Preparativ isolering och rening av fyra föreningar från Cistanches Deserticola YC Ma genom höghastighetsmotströmskromatografi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt:

Efter ett steg för anrikning av beståndsdelar på en silikagelkolonn, fyrafenyletanoidglykosiderisolerades framgångsrikt frånCistanches deserticolaoch renas genom preparativ höghastighetsmotströmskromatografi (HSCCC) med ett tvåfas lösningsmedelssystem bestående av etylacetat-n-butanol-etanol-vatten (40:6:6:50, v/v /v/v). Totalt 30,9 mg akteosid, 13,0 mg isoakteosid, 12,5 mg syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid och 7,2 mg 2'-acetylakteosid med en renhet på högre än 95 procent, bestämd med HPLC-ELSD, erhålls i enstegsseparation från 297 mg avCistanche deserticola extrakt, respektive. Deras strukturer identifierades med HR-MS, IH-NMR och 13C-NMR.

Nyckelord: höghastighetsmotströmskromatografi;Cistanches deserticola YC Ma;fenyletanoidglykosider; akteosid; isoakteosid; syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid; 2'-acetylakteosid.

Introduktion

Cistanches deserticolaYC Ma, en art avCistanchersom tillhör Orobanchacea-familjen, är en välkänd traditionell kinesisk medicin för behandling av njurbrist, kvinnlig infertilitet, sjuklig leukorré, neurapraxi och senil förstoppning [1]. Det är en parasitisk växt som är utbredd i nordvästra Kina. Hittills har flera föreningar, inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider och lignaner isolerats från denna art [2]. Några av PhGs har rapporterats ha antioxidativa, leverskyddande och neuroprotektiva aktiviteter [3–6]. Emellertid är isolerings- och reningsproceduren för PhG svårt och tidskrävande. Dessutom använder de klassiska multipelkromatografiska metoderna inte bara ett stort antal organiska lösningsmedel utan ger också en lägre provåtervinning. Höghastighetsmotströmskromatografi (HSCCC), en stödfri vätske-vätskefördelningskromatografisk teknik, erbjuder utmärkt provåtervinning jämfört med vissa konventionella metoder och har använts i stor utsträckning för separation och rening av olika naturprodukter [7–9] . Även om flera PhG har renats frånCistanchersläkte och andra av HSCCC [10–14], inget papper har rapporterat rening av akteosid, isoakteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid och 2'-acetylakteosid i ett bifasiskt system.

I detta dokument rapporterar vi en enkel metod för separation och rening av fyra PhG från C. deserticola. Slutligen erhölls 30,9 mg akteosid, 13,0 mg isoakteosid, 12,5 mg syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid och 7,2 mg 2'-acetylakteosid i ett steg separation från 297 mg fraktion med renheter på 99 procent, 95 procent, 99 procent respektive 98 procent. Deras strukturer karakteriserades baserat på 1H- och 13C-NMR-spektraldata och HR-MS-spektra. Strukturerna för de fyra PhG som identifierats i denna undersökning visas i figur 1.

Resultat och diskussion

HPLC-analys av råextraktet

Den ingående anrikade fraktionen av n-butanextrakt från C. deserticola analyserades med HPLC-UV. Kolonnen som användes var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, stad, delstatsförkortning, USA), den mobila fasen var metanol-vatten (30:70, v/v). Flödeshastigheten var 1 ml/min. Detektorvåglängden sattes till 254 nm. HPLC-kromatogrammet visas i figur 2. Topparna 1 till 4 motsvarar akteosid (1), isoakteosid (2), syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid (3) och 2'-acetylakteosid (4), respektive.

Val av tvåfas lösningsmedelssystem

Framgångsrik separation med HSCCC beror till stor del på valet av ett lämpligt tvåfas lösningsmedelssystem, tvåfaslösningsmedelssystemet valdes enligt fördelningskoefficientvärdena (K) för varje målkomponent och ett optimalt intervall för K bör vara från {{ 2}}.5 till 2.

I experimentet visas K-värdena för målkomponenter i flera tvåfasiga lösningsmedelssystem i tabell 1 (även om något högre för topp 4 visades resultaten vara acceptabla). Bland dem gav etylacetat-n-butanol-etanol-vatten (40:6:6:50, v/v/v/v) lämpliga fördelningskoefficienter för målföreningarna. Så småningom användes lösningsmedelssystemet bestående av etylacetat-n-butanol-etanol-vatten (40:6:6:50, v/v/v/v) för att isolera och rena fyra föreningar av C. deserticola, som visas i Figur 3. Som visas i figur 2 visade HPLC-analysen av varje HSCCC-fraktion att fyra rena PhG (akteosid, 99 procent; isoacteosid, 95 procent; syringalid A 3′- -L-rhamnopyranosid 99 procent och 2′- acetylakteosid 98 procent) kunde erhållas från den råa fraktionen.

Experimentell

Anordning

HSCCC-utrustningen som användes i denna studie var ett TBE-300B höghastighetsmotströmskromatografisystem (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Kina) med tre preparativa flerskiktsspolseparationskolonner kopplade i serie (rörets diameter)=2.6 mm, total volym=300 mL) och en 20 mL provslinga. Varvradien eller avståndet mellan hållarens axel och mittencentrifugens axel (centrifugens axel (R) var 5 cm, och värdet varierade från 0.5 vid den inre terminalen till 0.8 vid den externa terminalen (= r/R, där r är avståndet från spolen till hållaraxeln). Ett HX 105 cirkulationsredskap med konstant temperatur (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Kina) användes för att kontrollera temperaturen i experimentet. HSCCC-systemet var utrustat med en modell TBP-5002 konstantflödespump av medeltryck, en modell TBP-2000 UV-detektor som arbetade vid 254 nm och en arbetsstation modell V4.0 (Jinda Biochemistry Instrument Company, Shanghai, Kina).

Den högpresterande vätskekromatografiutrustningen (HPLC) som användes var ett Agilent 1200-system som består av en G1312A binär pump, en G1329A autosampler, en G1314A variabel våglängdsdetektor (VWD), en G1316A termostaterad kolonnfack, en G1379, en G1379. arbetsstation. En Alltech 3300 ELSD användes för detektering av renheten. Agilent 6520 Q-TOF och Bruker AVANCE III 500-NMR-spektrometrar användes för föreningars strukturella identifiering. 1H- och 13C-NMR-spektra (vid 500 respektive 125 MHz) mättes vid rumstemperatur (22 grader /295,1 K).

Reagens och material

Etylacetat, n-butanol och etanol var analytiska kvaliteter och metanol var HPLC-kvalitet. Alla lösningsmedel köptes från Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Kina). Milli-Q-vatten (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) användes för alla lösningar och spädningar. Rotstocken av C. deserticola samlades in från provinsen Inre Mongoliet, Folkrepubliken Kina, i juni 2009. Växten identifierades av Prof. Lijuan Zhang och ett kupongprov (nr 20091001) deponerades i vårt laboratorium.

Beredning av råprov

Pulvertorkade, köttiga stjälkar av C. deserticola (1 kg) återloppskokades två gånger med vattenhaltig etanol (8 1, 60 % v/v) under 2 timmar varje gång. Extraktet indunstades under reducerat tryck och vid en temperatur av 60 grader tills total avdunstning av etanolen. Återstoden suspenderades i vatten och extraherades i tur och ordning tre gånger med kloroform, etylacetat och n-butanol, vilket gav 5,16 g n-butansyraextrakt efter indunstning till torrhet under reducerat tryck. N-butanextraktet separerades sedan på en silikagelkolonn (200–300 mesh) med progressiv gradienteluering (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) för att ge åtta fraktioner. Fraktion 6 (297 mg) användes för ytterligare HSCCC-isolering och separation.

Val av tvåfaslösningsmedelssystem

De tvåfasiga lösningsmedelssystemen valdes enligt fördelningskoefficienten (K) för målkomponenterna i fraktionen av C. deserticola. K-värdena bestämdes genom LC-analys enligt följande: Lämplig mängd råextraktpulver (fraktion 6) löstes i den nedre fasen av lösningsmedelssystemet och analyserades med HPLC. Topparnas områden registrerades som A1. Sedan sattes en lika stor volym av den övre fasen till lösningen och blandades noggrant för att uppnå fördelningsjämvikt. Den undre fasen analyserades sedan med HPLC igen. De senare toppområdena registrerades som A2. K-värdena beräknades enligt följande ekvation: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

Beredning av tvåfaslösningsmedelssystem och provlösning

I föreliggande studie användes tvåfaslösningsmedelssystemet bestående av etylacetat-n-butanol-etanol-vatten (40:6:6:50, v/v/v/v) för HSCCC-separation. Varje lösningsmedel sattes till en separertratt och jämviktades noggrant vid rumstemperatur. Den övre fasen och den undre fasen separerades och avgasades genom ultraljudbehandling under 30 minuter kort före användning. Provlösningen framställdes genom att lösa upp 297 mg av fraktion 6 i 15 ml av den nedre fasen av etylacetat-n-butanol-etanol-vatten (40:6:6:50, v/v/v/v).

HSCCC-separationsprocedur

HSCCC utfördes enligt följande. Den flerskiktiga lindade kolonnen fylldes först med den övre organiska stationära fasen. Den undre vattenhaltiga rörliga fasen pumpades sedan in i kolonnens huvudände med en flödeshastighet av 1,5 ml/min, och samtidigt kördes HSCCC-apparaten med en varvhastighet av 900 rpm. Efter att hydrodynamisk jämvikt hade etablerats, vilket indikeras av en klar mobil fas som eluerar vid svansutloppet (cirka två timmar senare), injicerades en 15 ml provlösning innehållande 297 mg av det råa extraktet (fraktion 6) genom injektionsventilen. Kolonnens effluent övervakades kontinuerligt under 254 nm. Fyra toppfraktioner uppsamlades enligt kromatogrammet och indunstades sedan under reducerat tryck. Temperaturen på apparaten var inställd på 25 grader.

HPLC-analys och identifiering av HSCCC-toppfraktioner

Toppfraktionerna från HSCCC analyserades med HPLC-ELSD. Kolonnen som användes var en Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), den mobila fasen var metanol-vatten (30:70, v/v). Flödeshastigheten var 1 ml/min. ELSD drevs under följande betingelser: Temperatur 45 grader, gas 1,6 l/min. Strukturell identifiering av de fyra HSCCC-toppfraktionerna utfördes med HR-ESI-MS, 1H och 13C-NMR-spektroskopi.

Den strukturella identifieringen

Fraktion I: HR-ESI-MS observerad vid m/z 623,2001 (M-H)-, beräknat för C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 av ramnos), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukos), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34} } av rhamnos), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar -CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatisk H).13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C{{65} }), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf-2), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf{{ 98}}), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc{{116} }), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha{{131} }), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha{{146} }). Jämfört med data som ges i litteraturen [17] motsvarade fraktion I akteosid.

Fraktion II: HR-ESI-MS observerad vid m/z 623,1987 (M-H)-, beräknat för C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 av rhamnos), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukos), 5,17 (1H, d, J {{ 33}} Hz, H-1 av rhamnos), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). 1H-NMR och 13C-NMR spektraldata överensstämde med de för isoacteosid som rapporterats i litteraturen [18].

Fraktion III: HR-ESI-MS observerad vid m/z 6{{108}}7,2032 (M−H)−, beräknat för C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 av ramnos), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukos), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{{ 35}} av rhamnos), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH =CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Enligt litteraturen [18] motsvarade fraktion III syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid.

Fraktion IV: HR-ESI-MS observerad vid m/z 665,21{{20}} (M−H)−, beräknat för C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 av ramnos), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J { {25}},5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 av glukos), 4,90 (1H, d, J { {37}} Hz, H-1 av rhamnos), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatisk H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 1H-NMR- och 13C-NMR-spektraldata var i överensstämmelse med de för 2'-acetylakteosid [17].

Slutsatser

En HSCCC-metod för preparativ separation och rening av akteosid, isoakteosid, syringalid A 3'- -L-rhamnopyranosid och 2'-acetylakteosid frånCistanches deserticola YC Magrundades. Den aktuella studien indikerar att HSCCC är en mycket kraftfull teknik för preparativ separation och rening av bioaktiva komponenter från växtmaterial. Dessutom kan föreningarna isoleras i tillräckligt stor skala med höga renheter och kan sedan användas som referensämnen för kromatografi eller bioaktivitetsstudier. Metoden är en genomförbar, ekonomisk och effektiv teknik för snabb preparativ isolering av komplicerade naturprodukter.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (PCSIRT), Project of International Cooperation Plan från ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2008DFB30070) och Scientific Program of Left Banner of Alashan ({{2 }}).

Referenser

1. Kinesisk farmakopékommission. Folkrepubliken Kinas farmakopé; People's Medical Publishing House: Peking, Kina, 2010; Volym 1, sid. 126.

2. Jiang, Y.; Tu, PF Analys av kemiska beståndsdelar i Cistanche-arter. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979.

3. Morikawa, T.; Pan, Y.; Ninomiya, K.; Imura, K.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M.; Yuan, D.; Muraoka, O. Acylerade fenyletanoida aminoglykosider med hepatoskyddande aktivitet från ökenväxten Cistanche tubulosa. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 1882–1890.

4. Chen, H.; Jing, FC; Li, CL; Tu, PF; Zhang, QS; Wang, ZH Echinacoside förhindrar de striatala extracellulära nivåerna av monoaminneurotransmittorer från att minska i 6-hydroxidopaminskada hos råttor. J. Etnopharmacol. 2007, 114, 285–289.

5. Muraoka, O.; Ninomiya, K.; Morikawa, T.; Wakayama, H.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M. Leverskyddande beståndsdelar från stjälkar av Cistanche tubulosa. Yakugaku Zasshi 2007, 127, 49–51.

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, OH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro neuroprotektiva aktiviteter av fenyletanoidglykosider från Callicarpa dichotoma. Planta Med. 2005, 71, 778–780.

7. Li, M.; Liu, RM; Sun, AL; Wu, SJ; Liu, NN Separation och rening av rutin och akaciin från den kinesiska medicinska örten Herba Cirsii genom kombination av makroporöst adsorptionsharts och höghastighetsmotströmskromatografi. J. Chromatogr. Sci. 2009, 47, 329–332.

8. Yin, H.; Zhang, S.; Luo, XM; Liu, YH Preparativ isolering och rening av två bensoxazinoidglukosider från Acanthus ilicifolius L. genom höghastighetsmotströmskromatografi. J. Chromatogr. 2008, 1205, 177–181.

9. Peng, AH; Li, R.; Hu, J.; Chen, LJ; Zhao, X.; Luo, HD; Ja, HEJ; Yuan, Y.; Wei, YQ Flödeshastighetsgradient höghastighetsmotströmskromatografiseparation av fem diterpenoider från Triperygium wilfordii och uppskalning. J. Chromatogr. 2008, 1200, 129–135.

10. Xie, J.; Deng, J.; Tan, F.; Su, J. Separation och rening av echinacoside från Penstemon barbatus (Can.) Roth genom återvinning av höghastighetsmotströmskromatografi. J. Chromatogr. B2010, 878, 2665–2668.

11. Li, L.; Tsao, R.; Yang, R.; Liu, C.; Young, JC; Zhu, H. Isolering och rening av fenyletanoidglykosider frånCistanche deserticolagenom höghastighetsmotströmskromatografi. Food Chem. 2008, 108, 702–710.

12. Li, L.; Tsao, R.; Liu, ZQ; Liu, SY; Yang, R.; Young, JC; Zhu, HH; Deng, ZY; Xie, MY; Fu, ZH Isolering och rening av akteosid och isoakteosid från Plantago psyllium L. genom höghastighetsmotströmskromatografi. J. Chromatogr. 2005, 1063, 161–169. Molecules 2012, 17 8284

13. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Ito, Y. Preparativ isolering och rening av akteosid och 2'-acetylakteosid från Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck genom höghastighetsmotströmskromatografi. J. Chromatogr. 2001, 912, 181–185.

14. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Chen, FK; Ito, Y. Preparativ isolering och rening av fenyletanoidglykosider från extraktet av avföring från beaglehundar genom höghastighetsmotströmskromatografi. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2001, 24, 2187–2195.

15. Gao, SY; Feng, B.; Zhu, RN; Ma, JK; Wang, W. Preparativ isolering av tre antrakinoner från Rumex japonicus genom höghastighetsmotströmskromatografi. Molecules 2011, 16, 1201–1210.

16. Han, F.; Bai, YH; Wang, J.; Wei, J.; Yu, CY; Li, S.; Yang, WL; Han, CH Isolering och rening av Oridonin från hela växten av Isodon rubescens genom höghastighetsmotströmskromatografi. Molecules 2011, 16, 7949–7957.

17. Kobayashi, H.; Oguchi, H.; Takizawa, N.; Miyase, T.; Ueno, A.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Nya fenyletanoidglykosider från cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. I. Chem. Pharm. Tjur. 1987, 35, 3309-3314.

18. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Beståndsdelarna i cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolering och strukturer av en ny fenyletanoidglykosid och en ny neolignanglykosid. Chem. Pharm. Tjur. 1990, 38, 1927–1930.