Proteasaktiverad receptor 1 bidrar till mikrocirkulationsfel och tubulär skada i njurischemi-reperfusionsskada hos möss

Yu Guan,¹Daisuke Nakano,²Lei Li,³Haofeng Zheng,³Akira Nishiyama,²Du Tian,¹och Lei Zhang¹

att lindra faktiska misslyckanden medcistanche ört

1. Introduktion

Denjurekan inte undvika ischemi-reperfusion (IR) skada under partiell nefrektomi ochnjuretransplantation [1], vilket är känt för att resultera i kvarhållande av metabola avfallsprodukter och leda till akutnjureskada (AKI) ochAKI-kronisknjuresjukdom (AKI-CKD) [2]. Hittills finns ingen specifik läkemedelsbehandling kliniskt tillgänglig för AKI och AKI-CKD [3]. Flera vanliga patologiska förändringar förekommer i AKI, såsom mikrocirkulationssvikt [4], inklusive trängsel och blödning, och akut tubulär nekros [5]. Därför har studier fokuserat på att rikta in sig på dessa patologiska förändringar som potentiella terapeutiska kandidater. Vi har tidigare visat att bibehålla de peritubulära kapillärerna efternjur-IR-skada minskade kapillärstockning och förbättrade AKI till CKD-övergången [6]. Akut tubulär nekros kan vara svår att behandla; således kan regenerering av tubuli genom tubulär cellproliferation vara ett viktigt tillvägagångssätt för att förhindra ytterligare förlust av njurfunktion [7].

Proteasaktiverad receptor-1 (PAR-1) tillhör familjen proteasaktiverade receptorer (PAR) och är känd för att stimuleras av trombin för att inducera trombocytkoagulation. Vi visade nyligen att PAR-1 bidrog till utvecklingen av akut inducerad glomerulär skada [8]. Dessutom rapporterades trombin/PAR-1 spela en roll i epitelcellsproliferation och apoptos. Baserat på dessa egenskaper antog vi att PAR-1 accelererade AKI-allvarligheten genom att reglera antingen peritubulär kapillär blodkoagulation eller tubulär regenerering. I den här studien undersökte vi rollen av PAR-1 genom att använda Q-94, en PAR-1-selektiv negativ allosterisk modulator, i en musnjur-IR-skademodell och trombinstimulerade odlade humana tubulära celler.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

2. Material och metoder

2.1. Akut njure IR-musmodell.

Alla djurförsök utfördes enligt den institutionella djurvårds- och användningskommitténs experimentella riktlinjer från Capital Medical University. DenjureIR-musmodell etablerades som tidigare beskrivits [8]. Kortfattat bedövades 8-veckogamla C57/BL6-hanmöss genom injektion av pentobarbitalnatrium (50 mg/kg; ip) och delades slumpmässigt in i följande grupper: sham, I/R plus vehikel och I/R (vehikel: saltlösning 10 mg/kg iv) plus Q94 (en PAR-1-antagonist vid 10 mg/kg iv) grupper (n=7–8 i varje grupp). För det renala varma IR-skadaprotokollet genomgick mössen uninefrektomi för att utvärdera skadan på njurfunktionen; efter en vecka klämdes den renala pedikeln med skadefria vaskulära klämmor under 30 min. Efter reperfusion under 48 timmar avlivades mössen; deras njurvävnadsprover samlades in och fixerades i 4-procentig paraformaldehydlösning för att framställa paraffinblock. Plasma erhölls för att mäta blodureakväve (BUN) och kreatinin.

2.2. Material.

Q94 köptes från Tocris Bioscience (Bristol, Storbritannien). Andra kemikalier erhölls från Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) om inte annat anges.

2.3. Analys för kreatinin och BUN.

Kommersiella analyssatser (Creatinine Assay Kit ab65340; Abcam, Cambridge, Storbritannien) användes för att mäta kreatinin. BUN-analyskit köptes från ABSBio™ (UREA NITROGEN Kit, CNHAO BIO, Peking, Kina).

2.4. Histologi.

Före inbäddning i paraffin fixerades njurvävnaden med 4 procent paraformaldehyd. Njurparaffinblock skars i 2 μm sektioner och monterades på objektglas över natten vid 25 grader C. Efter avparaffinering färgades sektionerna med hematoxylin och eosin (H&E). Bilder togs med hjälp av ett mikroskop (BX-51/DP-72; Olympus, Tokyo, Japan). Som tidigare beskrivits [9], diagnostiserades njurtubulusskada baserat på flera histopatologiska förändringar, såsom tubulär utvidgning, trängsel/blödning, förlust av borstgränser, bildning av tubulär gips och cellys med utsöndrat skräp i den tubulära lumen. Tubulär skada poängsattes enligt procentandelen skadade tubuli: 0, ingen skada; 1,<25%; 2,="" 25–50%;="" 3,="" 51–75%;="" and="" 4,="">75 procent. Poängsättningen utfördes på ett förblindat sätt.

2.5. Immunfluorescens och immunhistokemi.

Sektioner preparerades enligt beskrivningen för histologianalysen (H&E) och inkuberades sedan med 0,3 procent väteperoxid under 30 minuter för att blockera endogena peroxidaser efter avparaffinisering med xylen. För antigenåtervinning inkuberades sektionerna med proteinas K (DAKO Cytomation, Glostrup, Danmark) under 10 min. Efter blockering med 10 procent getserum inkuberades sektionerna med primära antikroppar över natten vid 4 grader C (anti-Kim 1 antikropp, ab47635, Abcam; anti Ki67 antikropp, ab15580, Abcam; anti-PAR-1 antikropp, ab32611 , Abcam). Efter inkubation med den primära antikroppen inkuberades sektionerna med den sekundära antikroppen vid 25 grader C under 1 timme. DAB-substrat (DAKO) användes för att visualisera immunhistokemi (IHC) färgningsresultat. Fluorescenssignaler detekterades med en Alexa Fluor 594-märkt sekundär antikropp. Bilder togs med hjälp av ett FL-fluorescensmikroskop (BX51; Olympus) med ett lämpligt filter. ImageJ programvara (NIH, Bethesda, MD, USA) användes för att analysera de positiva områdena.

2.6. Realtids-PCR.

För att utvärdera regleringen av mRNA-uttryck under dessa betingelser isolerades mRNA från njurvävnad. Ett PCR-system (7300 Fast Real-Time; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) och Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I kit (Applied Biosystems) användes för att detektera nivåerna av 18S och PAR-1 mRNA. Primersekvenser var enligt följande: 18S —5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3', 5'-CCATCCAATCG GTAGTAGCG-3'; PAR-1—5′-GTTGATCGTTTCCACG GTCT-3′, 5′-GCTGCCTCTGTACCAGGACT-3′. Relativa mRNA-nivåer bestämdes med 2−ΔΔCq-metoden. ΔACq-värdet beräknades med hjälp av data från kontrollgruppen.

2.7. Kirurgisk procedur och In Vivo Multiphoton Imaging-inställningar.

Mössen bedövades med 2 procent isofluran (Mylan, Osaka, Japan). Efter trakeotomi kanylerades halsvenen för fluorescerande färginjektion och infusion av underhållsvätska, som bestod av 1,0μL/min av 2 procent albumin i fosfatbuffrad saltlösning. Den vänstra njuren på varje mus exterioriserades genom ett litet flanksnitt och fästes på ett täckglas. Mikroskopstadiet och djuren värmdes med hjälp av en värmedyna under alla experimentella procedurer. Intravital multifotonmikroskopi utfördes med ett Olympus FV1000MPE multifoton konfokalt fluorescensavbildningssystem som drivs av en Chameleon Ultra-II MP-laser vid 860nm (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, USA). Mikroskopobjektivet var en 25x vattensänkningslins med en 1,05 numerisk bländare. Avbildningsinställningarna för mikroskopet (förstärkning och offset för alla tre kanalerna; blå, grön och röd) fixades under hela experimentet. Efter en återhämtningsperiod på 30 minuter injicerades rhodamine B- 70kD-dextran intravenöst och 3-D z-stack-bilder togs på ett djup av 5–50 μm (2 μm från varandra) från njurytan.

2.8. Cell kultur.

Human njure 2 (HK2) celler erhölls från Cell Bank of Academy Sciences (Shanghai, Kina) och odlades som tidigare beskrivits [10]. Cellerna odlades i Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum och 1 procent penicillin-streptomycin i en fuktad atmosfär av 95 procent luft och 5 procent CO2 vid 37 grader.

2.9. WST-1-analyser för att utvärdera cellproliferation.

HK2-celler såddes i 6-brunnsplattor med en densitet av 1×104 celler/brunn. Efter stimulering av HK2-cellerna med trombin, utfördes WST- 1-analyser enligt tillverkarens protokoll (katalog #C0035; Beyotime, Shanghai, Kina) för att bestämma cellernas proliferativa förmåga. Efter 2 timmars inkubation med 100 μL WST-1-reagens i varje brunn, mättes absorbansen hos proverna med en mikroplattläsare vid en våglängd på 450 nm.

2.10. Kaspas-3-analys.

Kaspas-3-aktivitet mättes med ett kommersiellt tillgängligt kaspas-3-aktivitetskit (katalog #C1116; Beyotime, Shanghai, Kina) [11]. Efter inkubation med kaspas-3-aktivitetssatsreagenset detekterades absorbansen av proverna med en mikroplattläsare (Spectra-Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) vid 405 nm enligt tillverkarens instruktioner.

2.11. Data och statistisk analys.

Envägsvariansanalys användes för att jämföra flera grupper, följt av Tukeys multipla jämförelsetest. För att jämföra två individuella grupper använde vi Students t-test. p < 0:05="" ansågs="" indikera="" statistiskt="" signifikanta="">

Cistanche tubulosaförhindrar njursjukdom

3. Resultat

3.1. PAR-1 Uttryck i IR-njuren.

Vi bekräftade först uttrycket av PAR-1 och effekterna av IR på dess uttrycksnivå injure. Vi observerade en nästan 2-faldig ökning av uttrycksnivån för PAR-1-mRNA jämfört med den hos skenkirurgiska möss vid 48 timmar (Figur 1(a)). Vi mätte också uttrycket av PAR-1 genom immunfluorescens 48 timmar efter IR. PAR-1 uttrycktes i det rörformiga cellborstens kantmembran. Nivån av PAR-1 FL-fluorescens uppreglerades jämfört med skengruppmöss (figur 1(b) och 1(c)). Dessa data tyder på att både lokaliseringen av PAR-1 i tubulära celler och dess uttrycksnivå uppreglerades efter IR i njuren.

3.2. Njurfunktion och histopatologiska förändringar. Vi bedömdenjurefunktion genom att detektera BUN- och kreatininnivåerna i plasman. I/R inducerade en ökning av nivåerna av BUN och kreatinin jämfört med möss som utsattes för skenkirurgi. Dessutom minskade den IR-inducerade ökningen av BUN-nivån signifikant i Q94-behandlade möss (Figur 2(a)). Serumkreatininnivån hämmades i Q94-behandlade möss jämfört med möss som endast utsatts för IR-kirurgi (Figur 2(b)). Dessa data tyder på att administrationen av Q94 kan skyddanjurefunktion efter IR-skada.

Vi utvärderade också njurhistopatologiska förändringar genom att utföra H&E-färgning. Renal IR ökade signifikant gipsbildning, tubulär dilatation och förlust av borstgränser och trängsel/blödning hos de vehikelbehandlade mössen jämfört med skenmöss. Q94-behandling undertryckte markant dessa förändringar inducerade av IR (figur 2(c) och 3(a)). Analys av H&E-färgningsresultaten mellan grupper avslöjade trängsel/blödningspoäng och tubulär skada för varje grupp. Q94-gruppens möss uppvisade en mycket lägre poäng (figur 2(e) och 3(c)). Vi färgade även Kim-1 som ennjureskademarkör av njurtubulära celler av IHC [12]. Kim-1-positiva områden ökade i det renala tubulära området hos möss med IR-förolämpning, som signifikant undertrycktes av Q94 (figur 2(d) och 2(f)). Dessa data tyder på att Q94 kan undertryckanjuretubulär skada inducerad av IR-skada.

3.3. Onormalt blodcellsflöde vid in vivo-avbildning.

PAR-1 och dess ligand trombin spelar viktiga roller vid överbelastning; Q94 förbättrade avsevärt trängseln. Därför utförde vi intravital avbildning med multifotonmikroskopi. Detta gör det möjligt att observera blodkropps-karlen i den peritubulära kapillären i realtid i levande möss (Figur 3(c)). Plasma visualiserades med 70 kDa dextran konjugerat med rhodamin B (Figur 3(d)). Blodceller som inte genererar FL-fluorescens som svar på lasern användes för att excitera rhodamin B och avbildades som skuggor. Såsom visas i figur 3(e) störde njur-IR den vanliga blodcellsföljningen och inducerade mikrocirkulationsfel. Q94 förbättrade peritubulära kapillärblodkroppar.

3.4. Tubulär cellproliferation efter IR-skada.

Det har rapporterats att den proliferativa regenereringen av tubulära celler spelar en viktig roll i återställandet av den tubulära strukturen och njurfunktionen efter IR-skada. PAR-1 är känt för att modifiera proliferationen av epitelceller när den aktiveras av trombin. Vi upptäckte således proliferationen av njurrörsceller i en Ki-67 IHC-analys. 48 timmar efter IR ökades antalet prolifererande Ki-67-positiva tubulära celler. Q94 förstärkte ytterligare det ökade antalet Ki-67--positiva tubulära celler efter IR jämfört med det i endast IR-behandlade möss (figur 4(a) och 4(b)). Dessutom kontrollerade vi om cellproliferationsförmågan påverkades av hämning av PAR-1 in vitro-experiment med HK2-celler inkuberade med trombin, en PAR-1-agonist. Den proliferativa aktiviteten av HK2-celler mättes med WST-1-analys. Såsom visas i figur 4(c) undertrycktes proliferationen av HK2-celler dramatiskt efter behandling med trombin. Denna trombininducerade hämning avskaffades emellertid nästan av Q94. Dessa data indikerar att PAR-1 negativt reglerade proliferationen av tubulära njurceller, vilket nästan avskaffades av Q94 PAR-1-antagonisten.

att lindra den kroniska njursjukdomen medcistanche

3.5. Renal tubulär cellapoptos.

Vi undersökte vidare apoptos av njurceller med kaspas-3, som är den viktigaste bödelkaspasen och aktiveras av både inre och yttre vägar under apoptos [13]. Med hjälp av trombininkuberade odlade HK2-celler fann vi att trombin ökade aktiviteten hos kaspas-3. Dessutom undertryckte administreringen av Q94 aktiviteten av kaspas-3 (Figur 4(d)). Dessa data tyder på att trombininducerad apoptos av HK2-celler hämmades av Q94 PAR-1-antagonisten.

4. Diskussion

NjureIR-skada kännetecknas av trängsel/blödning, akut tubulär nekros, inflammation och avsättning av gipsbildning [5]. Här visade vi att hämning av PAR-1 förbättrade både blodkamratrelaterade förändringar och tubulointerstitiell förändring. Det är välkänt att PAR-1 och dess ligand, trombin, spelar viktiga roller i trombocytkoagulation, och interferens av detta system, såsom av trombomodulin [14, 15], kan förhindra AKI. Vi visade att PAR- 1-hämning undertryckte trängsel och förbättrade blodflödet i de peritubulära kapillärerna hos möss med njurskada, vilket tyder på att PAR-1-systemet försämrade mikrocirkulationen. Dessutom var uttrycksnivån för PAR-1 uppreglerad i tubuli efter njurskada, vilket indikerar att det PAR-1-beroende systemet i tubuli också överdriver renal IR-skada. Det är väl etablerat att regenerering av tubulära celler är en viktig process för att återuppbygga den tubulära strukturen och för att återställa njurfunktionen efter IR-skada [16, 17]. Beroende på graden av skada är denna reparationskapacitet inte obegränsad [18]. Därför behövs behandlingsalternativ för att dämpa skador i tubulära celler eller påskynda deras spridning. Vår in vitro-studie visade att PAR- 1/trombin negativt reglerade proliferationen av tubulära celler, vilket i sin tur accelererades efter hämning av PAR-1. Dessutom visades IR-skada hos möss öka tubulär proliferation vid 48 timmar, med en ytterligare ökning efter PAR-1-hämning. Vi fann att PAR-1 ökade i borstens kantmembran i proximala tubuli. Eftersom det har rapporterats att funktionen hos den glomerulära filtrationsbarriären minskar under njur-IR-skada [19], kan det filtrerade trombinet från glomeruli aktivera den ökade PAR- 1 och därigenom störa tubulär regenerering.

Våra resultat tyder på att PAR-1/trombinsystemet undertryckte proliferationen av tubulära celler och ökade apoptos. En annan studie visade dock motsatta effekter av PAR-1 när den aktiverades av protein C [20, 21]. Denna uppenbara motstridiga roll för PAR-1 kan bero på metoden för dess aktivering. I vår studie var en möjlig förklaring till dess tillskrivna roll att PAR-1 aktiverades av filtrerat trombin. Storleken på protein C är över 60 kDa, vilket liknar den för albumin [22, 23] och mycket större än den för trombin (36 kDa). Dessutom är dess plasmakoncentration (<100 nm)="" is="" less="" than="" 10%="" of="" thrombin="" (="">1 μM), vilket indikerar att protein C genomgår mindre filtrering och producerade en svagare signal jämfört med trombin.

Trombotiska episoder är en riskfaktor för patienter med njursvikt i slutstadiet [24]. En studie visade att PAR-1-brist skyddade mot diabetisk CKD [25]. I vår studie observerade vi effekten av hämning av PAR-1 på njurfunktionen i ett tidigt skede efter IR. I fortsatta studier avser vi att utveckla en kronisknjureIR-inducerad sjukdomsmodell [2] för att utvärdera den potentiella kopplingen mellan PAR-1 och CKD.

Sammanfattningsvis visade vi att PAR-1 förvärrade mikrocirkulationsfel och negativt reglerade proliferationen av tubulära celler. Däremot bidrog hämning av PAR-1 till att förbättra mikrocirkulationen och proliferationen av tubulära celler och efter IR, vilket tjänade som en framträdande mekanism för njuråterhämtning, och bör betraktas som en ny strategi vid behandling av AKI.

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

1 Institutionen för urologi, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Peking, Kina

2 Institutionen för farmakologi, Kagawa University, Kagawa, Japan

3Division of Kidney Transplantation, Department of Surgery, The Third Affiliated Hospital vid Sun Yat-sen University,

Guangzhou, Kina

Korrespondens bör riktas till Ye Tian; kidney@ccmu.edu.cn och Lei Zhang; leizhangkidney@gmail.com Mottaget 1 januari 2021; Reviderad 25 januari 2021; Godkänd 8 februari 2021; Publicerad 23 februari 2021

Akademisk redaktör: Junyan Liu

Copyright © 2021 Yu Guan et al. Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras underCreative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att originalverket är korrekt citerat.

Ischemi-reperfusion (IR-) inducerad njurskada är svår att undvika under njurtransplantation och robotassisterad partiell nefrektomi. Renal IR-skada kännetecknas av tubulär skada, mikrocirkulationsfel och inflammation, vilket koordinerar njurskadan; dock finns ingen specifik behandling tillgänglig för dessa tillstånd. Proteasaktiverad receptor-1 (PAR-1) och dess ligand, trombin, är involverade i koagulation och visades vara associerade med epitelcellskada. Här antog vi att PAR-1 överdrev renal IR-inducerad tubulär cellskada och mikrocirkulationsfel och att farmakologisk hämning av PAR-1 av Q94 kunde förhindra dessa skador. Renal varm IR ökade uttrycket av PAR-1 i njurtubuli. Q94 försvagade renala IR-inducerade förändringar och histopatologisk skada. Mikrocirkulationsfel analyserades genom trängsel i histopatologin och blodcellsflödet undersökt med intravital multifotonmikroskopi undertrycktes med Q94-behandling. Q94 ökade också dramatiskt tubulär cellproliferation trots den lägre njurskadan. Trombin undertryckte cellproliferation och inducerade apoptos i tubuli; dessa effekter förhindrades av Q94-behandling. Sammantaget var PAR-1 associerat med IR-njurskada. Hämning av PAR-1 förbättrade skadan möjligen genom att förbättra njurmikrocirkulationen och tubulär cellöverlevnad/proliferation.

Data Availabjag tändey

Författarna bekräftar att de data som stöder resultaten av denna studie finns tillgängliga i artikeln.

Cpåflicts of Interest

Alla författare har förklarat att de inte har några konkurrerande intressen.

Authors' Cpåtributipås

Yu Guan och Daisuke Nakano skrev manuskriptet och utförde djurexperiment. Lei Li utförde experiment in vitro. Haofeng Zheng utförde den statistiska analysen. Akira Nishiyama reviderade manuskriptet. Lei Zhang och Ye Tian designade denna studie.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Kinas National Natural Science Foundation (nr 82000712) och China Postdoctoral Science Foundation (nr 2020M670385).

Referenser

[1] MN Simmons, MJ Schreiber och IS Gill, "Surgical renal ischemi: a contemporary overview," The Journal of Urology., vol. 180, nr. 1, s. 19–30, 2008.

[2] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang, L. Li, Y. Tian och A. Nishiyama, "En musmodell av njurfibros för att övervinna den tekniska variationen i ischemi/reperfusionsskada bland operatörer," Scientific Rapporter, vol. 9, nr. 1, sid. 10435, 2019. 7 BioMed Research International

[3] M. Joannidis och PGH Metnitz, "Epidemiology and natural history of acute renal failure in ICU," Critical Care Clinics, vol. 21, nr. 2, s. 239–249, 2005.

[4] D. Nakano, K. Doi, H. Kitamura, et al., "Reduktion av tubulär flödeshastighet som en mekanism för oliguri i den tidiga fasen av endotoxemi avslöjad genom intravital avbildning," Journal of the Ameri can Society of Nephrology vol. 26, nr. 12, s. 3035–3044, 2015.

[5] D. Nakano och A. Nishiyama, "Multiphoton imaging of kidney patophysiology," Journal of Pharmacological Sciences, vol. 132, nr. 1, s. 1–5, 2016.

[6] Y. Zhang, D. Nakano, Y. Guan, et al., "En natrium-glukos cotransporter 2-hämmare dämpar njurkapillärskada och fibros genom en vaskulär endoteltillväxtfaktorberoende väg efter njurskada hos möss," Njure. International, vol. 94, nr. 3, s. 524–535, 2018.

[7] S. Nishioka, D. Nakano, K. Kitada, et al., "Den cyklinberoende kinashämmaren p21 är väsentlig för de gynnsamma effekterna av njurischemisk förkonditionering på njurischemi/reperfusionsskada hos möss," Kidney International, vol. 85, nr. 4, s. 871–879, 2014.

[8] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang, et al., "En proteasaktiverad receptor-1-antagonist skyddar mot podocytskada i en musmodell av nefropati," Journal of Pharmacological Sciences, vol. 135, nr. 2, s. 81–88, 2017.

[9] M. Jiang, Q. Wei, G. Dong, M. Komatsu, Y. Su och Z. Dong, "Autofagi i proximala tubuli skyddar mot akut njurskada," Kidney International, vol. 82, nr. 12, s. 1271–1283, 2012.

[10] X. Hu, M. Su, J. Lin, et al., "Corin är nedreglerad vid njurischemi/reperfusionsskada och är associerad med fördröjd transplantatfunktion efter njurtransplantation," Disease Markers, vol. 2019, artikel-id 9429323, 8 sidor, 2019.

[11] P. Wang, H. Wang, Q. Huang, et al., "Exosomer från M1- polariserade makrofager förstärker paklitaxel antitumöraktivitet genom att aktivera makrofager-medierad inflammation," Theranostics., vol. 9, nr. 6, s. 1714–1727, 2019.

[12] L. Yang, CR Brooks, S. Xiao, et al., "KIM-1-medierad fagocytos minskar akut skada på njuren," The Journal of Clinical Investigation, vol. 125, nr. 4, s. 1620–1636, 2015.

[13] L. Xu, X. Li, F. Zhang, L. Wu, Z. Dong och D. Zhang, "EGFR driver utvecklingen av AKI till CKD genom HIPK2-överuttryck," Theranostics., vol. 9, nr. 9, s. 2712–2726, 2019.

[14] T. Hifumi, D. Nakano, J. Chiba, et al., "Kombinerad terapi med gas gangren antitoxin och rekombinant humant lösligt trombomodulin för _Clostridium perfringens_ sepsis i en råttmodell, "Toxicon, vol. 141, s. 112–117, 2018.

[15] N. Hayase, K. Doi, T. Hiruma, et al., "Rekombinant trombomodulin förhindrar akut lungskada inducerad av njurischemi-reperfusionsskada," Scientific Reports, vol. 10, nr. 1, sid. 289, 2020.

[16] E. Lazzeri, ML Angelotti, A. Paired et al., "Endocykelrelaterad tubulär cellhypertrofi och progenitorproliferation återställer njurfunktionen efter akut njurskada," Nature Communications, vol. 9, nr. 1, sid. 1344, 2018.

[17] K. Takaori, J. Nakamura, S. Yamamoto, et al., "Svarlighet och frekvens av proximal tubuliskada bestämmer njurprognosen," Journal of the American Society of Nephrology: JASN, vol. 27, nr. 8, s. 2393–2406, 2016.

[18] BD Humphreys, MT Valerius, A. Kobayashi, et al., "Inbyggda epitelceller reparerar njuren efter skada," Cell Stem Cell, vol. 2, nr. 3, s. 284–291, 2008.

[19] R. Wakasaki, K. Matsushita, K. Golgotiu, et al., "Glomerular filtrate proteins in acute cardiorenal syndrome," JCI Insight, vol. 4, nr. 4, 2019.

[20] M. Riewald, RJ Petrovan, A. Donner, BM Mueller och W. Ruf, "Aktivering av endotelcellsproteasaktiverad receptor 1 genom protein C-vägen," Science, vol. 296, nr. 5574, s. 1880–1882, 2002.

[21] MJ Ludeman, H. Kataoka, Y. Srinivasan, NL Esmon, CT Esmon och SR Coughlin, "PAR1-klyvning och signalering som svar på aktiverat protein C och trombin∗," The Journal of Biological Chemistry, vol. 280, nr. 13, s. 13122–13128,

2005.

[22] JH Griffin, BV Zlokovic och LO Mosnier, "Activated protein C: biased for translation," Blood, vol. 125, nr. 19, s. 2898–2907, 2015.

[23] R. Essalmani, D. Susan-Resiga, J. Guillemot, et al., "Trombinaktivering av protein C kräver tidigare bearbetning av ett leverproproteinkonvertas," The Journal of Biological Chemistry, vol. 292, nr. 25, s. 10564–10573, 2017.

[24] S. Van Laecke och W. Van Biesen, "Svår hypertoni med renal trombotisk mikroangiopati: vad hände med den vanliga misstänkte?", Kidney International, vol. 91, nr. 6, s. 1271–1274, 2017.

[25] M. Waasdorp, J. Duitman, S. Florquin och CA Spek, "Proteasaktiverad receptor-1-brist skyddar mot streptozotocin-inducerad diabetisk nefropati hos möss," Scientific Reports, vol. 6, nr. 1, sid. 33030, 2016.