år. Eftersom det fanns ett bra samband mellan glomerulära och tubulointerstitiella MRP8-signaler (Fig. S7; R=0.67,P,0.001), inkluderades dessa parametrar alternativt i ytterligare analyser . Vi utvärderade sambandet mellan baslinjeparametrar och urinprotein vid 1 år efter njurbiopsi genom multipel regressionsanalys. Som visas i tabell 5 var glomerulär MRP8-signal (b=0.59, justerad P,0.001) en prediktiv faktor för omfattningen av proteinuri ett år senare, såväl som baslinjesystoliskt blodtryck (b {{13} }.21, justerad P=0.04) och baslinjeproteinuri(b=0.37, justerad P=0.002). Dessa parametrar var oberoende av andra kända riskfaktorer för diabetisk nefropati, inklusive njurdysfunktion (serumkreatinin) och omfattningen av global skleros och tubulointerstitiell fibros [11,21-24]. Å andra sidan var tubulointerstitiell MRP8-signal (b=0.34, justerad P=0.09) inte en oberoende prediktiv faktor för urinproteinnivåer ett år senare. Njurhändelser inträffade hos 7 patienter (6 i DN och 1 i ORG-fall) inom ett år efter njurbiopsi. Genom univariat analys var inte bara omfattningen av glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros, och glomerulära och tubulointerstitiell MRP8-signaler, utan även blodtryck, njurdysfunktion och urinproteinnivåer vid baslinjen signifikanta prediktiva faktorer för förekomsten av njurhändelser. Men genom multivariat analys, avbröts deras kovariater av varandra (tabell S3 i fil S1), troligen på grund av höga korrelationer mellan dessa parametrar.

Slutligen undersökte vi styrkan hos MRP8 som en endogen ligand för TLR4 med hjälp av odlade makrofager. I benmärgshärledda makrofager från vildtypsmöss inducerade MRP8-protein uppreglering av proinflammatoriska cytokingener som IL-1b och TNFa och utlöste även autoinduktion av MRP8, på ett dosberoende sätt mellan 1{{ 15}}–1000 ng/ml. Dessa effekter av MRP8 undertrycktes med ungefär två tredjedelar i makrofager erhållna från TLR4 KO-möss (P, 0,01) (Fig. 3).

Figur 1. Immunhistokemiska och mRNA-analyser för MRP8 innjurebiopsiprover. Kvantifiering av glomerulär MRP{{0}}positivt cellantal (A) och tubulointerstitiell MRP8-positiv area (B). mRNA-uttryck av MRP8 i glomerulära och icke-glomerulära fraktioner (C). Öppna staplar: icke-överviktiga, icke-diabeteskontroller som är MGA eller MCNS, stängda staplar: ORG eller DN (A–C). Representativa bilder av MGA-, MCNS-, ORG- och DN-grupper (D–G). MGA: mindre glomerulär abnormitet, MCNS: nefrotiskt syndrom med minimal förändring, ORG: fetmarelaterad glomerulopati, DN: diabetisk nefropati. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Diskussion

Den aktuella studien har visat att MRP8 uttrycks rikligt i glomeruli och tubulointerstitium hos patienter med DNas jämfört med ORG och icke-överviktiga, icke-diabeteskontroller (MGA och MCNS). Dessutom, i ORG-ämnen, tenderade MRP8-uttrycksnivåerna att vara högre än MGA- eller MCNS-ämnen. I baslinjetvärsnittsundersökning inklusive alla försökspersoner, genom univariat linjär regressionsanalys, var glomerulärt MRP8-positivt cellantal respektive tubulointerstitiellt MRP8-positivt område korrelerade, inte bara med olika kända riskfaktorer för diabetisk nefropati (såsom systoliskt blodtryck, proteinuri och serumkreatinin) men också med omfattningen av glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros. Genom multivariat analys var tubulointerstitiell MRP8-positiv area signifikant korrelerad med proteinuri och tubulointerstitiell fibros. Glomerulärt MRP8-positivt cellantal var signifikant korrelerat med tubulointerstitiell fibros i den primära analysen och med proteinuri i en delanalys som exkluderade MCNS-gruppen. Immunhistokemi indikerade att MRP8 uttrycktes, åtminstone delvis, av CD68(plus)-uttryckande makrofager och atrofiska tubuli. Dessa fynd ger upphov till möjligheten attnjureMRP8-signaler i glomeruli eller tubulointerstitium kan fungera som nya markörer för diabetisk nefropati.

Figur 2. Lokalisering av CD68- och MRP8-proteinuttryck i seriella sektioner av diabetisk nefropatifall. Uttryck av CD68(A, B) och MRP8-uttryck (C, D) i parade njurprover (A och C, ellerB och D). Pilar indikerar samlokalisering av CD68- och MRP8-signaler.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

I den prognostiska studien visade multivariat analys att urinproteinnivåer ett år efter njurbiopsi var oberoende associerade med glomerulärt MRP8-positivt cellantal, urinprotein och systoliskt blodtryck vid baslinjen. Notera att glomerulärt MRP8-uttryck visade den starkaste korrelationen med urinprotein ett år senare (b= 0.87), till och med starkare än baslinjeurinprotein (b=0.78), genom univariat analys. Det beror delvis på att det glomerulära MRP8-uttrycket inte är särskilt förhöjt i "godartade" former av proteinuri, såsom de som observeras hos MCNSpatienter, vars nivåer av proteinuri är extremt höga vid diagnos genom njurbiopsi men vanligtvis försvinner inom ett år efter påbörjad immunsuppressiv terapi. Dessa fynd tyder på att glomerulärt MRP8-uttryck kan ha en unik prediktiv natur som en sjukdomsmarkör, som inte kan ersättas av baslinjeproteinuri eller rutinpatologisk analys som utvärderar global glomeruloskleros och tubulointerstitiell fibros. Dessutom spekulerar vi att glomerulär MRP8-uttryck inte är en enkel markör eller åskådare utan en aktiv spelare i glomerulär skada som diskuteras nedan.

Bestämningskoefficienten (R2) beräknad med förklarande parametrar inkluderade i multipel regressionsanalys var 0.52* respektive 0.74#. y, år; BP, blodtryck; gCr, g kreatinin; T-kol, totalt kolesterol; HDL-kol, HDL-kolesterol; LDL-kol, LDL-kolesterol; GS, glomeruloskleros; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tabell 4. Delanalys av sambandet mellan kliniska baslinjeparametrar och MRP8-signaler, efter uteslutning av MCNS-grupp.

Tabell 5. Multipel regressionsanalys för identifiering av faktorer som förutsäger urinproteinnivåer 1 år efter njurbiopsi

Figur 3. Effekter av MRP8 på benmärgshärledda makrofager. Benmärgshärledda makrofager (BMDM) stimulerades med rekombinant mus MRP8 under 4 timmar. Felstaplar indikerar 95 procent CI och statistiska analyser utfördes med log-transformerade värden. Tvåvägs ANOVA avslöjade signifikanta effekter av genotyper, MRP8-koncentrationer och deras interaktioner för uttryck av alla 3 gener (P,0.001 för alla jämförelser). n=4. WT, vildtyp; KO, knockout; IL-1b, interleukin 1 beta; TNFa, tumörnekrosfaktor-alfa. *P,0,01 bland olika koncentrationer, #P,0,01 bland genotyper.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

I ett annat försök av en longitudinell studie, lyckades logistisk regressionsanalys inte ta reda på några oberoende prediktorer för förekomsten av en njurhändelse inom ett år. Vi spekulerar att detta delvis beror på att tubulointerstitiell MRP8-uttryck och tubulointerstitiell fibros var två potenta prediktorer för njurhändelser i univariat analys men deras betydelse avbröts av varandra i multivariat analys. Dessa två parametrar visade en stark korrelation (R=0.68, P,0.001) (Fig. S8), vilket tyder på att dessa två parametrar kan vara likvärdiga med att förutsäga njurhändelser. I själva verket visade interstitiell MRP8-uttryck ganska liknande mönster som interstitiell fibros utvärderad av Masson-trikromfärgning. Mängden interstitiell MRP8 beror till stor del på de positiva signalerna i atrofiska tubuli snarare än de i makrofager, vars särdrag skiljer sig från glomerulär MRP8 i en punktformig fördelning. Dessutom kan en liten provstorlek, kort observationsperiod och få försökspersoner som utvecklade njurhändelser ha minskat detektionsförmågan. Eftersom MRP8-uttryck i tubulära epitelceller spelar en orsaksroll i progressionen av tubulointerstitiell inflammation i en musmodell av njurfibros [7], kommer ytterligare analys att behövas för att klargöra rollen av tubulointerstitiell MRP8 i DN.

I enlighet med vår tidigare studie [6], uppreglerades MRP8 mRNA främst i den glomerulära fraktionen av humana DN-ämnen jämfört med kontrollpersoner med MGA. Å andra sidan observerades MRP8-proteinuttryck inte bara i glomerulus utan även i tubulointerstitium. I detta avseende bör det noteras att det fanns två distinkta mönster av MRP8-färgning i tubulointerstitium av DN. En var intensiv och fokal färgning i kraftigt atrofiska tubuli. Den andra var mild färgning fördelad längs borstkanten av proximala tubuli, som också hittades i ORG och MCNS. De senare signalerna representerar sannolikt MRP8-protein som härrör från blodet och reabsorberas av proximala tubuli, vilket inte bör åtföljas av ökat MRP8-mRNA-uttryck. När det gäller andra proteiner än MRP8 har vi och andra nyligen rapporterat liknande fenomen med immunreaktivt proteindetektion i de proximala tubuli orsakade av reabsorption men inte av njursyntes [25,26]. Å andra sidan, eftersom en liten MRP8-färgning kvarstod i antikroppsabsorptionstestet, särskilt i glomerulära exsudativa lesioner och allvarligt ärrade, fibrotiska lesioner runt atrofiska tubuli, kan närvaron av ospecifika signaler inte helt negeras (Fig. S3).

Glomerulära MRP8-signaler visade främst punktmönster i DN-ämnen (Fig. 1, Fig. S4). Eftersom både CD68 och MRP8 detekterades av musmonoklonala antikroppar, utvärderades lokaliseringen av dessa molekyler genom seriesnitt, inte genom dubbel immunfärgning. Färgningsmönster för MRP8 var kompatibla med de i andra inflammatoriska njursjukdomar inklusive IgAnephrit [27], membranproliferativ glomerulonefrit [14] och ANCA-relaterad glomerulonefrit [20], där makrofager föreslogs som en viktig källa till MRP8, som vi rapporterade i en gnagarmodell [6]. Dessutom kan neutrofiler betraktas som en annan källa till MRP8 som påverkar vaskulära komplikationer [28]. För närvarande undersöker vi den molekylära mekanismen varför MRP8 övervägande är uppreglerad i myeloidceller som infiltrerar glomeruli. In vitro-studie avslöjade att MRP8 inducerade inflammatoriskt cytokinuttryck och även förstärkte uttrycket av MRP8 självt i makrofager på ett TLR4-beroende sätt. Dessutom saknades MRP8-positiva celler i nodulära skleroserande lesioner, vilket tyder på att glomerulär MRP8 kan återspegla pågående glomerulär skada [20]. Viktigt är att en storskalig mänsklig studie rapporterade att MRP8-genexpression i mononukleära blodceller hos patienter med typ 1-diabetes är signifikant förhöjd hos patienter med diabeteskomplikationer inklusive nefropati [29].

Eftersom hämning av renin-angiotensinsystemet (RAS) är en viktig bestämningsfaktor för njurresultat, undersökte vi effekterna av RAS-blockad pånjureMRP8 uttryck. Vi fann ingen signifikant skillnad i njur-MRP8-mRNA-uttryck mellan DN-patienter som behandlats med eller utan RAS-blockad (Fig. S9), troligen för att fall som behandlats med RAS-blockad tenderade att ha mer allvarlig hypertoni och proteinuri än fall utan RAS-blockad

Hos överviktiga människor och möss kan ökat plasma MRP8/14-komplex återspegla en grad avfetmaoch härstammar från såväl fettocyter som leukocyter [8,9]. Våra ORG-fall hade mild färgning av MRP8 i proximala tubuli, vilket tyder på ökade plasmanivåer av MRP8. Däremot fanns det ingen signifikant korrelation mellan tubulointerstitiell MRP8-uttryck och body mass index (Fig. S6G). Därför lokal MRP8 uttryck injurekan fungera bättre som en markör för njurskada snarare än förfetma[8,9].

Cistanche för att förbättra njurdysfunktion

Vår studie har flera begränsningar. Antalet urval av varje studerad grupp var litet. Icke-identiska försökspersoner inkluderades i mRNA och immunhistokemiska analyser. Eftersom vi endast analyserade patienter som genomgick njurbiopsi, kanske sammansättningen av patienter som undersöks här inte återspeglar de hos generella typ 2-diabetespatienter eller generellt kroniska patienter.njuresjukdomsämnen. Även om ålder inte behölls som en oberoende faktor associerad med MRP8-signaler i våra data (tabell 3), är det känt att åldrande är associerat med kronisk inflammation [30]. Ålderns effekter kan inte helt försummas. Även om de flesta MRP8-signaler gick förlorade i antikroppsabsorptionstestet, fanns det några positiva signaler kvar, vilket kan orsakas av den ospecifika bindningen av den första antikroppen. Som diskuterats ovan hjälper undersökning av njur-MRP8-uttryck genom njurbiopsi oss att förstå patofysiologin och prognosen för kroniska njursjukdomar, särskilt förknippade medfetmaoch diabetes, men har en nackdel för rutinmässig och upprepad användning i öppenvårdsmottagningar

Sammanfattningsvis föreslår den aktuella studien att uttrycket av MRP8 injurespeglar det aktuella patologiska tillståndet och förutsäger även njurutfall hos patienter medfetmaellerdiabetes typ 2. Ytterligare undersökningar av MRP8-nivåer i urin bland överviktiga eller diabetespatienter i stor skala kan vara motiverade

Stödjande information

Figur S1 Representativa foton som visar njurbiopsisnitt av en DN-patient färgad med (A) perjodsyra Schiff, (B) periodsyra-metenaminsilver eller (C)Masson-trikrom. Förhållandet mellan antalet glomeruli med global skleros (pilar) bland totalt glomeruli och den relativa arean av tubulointerstitiell fibros var 33 procent respektive 65 procent hos denna patient. (TIFF)

Figur S2 Immunhistokemi för MRP8- och CD68-proteiner hos DN-patienter. Foton i den högra kolumnen visar negativa kontrollexperiment utan 1:a antikropp. (TIF)

Figur S3 Antikroppsabsorptionstest för MRP8-färgning.PBS: fosfatbuffrad saltlösning, rhMRP8: rekombinant humanMRP8.(TIF)

Figur S4 Representativa bilder av MRP8-uttryck i MGA-, MCNS-, ORG- och DN-grupper.(TIF)

Figur S5 Korrelation mellan glomerulär MRP8-positivt cellantal och kliniska parametrar. De log-transformerade värdena för MRP8-signaler användes. Korrelationerna analyserades med alla 4 grupper (A–D, G) eller 3 grupper exklusive MCNS-gruppen (E, F). Öppna cirklar: mindre glomerulär abnormitet (MGA), slutna cirklar: minimal förändring nefrotiskt syndrom (MCNS), öppna trianglar:fetma-relaterad glomerulopati (ORG), slutna trianglar: diabetisk nefropati (DN).(TIF)

Figur S6 Korrelation mellan tubulointerstitiell MRP8-positiv area och kliniska parametrar. De log-transformerade värdena för MRP8-signaler användes. Dessa korrelationer analyserades med alla de fyra grupperna (A–D, G) eller tre grupper exklusive MCNS-gruppen (E, F).(TIF)

Figur S7 Korrelation mellan glomerulärt och tubulointerstitiellt MRP8-uttryck. De log-transformerade värdena för MRP8-signaler användes.(TIF)

Figur S8 Korrelation mellan tubulointerstitiell MRP8-positiv area och tubulointerstitiell fibros. De log-transformerade värdena för MRP8-signaler användes.(TIF)

Figur S9 Renalt mRNA-uttryck av MRP8 i DN-patienter med eller utan renin-angiotensinblockad.NS: inte signifikant. n=15 (Ja), 6 (Nej). Bland 22 DN-fall saknades information om medicinering hos en patient.(TIF)

Fil S1 Stödtabeller.

Tabell S1, Patologiska diagnoser av alla fall som genomgått njurbiopsi vid Institutionen för medicin och klinisk vetenskap, Kyoto universitetssjukhus mellan 2000 och 2011. Tabell S2, Primer- och sondsekvenser för TaqMan realtids-RT-PCR. Tabell S3, Logistisk regressionsanalys för förekomsten av en njurhändelse inom ett år. (DOC)Tack Vi tackar S. Tanaka för statistiska råd, Y. Ogawa, N.Igarashi och C. Kimura för teknisk assistans och A. Yamamoto och SOgino för sekreterarhjälp. Författarbidrag Utformade och designade experimenten: TK KM MK HY MI AN KNMM. Utförde experimenten: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analyserade data: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Bidragna reagenser/material/analysverktyg: TK KM. Skrev tidningen: TK KMMM.

Effekter av cistanche: behandling av njursjukdomar

Referenser

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Typ 2-diabetes som en inflammatorisk sjukdom.Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et al. (1987) Tvåkalciumbindande proteiner i infiltrerande makrofager av reumatoid artrit. Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 och Mrp14 är endogena aktivatorer av Toll-liknande receptor 4, vilket främjar dödlig, endotoxin-inducerad chock. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M, et al. (2009) Myeloidrelaterat protein-8/14 är avgörande för det biologiska svaret på kärlskada. Circulation 120: 427–436.

5. Loser K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010) De Toll-liknande receptor 4-liganderna Mrp8 och Mrp14 är avgörande för utvecklingen av autoreaktiva CD8 plus T-celler. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Förvärring av diabetisk nefropati av hyperlipidemi förmedlas av Toll-liknande receptor 4 hos möss. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Njuruppsamlingskanalepitelceller reglerar inflammation i tubulointerstitiell skada hos möss. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T, et al. (2012) Höga cirkulerande nivåer av S100A8/A9-komplex (calprotectin) hos japanska manliga med bukfett och dysregulerat uttryck av S100A8 och S100A9 i fettvävnader hos överviktiga möss. Biochem Biophys Res Commun 419: 782–789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP, et al. (2009) Calprotectin - en ny markör förfetma. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, et al. (2009) Reviderade ekvationer för uppskattad GFR från serumkreatinin i Japan. Am JNjureDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Diabetisk nefropati: diagnos, förebyggande och behandling. Diabetesvård 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)Fetma-relaterad glomerulopati: en framväxande epidemi.NjureInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006)Fetma, proteinuri och progression av njursvikt.Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M, et al. (2005) Myeloidrelaterade protein 8-uttryck på makrofager är en användbar prognostisk markör för njurdysfunktion hos barn med MPGN typ 1. Am JNjureDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Angiotensinogen i urinen återspeglar aktiviteten hos det intrarenala renin-angiotensinsystemet hos patienter med IgA-nefropati. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012) Natriuretisk peptidreceptor guanylylcyklas-A skyddar podocyter från aldosteroninducerad glomerulär skada. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T, et al. (2008) Överuttryck av bindvävstillväxtfaktor i podocyter förvärrar diabetisk nefropati hos möss.NjureInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, et al. (1999) Spetskant: Möss med brist på toll-like receptor 4 (TLR4) är hyporesponsiva på lipopolysackarid: bevis för TLR4 som Lps-genprodukten. J Immunol162: 3749-3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X, et al. (2007) Rollen för den Toll-liknande receptorn 4/NF-kappaB-vägen i mättade fettsyra-inducerade inflammatoriska förändringar i interaktionen mellan adipocyter och makrofager. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Leukocyt och serum S100A8/S100A9 uttryck speglar sjukdomsaktivitet i ANCA-associerad vaskulit och glomerulonefrit.NjureInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) De viktigaste riskfaktorerna för nefropati vid typ 2-diabetes mellitus är plasmakolesterolnivåer, medelblodtryck och hyperglykemi. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Samband mellan systoliskt blodtryck och makrovaskulära och mikrovaskulära komplikationer av typ 2-diabetes (UKPDS 36): en prospektiv observationsstudie.BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nefropati av typ-2 diabetes mellitus. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Kliniska och histologiska korrelationer av försämrad njurfunktion hos diabetespatienter med proteinuri. Diabetes 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotensinogen är den primära källan till renalt angiotensin II. J Am Soc Nephrol23: 1181–1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Urinära neutrofila gelatinas-associerade lipokalinnivåer återspeglar skador på glomeruli, proximala tubuli och distala nefroner.NjureInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Ackumulering av makrofager som uttrycker myeloidrelaterat protein 8 associerat med progressionen av sklerotiska förändringar hos barn med IgA nefropati. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hyperglykemi främjar myelopoies och försämrar upplösningen av åderförkalkning. Cell Metab 17: 695-708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X, et al. (2013) Uttrycket av inflammatoriska gener är uppreglerat i perifert blod hos patienter med typ 1-diabetes. Diabetesvård.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Evolutionär medicin: från dvärgmodellsystem till friska hundraåringar? Science 299: 1342–1346.

Citat: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Predictive Significance ofNjureMyeloid-relaterat protein 8-uttryck hos patienter medFetma- eller typ 2-diabetes-associerade njursjukdomar. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Redaktör: Utpal Sen, University of Louisville, USA

Mottaget 11 september 2013; Godkänd 14 januari 2014; Publicerad 18 februari 2014

Upphovsrätt: 2014 Kuwabara et al. Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.

Finansiering: Detta arbete stöddes delvis av Grant-in-Aid for diabetes nefropati och nefrosklerosforskning från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd i Japan (till KM), forskningsanslag från det japanska ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap , och Technology (till TK, KM och MM), från Japan Foundation for Applied Enzymology (till TK) och från Smoking Research Foundation (till MM). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.

Konkurrerande intressen: Författarna har förklarat att det inte finns några konkurrerande intressen.

* E-post: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp