Förebyggande effekter av fenyletanolglykosider från Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Abstrakt

Bakgrund:Cistanchetubulosaär en traditionell kinesisk örtmedicin som används ofta för att reglera immunitet.Fenyletanoildglykosider(CPhG) från denna anläggning är de främst effektiva materialen. Syftet med denna studie var att utvärdera de förebyggande och terapeutiska effekterna av CPhG på BSA-inducerad leverfibros hos råttor och relaterade molekylära mekanismer som involverar leverstjärnceller. Biejiarangan (BJRG), en annan traditionell kinesisk örtmedicin, användes som en positiv kontroll.

Metoder:I in vivo-experiment delades 75 SD-råttor slumpmässigt in i 6 grupper: normala (behandlade med destillerat vatten), modell (BSA-behandlade), positivt läkemedel (BSA-behandlade plus BJRG 600 mg/kg/dag) och BSA-behandlade plus CPhGs (125, 250 och 500 mg/kg/dag) grupper. Lever- och mjältindex, serumnivåer av aspartataminotransferas (AST), alaninaminotransferas (ALT), hexadekensyra (HA), laminin (LN), typ III prokollagen (PCIII), typ IV kollagen (IV-C), hydroxiprolin (Hyp) ), och transformerande tillväxtfaktor 1 (TGF- 1) mättes i råttlever. Histopatologiska grader för leverfibros utvärderades för varje grupp med hjälp av H&E och Massons trikromfärgning. Uttrycket av TGF- 1, kollagen I (Col-I) och kollagen III (Col-III) bestämdes med en immunhistokemisk färgningsmetod. Dessa effekter utvärderades ytterligare in vitro genom att bestämma expressionsnivåer av NF-KB p65 och Col-I genom kvantitativa realtids-PCR-analyser. Col-I-proteinuttryck undersöktes också genom western blotting.

Resultat: Alla dosgrupper (125, 250 och 500 mg/kg/dag) av CPhG minskade signifikant lever- och mjältindex, minskade ALT, AST, HA, LN , PCIII, IV-C serumnivåer, TGF- 1-innehåll (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" och="" p="">< 0.01),="" och="" hyp="" innehåll.="" cphgs="" lindrade="" också="" markant="" svullnaden="" av="" leverceller="" och="" förhindrade="" effektivt="" hepatocytnekros="" och="" inflammatorisk="" cellinfiltration.="" immunhistokemiska="" resultat="" visade="" att="" cphg="" signifikant="" minskade="" uttrycket="" av="" tgf="" -="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" och="" p="">< 0,01),="" col-i="" och="" col-iii.="" in="" vitro-effekterna="" av="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50="" och="" 25="" ug/ml)="" på="" hsc-t6="" visade="" att="" cphgs="" signifikant="" minskade="" mrna-uttrycket="" av="" nf-kb="" p65="" och="" col-i,="" och="" cphgs="" nedreglerade="" också="">

Slutsatser:CPhGs har en signifikant anti-hepatisk fibroseffekt och kan användas som hepatoskyddande medel för behandling av leverfibros.

Nyckelord:leverfibros,Cistanche tubulosa,Fenyletanoildglykosid,Chemokine BSA, förebyggande och terapi

FenyletanoildglykosidiCistanchetubulosa

Bakgrund

Leverfibros är ett sårläkningssvar på allvarlig leverskada som uppstår i patogenesen av kronisk kepatit inducerad av olika faktorer. Dessa faktorer är virusinfektion, alkoholmissbruk, kolestas och metaboliska och autoimmuna sjukdomar [1–3]. Progressiv ackumulering av extracellulär matris (ECM) och minskad ombyggnad stör leverns normala arkitektur, vilket resulterar i leverfibros [4]. Leverfibros är kritisk vid kronisk leversjukdom och utvecklas ofta till irreversibel cirros och karcinogenes. För närvarande finns det inga metoder eller effektiva läkemedel för behandling av leverfibros. Därför är det angeläget att hitta ett läkemedel mot leverfibros som kommer att dämpa utvecklingen av leverskada till fibros och cancer.

CistanchetubulosaW (av familjen Orobanchaceae) är en parasitisk växt som odlas allmänt i den södra regionen Xinjiang i Kina [5]. Människor brukar använda det för att stärka njurarna, ge näring till blodet, slappna av i tarmen och fördröja åldrandet. Det är officiellt listat i den kinesiska farmakopén [6].Cistanchetubulosainnehåller en mängd olika aktiva komponenter. Dessa inkluderarFenyletanoildglykosider(CPhGs), iridoider och polysackarider. Som en av många aktiva komponenter iCistanchetubulosa, CPhGshave uppvisade övertygande antioxidant-, anti-trötthets-, neuroprotektiva och antiinflammatoriska effekter i både in vivo- och in vitro-studier [7]. Under senare år har det rapporterats att CPhG har leverskyddande effekter. Potentiella mekanismer som ligger bakom dessa effekter är rensning av fria radikaler, skydd av levermembran, immunreglering, hämning av apoptos, hämning av uttrycket av HBsAg och HBeAg, och hämning av HBV DNA-replikation och andra [8-11]. Men få studier i litteraturen tar upp den antihepatiska fibroseffekten av GPhCs. Därför syftade denna studie till att undersöka den antihepatiska fibroseffekten av GPhCs genom att använda en modell av bovint serumalbumin (BSA) inducerad leverfibros hos råttor. Besläktade molekylära mekanismer undersöktes i HSC-T6-celler.

Metoder

Kemikalier och reagens

Ett Hydroxyproline-kit (Alkalisk hydrolys) (Lot:20140616) köptes från Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Kina). Rat TGF- 1 sandwichELISA-kit (parti: 238240615) köptes från Lianke Biotech Co., Ltd. (Kina). Rabbit Anti-CollagenI-antikropp (parti: 140619), Rabbit Anti-Collagen III-antikropp (parti: 980788 W) och Rabbit Anti-TGF- 1-antikropp (parti: 140619) tillhandahölls av Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Kina). Försedd med serum från normalfår (arbetsvätska) (parti: WP141214), PV-6000(parti: WK141225) och DAB-kit (parti: K136621D) köptes från Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Kina). Detektion av primära antikroppar utfördes genom att använda 2. Antikroppslösning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) och 2. Antikroppslösning (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mus) (parti: 272387) köpt från Invitrogen Company (USA) .

Bovint serumalbumin (BSA) (parti: SLBG8239V) köptes från Sigma (USA). Före användning bereddes BSA med 18 g/L i normal saltlösning, bakterierna avlägsnades genom filtrering och BSA lagrades vid 4 grader. Freunds ofullständiga adjuvans innehållande 1 g lipid från fårhår (parti: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Kina,) blandades med 2 g flytande paraffin (parti: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Kina), steriliserad i en ångautoklav och lagrad vid 4 grader. Det positiva läkemedlet BJRG erhölls som Biejiarangan-tabletter från Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Kina). BJRG-läkemedelsförråd framställdes genom att lösa upp BJRG-tabletter i destillerat vatten med en koncentration av 600 mg/kg.

Fenyletanoild glykosidiCistanchehar förebyggande effekter

Växtmaterial

Cistanche tubulosa(Orobanchaceae-familjen) köptes från Minfeng-regionen i Xinjiang i Kina. Materialet autentiserades av forskaren Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica i Xinjiang. Kupongprover deponerades i Institute of Materia Medica i Xinjiang.

Förberedelse av CPhGs

Torkade och skivade rhizomer avCistanchetubulosa(6,0 kg) extraherades i följd under återflöde tre gånger med 70 % etanol, och lösningsmedlet avlägsnades för att ge etanolextraktet. Etanolextrakt renades genom att använda AB-8-harts för att erhållafenyletanoidglykosider(CPhGs). Stamlösningar av CPhG som används för olika dosgrupper i djurstudier (500 mg/kg, 250 mg/kg respektive 125 mg/kg) löstes i 0,5 procent (5 g/L) karboximetylcellulosa ( natriumsalt).

Kvantifiering av CPhGs

Innehållet av två komponenter (echinakosid och akteosid) i CPhGs bestämdes med HPLC med hjälp av en tidigare rapporterad metod (Zhang et al. 2004)[12]. HPLC utfördes genom att använda en Shimadzu LC-10AHPLC utrustad med en UV-detektor. HPLC-kolonnen var en Phenomenex Gemini ODS-kolonn (250 × 4,6 mm, 5 μm). Den isokratiska mobila fasen bestod av metanol-acetonitril-1 procent ättiksyra (15:10:75, v/v/v). Elueringen var under 40 minuter och flödeshastigheten hölls vid 0,6 ml/min. Kolonntemperaturen hölls konstant vid 30 grader. UV-detektion var vid 334 nm.

Djur och HSC-T6-cellinje

[Grade SPF] friska vuxna Sprague–Dawley (SD)råttor av hankön (180–220 g) köptes från Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, licensnr: SCXK (New)2011–0004. Råttor matades med specifik patogenfri (SPF)-mat. Alla procedurer relaterade till djurexperimenten godkändes av Animal Ethics Committee of First Affiliated Hospital vid Xinjiang Medical University. Råttor hölls i burar under kontrollerade miljöförhållanden (25 grader och en 12 timmars ljus/mörker-cykel) och hade fri tillgång till standardfoder för råttpellets och kranvatten. Råttor acklimatiserades före behandling.

En odödlig leverstjärncellinje från råtta, HSC-T6, erhölls från Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, Kina). HSC-T6-celler odlades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM, Peking, Kina) kompletterat med 10 procent fetalbovint serum (Gibco, Sydamerika), 100 IE/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin (Peking, Kina) ) i avfuktad inkubator vid 37 grader med 5 procent CO2.

BSA-inducerad leverskada och behandlingar

Sjuttiofem SD-råttor delades slumpmässigt in i sex grupper: Normal (behandlad med destillerat vatten), modell (BSA-behandlad), positivt läkemedel (BSA-behandlad plus BJRG 600 mg/kg/dag) , och BSA-behandlade plus CPhG-grupper (125, 250, 500 mg/kg/dag). BSA-behandlade plus CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dag) grupper hade 13 råttor i varje grupp, och den andra gruppen hade 12 råttor i varje grupp. Den BSA-inducerade leverskadamodellen är uppdelad i primär sensibilisering följt av en immunologisk attack) [13]. Förutom den normala gruppen, fick de andra grupperna flera subkutana injektioner med 0,5 ml (9 mg/ml) BSAfreunds ofullständiga adjuvans på dag 1, dag 15, dag 22, dag 29 och dag 36 för primär sensibilisering. Sju dagar efter den femte injektionen erhölls blod genom plexus ratretinal ven och testades för serumalbuminantikroppar. BSA-antikropp i råttserum detekterades med en dubbel agar-diffusionsmetod. Attackinjektionen utfördes genom att administrera 0,4 ml BSA i normal saltlösning genom kaudalvenen i BSA-antikroppspositiva råttor två gånger i veckan under tio gånger. Koncentrationerna och tiderna för injektioner var 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 och 10.00 g/L dag 46 , dag 50, dag 53, dag 57, dag 60, dag 64, dag 67, dag 71, dag 74 respektive dag 78. I den normala gruppen användes normal saltlösning för immunologiska primära (sensibilisering) och sekundära (attack) injektioner istället för BSA, och andra tillstånd var desamma som i modellgruppen.

Den normala gruppen fick oralt destillerat vatten med en dos på 10 ml/kg/dag. Modellgruppen administrerades oralt 10 ml/kg/dag 0,5 procent CMC-Na-lösning. Den positiva läkemedelsgruppen administrerades oralt 600 mg/kg/dag BJRG. De BSA-behandlade plus CPhG-grupperna (125 250 och 500 mg/kg/dag) gavs oralt 125, 250 respektive 500 mg/kg/dag CPhGs. Daglig dosering till råttor fortsatte i två veckor efter den sista injektionen.

Efter experimentperioden fastade råttor i 12 timmar före 10 procent kloralhydrat och avlivades sedan omedelbart. Serumprover uppsamlades från varje råtta som användes omedelbart. Lever skördades för två ändamål: (1) konservering i flytande kväve för Hyp-kit och (2) fixering i 10 procent formaldehyd för histologiska och immunhistokemiska undersökningar. Hela varaktigheten av djurstudierna var 93 dagar.

Fenyletanoild glykosidiCistanchehar förebyggande effekter

Lever- och mjältindex

Levern och mjälten dissekerades med laparotomi och tvättades med 4 grader normal koksaltlösning. Efter att ha absorberat överflödigt vatten med filterpapper vägdes levern och mjälten för att beräkna motsvarande index: Relativ organvikt=organmassa (g)/individuell kroppsvikt (g) × 100 procent [14].

Analys av markörer för leverfibros

Den skyddande effekten av CPhG mot BSA-inducerad leverskada utvärderades genom att mäta ALT och AST (Mind ray automatic biochemical analyzer, A086A0182). Utvecklingen av leverfibros och effekterna av behandlingen bestämdes genom att undersöka HA, LN, PC III och IV-C (kemiluminescensanalysator, TaiGeKeXin, MP2808).

Hypt innehåll och TGF- 1-analys

Nivån av Hyp i levervävnad bestämdes med en spektrofotometrisk metod enligt satsens instruktioner. Nivån av Hyp uttrycktes som Hyp (ug)/protein (mg). Hyp (ug/mg)=(Mätt OD - blank OD)/(standard OD blank OD)×5 (ug/ml) × 10/våtvävnadsvikt (ml/mg). Den hepatiska koncentrationen av TGF- 1 detekterades genom att använda ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner. Den hämmande effekten av CPhG på fibros bekräftades av uttrycksnivåerna av TGF- 1.

Histopatologisk undersökning

Levervävnaden i samma del av den vänstra loben skars bort och fixerades i 10 procents formaldehydlösning. Vävnader färgades med konventionell H&E och Masson'strichrome-färgning för att observera histopatologiska förändringar under ett ljusmikroskop. Uttryck av kollagen typ I, kollagen typ III och TGF - 1 i levervävnader analyserades genom immunhistokemisk färgning [15].

Semi-kvantitativ immunhistokemi utfördes enligt rapporterade metoder [16, 17]. Följande klassificeringar användes för TGF- 1-positiva celler: "-" indikerar nästan inget uttryck, 20=l; " plus " indikerar positiva celler individuellt samlade i lesionområdet, 21=2; " plus plus " indikerar positiva celler i små grupper samlade runt lesionsområdet, 22=4; " plus plus plus " indikerar dispergerade positiva celler uttryckta som 23=8. Resultaten representerar en hierarkisk integration. Kollagen typ I och kollagen typ III kromogen grad och omfattning omvandlades till CRI för statistisk analys (kromogen grad × kromogent område). Den kromogena graden är uppdelad i svag "plus", måttlig "plus plus", och stark "plus plus plus". Det kromogena området är uppdelat i " plus ", dess kromogena område < vy="" 1/4;="" "="" plus="" plus="" ",="" dess="" kromogena="" synområde/4-2/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" ",="" dess="" kromogena="" synområde="" 2/4-3/4;="" "="" plus="" plus="" plus="" plus="" ",="" dess="" kromogena="" intervall=""> 3/4. Blindedscoring utfördes av två personer där " plus " är 1; " plus plus "är 2, " plus plus plus " är 3 och " plus plus plus plus " är 4. Tre observationsfält för mikroskop (förstoring × 200) valdes slumpmässigt ut för varje sektion, med medelnivån för proverna som en semikvantitativ nivå.

Cellexperiment

HSC-T6-celler ströks ut i en 96-brunnsplatta. Initialt odlades celler med DMEM innehållande 10 procent FBS i 48 timmar. Mediet ersattes sedan med DMEM utan FBS för att svälta cellerna i 12 timmar. Cellerna odlades sedan med DMEM som innehöll 5,0 ng/mLTGF - 1 (utan FBS) under 24 timmar. Slutligen, olika koncentrationer av CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml och 25 ug/ml), akteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml och 1,5 ug/ml), andechinakosid (500 ug/ml, 250 ug/ml, och 125 ug/ml) utfördes i plattan i fyrdubbla brunnar och inkuberades i 48 timmar.

PCR-analys i realtid

mRNA-expressionsnivån för NF-KB, p65 och kollagenI bestämdes genom realtids-PCR. För att bestämma mRNA-uttryck i HSC-T6-celler såddes cellerna (4 × 105 celler) i plattor med sex brunnar med 3 mL DMEM med 10 procent FBS och inkuberades över natten vid 37 grader och 5 procent CO2, varefter cellodlingsmedia byttes toserumfritt DMEM. Därefter CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml och 25 ug/ml), acteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml och 1,5 ug/ml) och echinakosid (500 ug/ml, 250 ug) 125 ug/ml) sattes till brunnarna. Efter 48 timmars inkubation med CPhGs eller monomera kompositioner extraherades totalt RNA med TRIzol-reagens (Invitrogen, USA) och omrördes kraftigt med kloroform i 15 s. Efter att ha stått i rumstemperatur i 3 minuter centrifugerades lysatet vid 12, 000 x g i 15 minuter vid 4 grader. RNA i vattenfasen fälldes ut med isopropanol och den övre vattenfasen överfördes till ett nytt mikrocentrifugrör. RNA fälldes ut genom att tillsätta 0,75 procent etanol, varefter mikrocentrifugröret och centrifugerades vid 12, 000 x g vid 4 grader i högst 5 minuter. Supernatanten avlägsnades och RNA:t torkades vid rumstemperatur i 5–10 minuter. Specifika uppsättningar av primrar (Sangon, Shanghai, Kina) som användes för amplifiering av rått-aktin [GenBank: NM_031144.3], Kollagen I [GenBank: NM_ 053304.1] och NF- κB p65[GenBank: NM_199267.2]-gener designades med hjälp av Batch Primer 3. De framåtriktade (FW) och omvända (RV)-primrarna var enligt följande: Kollagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-KB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -aktin (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Resultaten normaliserades till mRNA från housekeepinggenen -aktin som en intern kontroll och presenteras som relativa mRNA-nivåer

Reaktioner utfördes med 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL 10 pM primerpar, 8,5 μL destillerat vatten och 2,5 μL cDNA. Varje polymeraskedjereaktion utfördes under följande förhållanden: 95 grader i 3 minuter, sedan 40 cykler på 10 s vid 95 grader, 30 s vid 55 grader och 10 s vid 55 grader – 95 grader för förlängning, följt av enkelfluorescensmätning. De slutliga resultaten beskrevs med de relativa värdena (2-ΔΔCt). Beräkning och analys utfördes av iQ5 Real-Time PCR Detection System.

Western blot-analys

Kollagen I (Abcam, Cambridge, Storbritannien, artnr: ab34710)proteinexpressionsnivåer bestämdes genom Westernblotting [med -aktin (parti: 60008-1-lg; Proteintech, Kina) som en hushållskontroll. Helcellsextrakt framställdes med användning av Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Thermo Scientific, USA) buffert med 1 procent Haltproteashämmare cocktail (Thermo Scientific, USA) och 1 procent Halt fosfatas inhibitor cocktails (Thermo Scientific, USA). Proteinkoncentrationen mättes och kvantifierades med Bradford-metoden [18]. Protein (10–50 ug) separerades på en 10 procent SDS-PAGE gel och överfördes till PVDF-membran (Millipore, USA). Membran blockerades i 1 timme vid rumstemperatur med 5 procent BSA och de primära antikropparna (Anti-Collagen I) antikropp, 1:200 spädning eller mus-mAb av -aktin, 1:5000 spädning) inkuberades vid 4 grader över natten. Motsvarande Alk-Phos. konjugerade sekundära antikroppar inkuberades vid rumstemperatur. Slutligen tvättades membranen tre gånger med 1 × Tris-HClsaline med 0,1 procent Tween 20, och signaler skannades och visualiserades av GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Densitometrisk analys utfördes på proteinerna av intresse och normaliserades till -aktin med programvaran GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -aktin användes som intern kontroll.

Statistisk analys

Shapiro-Wilks normalitetsteste och Levenes varianshomogenitetstest användes för att verifiera normalitet och varianshomogenitet. Variansanalys (ANOVA) följt av Tukeys post hoc-test användes för att identifiera statistiska skillnader inhomogena, normalfördelade data. Kruskal-Wallis icke-parametriska test användes för att analysera data som inte är normalfördelade eller homogena. Resultaten uttrycktes som medelvärde ± SD. Signifikansen sattes till P < 0.05.="" alla="" data="" analyserades="" med="" spss="" 16.0-programvara="" (xinjiang="" medical="">

Resultat

Kvantitativ bestämning av CPhGsCPhGs iCistanchetubulosainnehåller tvåFenyletanoildglykosider, echinakosid och acteosid, och deras innehåll i CPhGs bestämdes genom HPLC-analys (fig. 1) till 42,71 ± 0,42 procent respektive 14,27 ± 0,18 procent.

Lever- och mjältindex

Som tabell 1 visades var lever- och mjältindexen för modellgruppen signifikant förhöjda [P < 0.01,p="">< 0,05].="" lever-="" och="" mjältindexen="" för="" det="" positiva="" läkemedlet="" bjrg="" och="" cphg="" vid="" olika="" dosgrupper="" reducerades="" signifikant="" jämfört="" med="" modellgruppen="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024,PSpleen=0.070," respektive].="" lever-="" och="" mjältindexen="" var="" lägre="" än="" för="">

Effekter av CPhG på ALAT, AST-aktiviteter och leverfibrosmarkörer

I den aktuella studien ökade serumnivåerna av leverenzymerna AST och ALT signifikant i modellgruppen, vilket återspeglar hepatocellulär skada hos BSA-inducerade leverfibrosråttor. Experimenten visade dock att behandling med BJRG (600 mg/kg) och CPhGs (125, 250 och 500 mg/kg) minskade signifikant AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" respektive]="" och="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," respektive]="" nivåer="" i="" leverfibrosrater.="" (tabell="">

Nivåerna av HA, LN, PC och IV-C i modellråttor ökade signifikant [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001,="" respektive].="" jämfört="" med="" modellgruppen,="" nivåerna="" av="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respektive],="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respektive],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respektive]="" och="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001="" respektive="" p="" iv-c="">< 0,001]="" hos="" råttor="" minskade="" markant="" av="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" och="" cphg="" vid="" olika="" dosgrupper="" (125,="" 250="" och="" 500="" mg/kg)="" )="" (tabell="">

Hypt innehåll och TGF- 1

Kollagenhalten upptäcktes också genom att mäta Hyplevels i levervävnad. Som visas i tabell 4 var medelhyp-nivån i modellgruppen signifikant högre än den normala gruppen, men den minskade markant i BJRG-gruppen och de olika CPhG-dosgrupperna.

Leverkoncentrationen av TGF{{0}} i modellgruppen hos råttor ökade signifikant [P < 0.001].="" jämfört="" med="" modellgruppen,="" tgf-="" 1-nivåer="" av="" det="" positiva="" läkemedlet="" och="" de="" olika="" cphg-dosgrupperna="" minskade="" markant="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respektive].="" resultaten="" sammanfattas="" i="" tabell="">

Histopatologisk undersökning

Observationer av normala levervävnadssnitt färgade med H&E och Massons trikrom uppvisar distinkta hepatiklobuler och hepatiska sinusoider. Levervävnadsstrukturen hos modellråttorna var störd, och levervävnaden och leversinusoiderna ersattes av en stor mängd bindväv. Men mer normal cytoarkitektur och mindre bindväv upptäcktes i behandlingsgruppen än de i modellgruppen.

H&E-färgning

I den normala gruppen observerades leverlobers strukturella integritet utan onormala portalområden och leversinusoider. Leversträngarna var ordnade på ett ordnat sätt, med kärnan rund och klar. Kärnorna är placerade i mitten av cellen, med riklig cytoplasma. Endast portalområdet har en liten mängd fibrös vävnad (Fig. 2a).

I modellgruppen var den lobulära strukturen allvarligt skadad. Leverceller visade mild vattnig degeneration, mestadels ballongdegeneration och/eller fettdegeneration. Bildandet av inflammatorisk cellinfiltration, omfattande fibrös vävnadshyperplasi, bildandet av ett stort antal av det fibrösa skiljeväggen, delade lobuli och betydande levercellsproliferation observerades också. leverfibros (fig. 2b).

Jämfört med modellgruppen var det en minskning av inflammatorisk cellinfiltration i de olika CPhGs. Dessutom observerades mindre nekros och fettdegeneration av leverceller samt lindring av fibros. CPhG mildrade signifikant patologin av BSA-inducerad leverfibros hos råttor, lindrade svullnaden av leverceller och förhindrade effektivt hepatocytnekros och inflammatorisk cellinfiltration, vilket tyder på att CPhGsexutövar en skyddande effekt på BSA-inducerad leverfibros från råtta. (Fig. 2c–f ).

Massons trikromfärgning

I normalgruppen var levervävnaden normal. Det hepatiska portalområdet visade ett litet antal blåkollagenfibrer och levervävnaden var normalt strukturerad (Fig. 3a). Jämfört med levervävnaden i den normala gruppen, prolifererade fibrös vävnad av den centrala broschyren och expanderade till leverparenkymet. Kollagenfibrer sträckte sig och förenade och omslöt hela lobulen och omgav den centrala venen. Dessa effekter, tillsammans med hepatocytfibros, lobulär strukturell skada, periportal fibros och pseudolobulebildning (Fig. 3b) gav bevis för att modellen etablerades.

Jämfört med modellgruppen sträcktes kollagenfibrerna i den positiva läkemedelskontrollgruppen milt utåt från det perifera portalområdet (Fig. 3c). Jämfört med modellgruppen reducerades kollagenfibrerna i de olika CPhG-dosgrupperna signifikant, fiberproliferationen hämmades och proliferationen av fibrös vävnad inom leverparenkymet minskade signifikant. Dessa resultat antydde att CPhGs skyddade råttor från BSA-inducerad leverfibros (Fig. 3d-f).

Immunhistokemisk färgning

Viktigt är att uttrycket av kollagen typ I och kollagen typ III spelar viktiga roller i utvecklingen av leverfibros, och deras generering och avsättning i levervävnaden kan tjäna som en viktig bestämningsfaktor för effektiviteten mot leverfibros. Resultaten sammanfattas i tabell 5.

Kollagen typ I

Den normala gruppen uttryckte kollagen typ I huvudsakligen i blodkärlen och portalområdet. Modellgruppen höguttryckt kollagen typ I vaskulär fibros i portalområden. I utrymmet för Disse observerades kollagen typ I-färgning som en strimma eller som en fläckig fördelning. Kollagen innesluten fibroussepta för att bilda pseudolobule. I dessa experiment bildades färre fibrösa septa för BJRJ (600 mg/kg) och olika dosgrupper av CPhGs (125, 250 och 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023, respektive PCol I=0.044]. De semikvantitativa resultaten avslöjade att uttrycket av deras kollagen typ I var signifikant lägre jämfört med modellgruppen (Fig. 4).

Kollagen typ III

Kollagen typ III uttrycktes svagt i normalgruppen, och perifera områden som omger portalen och levervenerna visade en liten mängd fina gula istället för kontinuerliga fibrer (fig. 5a). I modellgruppen uppvisade kollagenfibrer breda och tjocka trådar, vilket tyder på starkt uttryck, huvudsakligen belägna i portalen och fibrösa vävnadsområden (fig. 5b).

Kollagenfibrer av BJRJ (600 mg/kg) och olika dosgrupper av CPhGs (125, 250 och 500 mg/kg) var filamentösa och fördelade runt de centrala venerna och portalområdena. Jämfört med modellgruppen reducerades kollagenfibrerna signifikant, färgningen var blek och tunn och immunhistokemisk färgning var svagt positiv (Fig. 5c-f). Dessa semikvantitativa resultat visar att de positivt uttryckta cellerna i de positiva och olika dosgrupperna [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 och PCol III=0.037, respektive] skilde sig från dem i modellgruppen.

TGF- 1

Det var lite uttryck av TGIF- 1 i normala råttleverceller. Uttrycket var begränsat till ett litet antal interstitialceller (Fig. 6a). I modellgruppen var TGF- 1-uttrycket brett distribuerat i portalområdet, fibrösa utrymmen, leverstjärnceller, inflammatoriska celler, sinusväggen och cytoplasman. Ett särskilt portalområde uppvisade ett starkt positivt uttryck med brungul färgning (Fig. 6b)

Det fanns en liten mängd uttryck i portalområdet och fibrösa septa av BJRJ (600 mg/kg) och olika dosgrupper av CPhGs (125, 250 och 500 mg/kg). Omfattningen av positiv färgning i dessa grupper minskade signifikant jämfört med modellgruppen. Färgning i de interstitiella cellerna i de fibrösa septa och cytoplasman hos inflammatoriska celler minskade (Fig. 6c-f). Semikvantitativa resultat visade att BJRJ och olika dosgrupper av CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" respektive]="" var="" signifikanta="" jämfört="" med="">

Som nämnts tidigare i artikeln är TGF- 1 ett viktigt cytokin i patofysiologin för leverfibros, vilket stimulerar produktionen av extracellulär matris [19]. Vi visade att nivån av TGF- 1 ökade i modellgruppen på ett sätt som överensstämmer med svårighetsgraden av leverfibros. Expressionsnivåerna av TGF- 1 i levern överensstämde med serumTGF- 1-nivåer. Detta indikerar att CPhGs avsevärt kan minska leverfibros på grund av TGF- 1-uttryck genom att delta i syntesen och nedbrytningen av ECM.

Uttrycket av kollagen typ I, kollagen typ III och TGF- 1 kan detektera den patologiska processen av leverfibros. Deras uttrycksnivåer i behandlingsgrupperna minskade avsevärt och illustrerade att CPhGs kan förbättra kollagenasaktiviteten, upprätthålla den dynamiska jämvikten för lever-ECM-syntes och nedbrytning, och därmed försena och förhindra bildandet av leverfibros.

NF-KB p65 och kollagen I uttryck efter läkemedelsintervention i HSC-T6-celler

För att karakterisera signaler om leverfibros bestämdes två regulatoriska nyckelgener i levern via RT-PCR-analys. Data visade att tHSC-T6-celler från kontrollgruppen hade lägre nivåer av NF KB och kollagen typ I mRNA. Omvänt inducerade TGF- 1 HSC-T6-celler att markant uppreglera NF-KB (P < 0.01)="" och="" col-i="" (p="">< 0,01)="" mrna,="" med="" nivåer="" högre="" än="" de="" i="" kontrollgruppen.="" i="" närvaro="" av="" olika="" koncentrationer="" av="" cphgs,="" resultaten="" av="" nf-kb="" p65="" [p="" nf-kb="0.001" för="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-kb="0.002" för="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-kb="0.007" för="" 50="" ug/ml,="" respektive="" p="" nf-kb="0.012" för="" 25="" ug/ml]="" och="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respektive]="" visade="" reducerade="" uttryck="" av="" dessa="" mrna="" (="" fig.="">

Western blot-analys av kollagen I-nivå efter läkemedelsintervention i HSC-T6-celler

Figur 8 visar kollagen I-proteinexpressionsnivåerna i HSC-T6-celler i de olika experimentgrupperna. Kollagen I-proteinexpressionsnivån minskade signifikant i de olika dosgrupperna av CPhGs (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, och 25 ug/ml) jämfört med TGF- 1-gruppen.

Diskussion

CPhGs är en fenyletanoidglykosid isolerad och renad från rhizom Cistanche, som används som traditionell kinesisk örtmedicin. Under de senaste åren har CPhGshad visat sig ha en kraftfull förmåga att förebygga leverskador [20]. Därför syftade vi till att undersöka om CPhG har hämmande effekter på hepatitfibros av BSA-inducerad leverfibros hos råttor. BJRG används ofta som ett terapeutiskt läkemedel för leverfibros i Kina. Den är gjord av sköldpaddsskal. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, etc. har effekterna att fylla på Qi och blod, lindra trötthet, mjukgöra noder. Dessutom visar tidigare studier att det har den uppenbara funktionen att blockera tidig leverfibros, hämma spridningen av fettlagrande celler och minska kollagensyntesen [21]. Därför användes BJRG som ett positivt läkemedel i denna studie.

De patologiska förändringarna av leverfibros hos råttor inducerade av BSA-injektioner liknar dem i humanportal cirrhos [22]. CPhGs lindrade dosberoende graden av leverfibros och hämmade HSC-transformation till myofibroblastliknande celler, minskade de förhöjda nivåerna av serum ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 och leverindexet och undertryckte markant uttrycket av kollagen I, kollagen III och TGF- 1 i levervävnad.

Stadierna av leverfibros är korrelerade med dessa rumnivåer av HA, LN och IV-C, vilka som markörer kan spela en roll för att upptäcka graden av leverfibros [23]. Det har rapporterats att HA är huvudresursen i den extracellulära matrisen. IV-C som det väsentliga elementet i basalmembranet kommer att syntetiseras rikligt och deponeras kraftigt i de tidigare faserna av levercirrhos. Serumnivåerna av LN och IV-C är index för basalmembranets omsättningshastighet och visar graden av fibros i portalområdet och sinusformade kapillärer [24]. PC III är en markör vid diagnos av leverfibros och tidig cirros, men dess sensitivitet och specificitet är inte hög, och det finns ingen signifikant skillnad mellan de olika stadierna av offibros i många referenser [24, 25]. Denna studie fick ett liknande resultat.

Dessutom uppvisar H&E och Massons trikromfärgade sektionsobservationer normala levervävnader med distinkta leverlobuli och leversinusoider. Levervävnadens struktur i modellgruppen var störd, och levervävnaden och leverns sinusoid ersattes av en stor mängd bindväv. Emellertid observerades signifikant förbättring i behandlingsgrupperna jämfört med modellgruppen.

Viktigt är att uttryck av kollagen typ I och kollagen typ III spelar viktiga roller i utvecklingen av leverfibros, vars blockering kan förhindra och behandla leverfibros. Därför kan genereringen och avsättningen i levervävnaden av kollagen typ I och kollagen typ III tjäna som en viktig bestämningsfaktor för antihepatisk fibroseffektivitet. TGF- 1 är också ett viktigt profibrogent cytokin vid leverskada och det är biologiskt aktivt med flera farmakologiska effekter[26]. En balans mellan dessa åtgärder krävs för att upprätthålla vävnadshomeostas. Det avvikande uttrycket av TGF 1 är involverat i patogenesen av leversjukdomar [27, 28]. Det är känt att TGF- 1 är en avgörande cytokin som är involverad i de tidiga stadierna av leverfibros. Oxidativ stress utlöser TGF- 1, vilket resulterar i att det senare stimulerar ECM-produktion och avsättning [29]. Därför är en av de effektiva strategierna för att producera läkemedel mot hepatisk fibros att identifiera anti-TGF- 1-medel. Immunhistokemisk analys visade att uttrycken av kollagen typ I, kollagen typ III och TGF- 1 kunde detektera den patologiska processen av leverfibros. Uttrycken av kollagentyp I, kollagen typ III och TGF- 1 i behandlingsgrupperna är minskade, vilka var signifikant lägre i särskilt högdosbehandlingsgruppen CPhGs, och antydde att CPhGs är ett effektivt kollagen typ I, kollagen typ III , och TGF- 1-hämmare. Förmodligen kan CPhG förbättra kollagenasaktiviteten, upprätthålla den dynamiska jämvikten för ECM-syntes och nedbrytning, vilket fördröjer och förhindrar bildandet av leverfibros.

CPhG kan inte bara förbättra BSA-inducerad leverfibros hos råttor utan kan också vara associerad med att hämma aktiveringen av HSC in vitro. HSC-aktivering anses representera det avgörande steget i fibrogenes. I denna studie illustrerade resultaten att administrering av CPhGs från 25 till 100 ug/ml anmärkningsvärt försvagade det minskade NF-KB p65, kollagen I-mRNA-uttrycket och kollagen I-proteinuttrycket i HSC.

NF-KB spelar en viktig roll för att modulera immunsvaret på infektion eller stimuli [30]. Uppbyggnaden av NF-KB i leverceller kan resultera i rekrytering av inflammatoriska cytokiner/mediatorer, vilket inducerar fibrosutveckling [31, 32]. Dessutom är kollagen också ett känsligt index som återspeglar fibrosnivån och står för cirka 50 procent av det totala proteinet i den fibrösa levern [33]. Som ett resultat postulerade vi att den molekylära mekanismen mot leverfibros är kopplad till CPhGs-medierad inaktivering av NF-KB-uttryck, där fördelen bidrar till synergistiska roller för att försvaga immuntoxicitet och inflammationsstress i BSA-skadad levervävnad, vilket ytterligare korrigerar dysmetabolism i levervävnaden.

Slutsatser

Sammanfattningsvis indikerar våra studier att CPhG signifikant dämpar omfattningen av leverfibros inducerad av BSA hos råttor. Dess mekanism kan åtminstone delvis bero på den hämmande effekten av CPhG på sammansättningen av ECM och stimulering av nedbrytningen av ECM, och/eller genom direkt hämning av syntesen av kollagen typ I, kollagen typ III och uttrycket av TGF{{0 }}. Därför förväntade vi oss att CPhGs kan användas i hälsovårdsprodukter eller i kliniska mediciner för att förebygga human leverfibros. Framtida studier krävs för att fastställa effektiviteten av CPhGs som ett potent läkemedel mot hepaticfibros.

Förkortningar

CPhG: anolglykosider från cistanche;

BSA: Bovint serumalbumin;

HSC-T6: Hepatiska stellatceller;

Hyp: Hydroxiprolin;

BJRG: CompoundBiejiarangan tabletter;

TGF- 1: Transformerande tillväxtfaktor 1;

ALT: alaninaminotransferas;

AST: Aspartataminotransferas;

HA: Hyaluronsyra;

LN: laminin; PC III: Typ III prokollagen;

IV-C: Typ IV kollagen;

NF-KB: Kärnfaktor kappa-lättkedjeförstärkare av aktiverade B-celler;

RT-PCR: omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion;

SDS-SIDA: Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores.

Konkurrerande intressen

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen

Författarnas bidrag

TL, JZ, SPY, LM, MT och SLZ skapade och designade experimenten. SPY, TL och JZ analyserade data. SPY och JZ skrev manuskriptet. TL,LM och JZ granskade manuskriptet. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Bekräftelse

Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundationof China (81260624). Författarna vill uttrycka sitt uppriktiga tack till professor Tao Liu för hans föreslagna förbättringar för att skriva detta dokument.

Författarinformation

1Institutionen för toxikologi, School of Public Health, Xinjiang MedicalUniversity, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Kina. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of MateriaMedica i Xinjiang, Urumqi 830004, Kina. 3Nr. 140 Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi 830000Xinjiang Uyghur autonoma region, Kina.

Klicka här för att kontrolleraCistanchetubulosaProdukter

Referenser
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Nuvarande status för nya antifibrotiska terapier hos patienter med kronisk leversjukdom. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Leverstjärnceller och leverfibros. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogenes av leverfibros. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Översynsartikel: reversibiliteten av cirros. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. Kinesiska vetenskapsakademin. 23:e uppl. Kina: Redaktionskommitté för Flora of China; 2013. sid. 1–16.
6. Kinesisk farmakopékommission vid Folkrepubliken Kinas sanitära ministerium. Kinesisk farmakopé, del 1. Kina: Chemical Industry Publishing House; 2010. sid. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Forskning framsteg avfenyletanoidglykosiderfrånCistanchetubulosa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Effekt av Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) på reproduktionstoxicitet hos möss inducerad av glykosid av Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H, et al. ACE och trombocytaggregationshämmare från Tamarix hohenackeri Bunge (värdväxt förHerbaCistancher) växer i Xinjiang. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P, et al. Förbättring av dextransulfatnatrium-inducerad kolit hos möss genom echinakosid-berikat extrakt avCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches stimulerar cellulär glutationredox-cykling av reaktiva syrearter som genereras från mitokondriell andning i H9c2-kardiomyocyter. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: En RP-HPLC-metod för samtidig bestämning av echinakosid och acteosid i Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Studien av djurmodellen för immunitetsleverfibros inducerad av bovint serumalbumin. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Effekt av Cichorium glandulosum-extrakt på CCl4-inducerad leverfibros. Iran Röda Halvmånen Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF, et al. Clerodane diterpenoider och prenylerade flavonoider från Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Korrelation av NF-KB och patologisk stadieindelning av leverfibros hos patienter med kronisk hepatit B. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Effekter av totala saponiner av Panax notoginseng mot leverfibros hos råttor. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiär. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Jämförelse av kolorimetriska analyser med kvantitativ aminosyraanalys för proteinkvantifiering av generaliserade moduler för membranantigener (GMMA). Mol Biotechnol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Framsteg när det gäller att förstå rollen av transformerande tillväxtfaktor- 1 i patogenesen av leverfibros. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, et al. Skyddande effekt av akteosid på immunologisk leverskada inducerad av Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolysackarid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Effekter av Fufang Biejia Ruangan-piller på leverfibros in vivo och in vitro. World J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Rollen av att transformera tillväxtfaktor 1 och dess receptor i immunologiskt inducerad leverfibrogenes hos råttor och effekten av cordyceps polysackarid på dem. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Förhållandet mellan iscensättningen av leverfibros och nivåerna av serumbiokemi. HBPD INT. 2002;1:246–8.Du et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Sida 12 av 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Serumfibrosmarkörer vid diagnos av leverfibros. HakaJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP, et al. En preliminär studie av kombinationen av icke-invasiva parametrar vid diagnos av leverfibros. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Sambandet mellan TGF- 1, PDGF-BB, CTGF och kronisk hepatit B med fibros. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Boswellia serrata och Salvia miltiorrhiza-extrakt minskar DMN-inducerad leverfibros hos möss genom TGF-beta1-nedreglering. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY, et al. Effekten av Gypenosider på TGF- 1/Smad-vägen vid leverfibros inducerad av koltetraklorid hos råttor. Praktikant J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Skydd genom en antioxidantmekanism av berberin mot råttleverfibros inducerad av flera hepatotoxiska faktorer. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Den nukleära faktor kappa B-signalvägen: integrera metabolism med inflammation. Trender Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-KB i leverbindande skada, fibros och hepatocellulärt karcinom. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Toll-liknande receptorer vid leversjukdom. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Kosttillskott av blåbärsjuice ökar leverns uttryck av metallothionein och dämpar leverfibros hos råttor. PLoS One. 2013;8, e58659.