Skyddseffekter av endotel-progenitorcellsmikrovesiklar på Ang II-inducerad råttnjurcellskada
Mar 11, 2022
Abstrakt.Kronisk hypertoni kan leda tillnjurskada,känd som hypertensiv nefropati eller hypertensiv nefroskleros. Ytterligare förståelse av de molekylära mekanismer via vilka hypertensiv nefropati utvecklas är avgörande för effektiv diagnos och behandling. Den aktuella studien undersökte mekanismerna genom vilka endotelceller (EPC) reparerar primär råttanjureceller (PRK). ELISA, Cell Counting Kit-8 och flödescytometrianalyser användes för att analysera effekterna av EPC eller EPC-MV på oxidativ stress, inflammation, cellproliferation, apoptos och cykel av PRK inducerad av AngII. En PRK-skademodell etablerades med användning av angiotensin II (Ang II). Efter Ang II-induktion minskade PRK-proliferationen, apoptos ökades och cellcykeln blockerades vid G1-fasen innan den gick in i S-fasen. Det visade sig att nivåerna av reaktiva syrearter och malondialdehyd ökade, medan nivåerna av glutationperoxidas och superoxiddismutas minskade. Dessutom ökade nivåerna av de inflammatoriska cytokinerna IL‑1, IL‑6 och TNF‑ signifikant. Således skadade Ang II PRK genom att stimulera oxidativ stress och främja det inflammatoriska svaret. Men när PRK:er samodlades med EPC:er, reducerades skadorna som inducerades av Ang II avsevärt. Den aktuella studien samlade in mikrovesiklar (MV) som utsöndrades av EPC:er och samodlade dem med Ang II-inducerade PRK:er, och identifierade att EPC-MV:er behöll sin skyddande effekt på PRK:er. Sammanfattningsvis skyddar EPC:er PRK:er från Ang II-inducerad skada via utsöndrade MV:er.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSJUKDOMAR
Introduktion
Hypertoni är en riskfaktor för incidensen av kardiovaskulära och cerebrovaskulära sjukdomar och deras associerade dödlighet (1). Denjurarkan orsaka hypertoni och är ett av målorganen för hypertoniskador (2). Kronisknjursjukdom(CKD) har varit en av de främsta orsakerna till ökad dödlighet bland individer med högt blodtryck över hela världen under de senaste två decennierna (3,4). Således finns det ett brådskande behov av att främja behandlingen av hypertensiv nefropati och studera dess patologiska mekanism. Tidigare studier har visat att angiotensin II (Ang II) inducerade vaskulär skada och spelade en nyckelroll vid kärlsjukdomar via flera mekanismer, såsom inducering av apoptos (5), cellcykelstopp (6), ökande nivåer av reaktiva syrearter (ROS) ( 7), främjar det oxidativa stresssvaret genom att öka utsöndringen av malondialdehyd (MDA) och minska utsöndringen av glutationperoxidas (GSH-Px) och superoxiddismutas (SOD) (8,9). Ang II främjar också produktionen av inflammationsrelaterade faktorer, såsom IL-6, IL-1 och TNF- (10-12). Ang II-inducerad skada har därför använts för att modellera hypertoni in vitro, inklusive hos primär råttanjureceller (PRK) (13,14).
För patienter mednjurfunktionfunktionsnedsättning, skador på endotelceller och minskad regenerering och reparation är de främsta orsakerna till förlusten av peritubulära mikrovesiklar (MV) (15). Endotelial stamceller (EPC) härledda från benmärg kan främja endotelial reparation (16,17). Tidigare studier har visat att EPC kan förbättra kardiovaskulär regenerering (18) och reglera angiogenes (19), samt utöva terapeutiska effekter på akutanjur-ischemi-reperfusionsskada (20) och hos patienter mednjurtransplantation(21). Så vitt vi vet har dock effekten av EPC på hypertensiv nefropati inte rapporterats tidigare. Vi antog att EPC kan ha en skyddande effekt mot hypertensiv nefropati injur-celler. MV utsöndras kontinuerligt av en mängd olika celler i kroppen, såsom epitelceller, tumörceller och stamceller, och finns i flera kroppsvätskor, såsom blod, urin och mjölk, där de förmedlar biologiska funktioner (22). Ackumulerande bevis har antytt att den skyddande effekten av EPC:er är nära förknippad med frisättning av MV:er (23,24) I denna studie undersöktes den potentiella tillämpningen av EPC-MV för behandling av hypertensiv nefropati genom att undersöka de skyddande effekterna och mekanismerna genom vilken EPC-MV skyddar mot Ang II-inducerad PRK-skada, för att tillhandahålla en biologisk teoretisk grund för behandling av hypertensiv nefropati.
Nyckelord:EPC-MV, hypertensiv nefropati, Ang II, ROS, MV, inflammation, njure, njure
Material och metoder
Djur.Totalt 12 8‑veckogamla Wistar-Kyoto (WKY) specifika patogenfria hanråttor (vikt 80–120 g) erhölls från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licens nr SCXK, Guangdong, 2015-0063). Råttorna placerades i ett rum med konstant temperatur och luftfuktighet (temperatur, 23±2˚C; luftfuktighet, 50±10 procent), under en 12-timmars ljus/mörkercykel med ad libitum tillgång till standardråttfoder och vatten i en polystyrenbur. Alla djurförsök godkändes av Animal Care and Use Committee vid Hainan Medical University (Haikou, Kina; godkännande nr. HYLL-2021-053) och utfördes enligt National Institutes of Healths riktlinjer (25).
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURFUNKTIONEN
Isolering och kultur av PRK.WKY-råttor med fri tillgång till vatten har fastat i 12 timmar före experimentet. WKY-möss avlivades med en intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (200 mg/kg kroppsvikt), sedannjuraravlägsnades aseptiskt och den kortikala delen avnjureskars ut och transplanterades i en liten bägare. Denjur-cortex skars i vävnadsfragment på ~1 mm3, tvättades tre gånger med PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugerades vid 1, 000 xg vid 25°C under 5 minuter och supernatanten kasserades. Vävnadsfragmenten sattes till typ I kollagenas (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid en slutlig koncentration av 1 g/l, och vävnadsfragmenten oscillerades och digererades vid 37˚C i 30 min. Efter filtrering genom en 200-mesh (0,075 mm) sikt av rostfritt stål, separerades cellerna med Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) densitetsgradientcentrifugering (26). Efter centrifugering vid 1,000 xg vid 25˚C i 2 minuter, samlades den mellanliggande suspensionen upp och blandades med MEM/F12-medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inokulerades i en 6-brunnars platta och odlas vid 37˚C under 5 procent CO2. Efter 24 timmar avlägsnades mediet och ersattes med ett färskt medium och det obundnanjur-celler och vävnad kasserades. Efter 48 timmar avlägsnades mediet igen, cellerna tvättades två gånger med PBS och betecknades som PRK (27,28); den huvudsakliga beståndsdelen var glomerulära mesangialceller från råtta. PRK odlades i tre generationer och behandlades med Ang II (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) vid 37˚C i 24 timmar för att etablera PRKnjurskadamodell. Den Ang II-inducerade inflammationen hos råttanjur-tubulära epitelceller utfördes som tidigare beskrivits av Nair et al (29).
PRK identifierades med hjälp av en immunfluorescens (IF) analys.Efter att ha sköljts tre gånger med PBS och fixerats med 4 procent paraformaldehyd vid 25˚C i 1 timme, inkuberades cellerna (25˚C) med Triton X‑100 i 2 timmar, följt av 5 procent BSA (Beijing) Solar Science & Technology Co., Ltd.) vid 25˚C i 30 min. PRK:erna inkuberades sedan över natten i mörker med -slätmuskelaktin (-SMA; 1 µg/ml; kat.nr ab7817; Abcam) och vimentin (1:250; kat.nr ab92547; Abcam) vid 4˚C. Efter att ha sköljts tre gånger med PBS inkuberades cellerna med Alexa Fluor® 488‑ (1:100; kat.nr ab150077; Abcam) eller 647-märkta (1:200; kat.nr ab150075; Abcam) sekundära antikroppar vid 37 ˚C i 1 timme. Därefter färgades cellerna med DAPI (0,5 µg/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) vid 25°C under 5 min. Slutligen togs bilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop (förstoring, x400; Leica Microsystems GmbH).
Kultur och identifiering av EPC.Råttlårbenet och skenbenet dissekerades och varje benmärgsrör spolades med steril PBS. Den resulterande blandningen centrifugerades (1,000 xg; 25˚C; 15 min) och partiklarna återsuspenderades i MEM/F12-medium. Celler isolerades med Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) densitetsgradientcentrifugering (1,000 xg; 25˚C; 20 min) och placerades i en 25‑cm2 odlingskolv belagd med fibronektin (BD Biosciences). Celler hölls i ett komplett medium under standardbetingelser (37˚C; 5 procent CO2). Odlingsmediet byttes efter 4 dagar och de vidhäftande cellerna odlades under ytterligare 3 dagar (30). Dil-komplex acetylerad lågdensitetslipoprotein (Dil-Ac-LDL) färgning (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) användes för att identifiera EPC. För samodlingssystemet sattes PRK (1x104 ) till den nedre kammaren på en samodlingsplatta (Corning, Inc.) i 24 timmar och sedan tillsattes Ang II (1 µM) eller 200 µl PBS och EPC (3x104 ). sattes till den övre kammaren och inkuberades vid 37˚C i 24 timmar innan ytterligare cellfunktionsanalys utfördes. Vid screening av PRK och den bästa andelen EPC var cellantalproportionerna 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 och 1:7.
Förberedelse av EPC-MV. EPC:er odlades i 7 dagar som tidigare beskrivits (30), tvättades två gånger med PBS och serumsvältades i 12 timmar. Därefter uppsamlades MEM/F12-medium innehållande odlade EPC:er och centrifugerades vid 4˚C (1,000 xg; 15 min), och supernatanten extraherades vid 4˚C (100,{10}} xg; 60 min) för insamling av utsöndrade EPC-MV. Efter inbäddning i Pon 812 epoxiharts (Structure Probe, Inc.), placerades den vid 37˚C över natten. Därefter tillsattes elektronmikroskopfixeringslösning (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) under 4 timmar, och uranacetat (2 procent; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) och blycitrat (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) färgades vid 25°C under 15 min. MV bekräftades via transmissionselektronmikroskopi. I samodlingssystemet sattes 50 µg/ml EPC-MV (31) till den övre kammaren på en Transwell-analysplatta, och parker tillsattes till den nedre kammaren som tidigare beskrivits och inkuberades i 24 timmar.
Cellproliferationsanalys.PRK: er digererades med trypsin, inokulerades i 96-brunnars plattor med en densitet av 3x103 celler/brunn och odlades i 24 timmar. Den optiska densiteten vid 450 nm mättes med 10 µl Cell Counting Kit-8-reagens (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) vid 37˚C i 60 minuter, enligt tillverkarens instruktioner, för att utvärdera cellproliferationshastighet.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA
Cellapoptosanalys.En cellapoptosanalys utfördes med hjälp av ett Annexin V-FITC Apoptos Detection Kit (BD Biosciences), enligt tillverkarens instruktioner. PRK skördades, tvättades två gånger med iskall PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) och återsuspenderades i 500 µl bindningsbuffert. De återsuspenderade PRK:erna inkuberades sedan med 5 µl Annexin V-FITC och 5 µl PI i mörker i 15 minuter vid 23±2˚C. Cellapoptos utvärderades med flödescytometri (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™-programvara, version: 1.0; BD Biosciences).
EPC-MV och PRK-fusion.För att observera huruvida EPC-MV fusionerades med PRK, märktes EPC-MV med ett lipidmembraninbäddat fluorescerande färgämne (PKH26) före saminkubation. Kortfattat kombinerades 50 µg/ml EPC‑MV med 2 ml PKH26 (2x10‑6 M; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) och blandades vid 23±2˚C i 5 minuter. Den märkta blandningen sattes till 2 ml 1 procent BSA (v) och centrifugerades vid 100, 000 xg vid 4˚C i 60 minuter, sköljdes sedan med kall PBS. Fällningen suspenderades i 1 ml MEM/F12-medium, sattes till PRK och inkuberades vid 37°C i 24 timmar. Slutligen tillsattes 1 µg/ml DAPI för nukleär färgning vid 25°C under 15 min. Cellbilder togs med hjälp av ett fluorescensmikroskop (förstoring, x400; Leica Microsystems GmbH).
Cellcykelanalys.Cellcykelanalysen utfördes med användning av Cell Cycle Detection-kit (BD Biosciences). EPC eller PRK (1x106) skördades, tvättades två gånger med PBS och fixerades sedan i 500 µl 70 procent iskall etanol i 2 timmar vid 25˚C. Cellerna tvättades sedan två gånger med kall PBS och inkuberades i PI (400 µl) och RNas (100 µl) under 30 minuter vid 37 ˚C i mörker. PI-signalen detekterades med användning av FCM (FACSCanto II). Procentandelen av cellerna i G1-, S- och G2-fas räknades och jämfördes med FlowJo-mjukvara (version 10.0.6; FlowJo LLC).
ROS-mätning med FCM.PRK:erna odlades till 60-70 procent konfluens och skördades via trypsinisering. Alla celler inkuberades med 1,0 µM 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat i 15 minuter vid 37˚C. Cellerna tvättades sedan två gånger med PBS och analyserades via FCM för att detektera ROS med användning av en 488 nm laser för excitation och en 535 nm laser för detektion.
ELISA.Efter centrifugering (1,000 xg; 25˚C; 5 min) samlades cellsupernatanten från varje undergrupp för att analysera nivåerna av MDA, GSH‑Px, SOD och de inflammatoriska faktorerna IL‑6, IL‑ 1 och TNF-. Följande kit användes enligt tillverkarens instruktioner: Micro MDA analyskit (kat.nr BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH-Px analyskit (kat.nr. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), SOD-aktivitetsdetektionskit (kat.nr BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), råtta IL-1 ELISA-kit (kat.nr RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), IL‑6 Quantikine ELISA-kit för råtta (kat.nr R6000B; R&D Systems, Inc.) och rått-TNF Quantikine ELISA-kit (kat.nr RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Statistisk analys.Alla experiment upprepades tre gånger och alla data uttrycks som medelvärde ± SD. Data analyserades med SPSS-programvaruversion 21.0 (IBM Corp.). Skillnader mellan flera grupper bedömdes med envägs ANOVA och Dunnetts post hoc-test. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultat
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 procent, vilket bekräftar att EPC:er isolerades framgångsrikt. Isolerade PRK analyserades via IF (vimentin/-SMA). Resultaten visade att uttrycksnivån av vimentin/-SMA i PRK var hög och positiv, vilket tyder på framgångsrik isolering av PRK (Fig. 1B).
Det optimala förhållandet mellan EPC och PRK.Effekten av att kombinera olika proportioner av PRK:er/EPC:er i ett samodlingssystem undersöktes, och det visade sig att PRK:er odlade i ett förhållande av 1:3 PRK:er/EPC:er inte hade ökade spridningshastigheter jämfört med PRK:er odlade med en 2: 1, 1:1 eller 1:2 förhållande PRK/EPC (Fig. IC). Dessutom resulterade ökande andelar av EPC:er (1:4, 1:5, 1:6 och 1:7) i en signifikant ökning av PRK-proliferation jämfört med EPC:er (1:3). Därför valdes ett förhållande på 1:3 PRKs/EPCs för ytterligare studier för att förhindra eventuell störning från överdriven EPC i efterföljande experiment.
Effekt av EPC-samkultur på Ang II-inducerad skada.PRK (1x104 ) ympades 24 timmar i förväg i den nedre avdelningen på en Transwell-platta. Den övre kammaren innehöll 200 µl PBS i kontrollgruppen och 200 µl EPC (3x104 µl) i experimentgruppen. Att stå modellnjurskador,1 uM Ang II sattes till den nedre avdelningen. Efter 24 timmar utfördes CCK-8- och FCM-analyser för att mäta spridningshastigheten för PRK. PRK som fick Ang II i frånvaro av EPC hade en signifikant minskning (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">njurecellmodell.
EPC skyddar PRK från Ang II-inducerad skada, nivåerna av oxidativ stress inducerad av Ang II i PRK samodlade med EPC undersöktes. Resultaten från FCM-analysen avslöjade att Ang II signifikant ökade (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPCs, 2:1 group; *P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">njureceller; FCM, flödescytometri; CCK‑8, Cell Counting Kit‑8; Dil‑Ac‑LDL, Dil-komplex acetylerat lågdensitetslipoprotein; OD, optisk densitet; -SMA, -aktin i slät muskel; NS, inte signifikant. motsatta resultat med avseende på utsöndringen av dessa enzymer. Genereringen av ROS kan därför vara involverad i Ang II-inducerad cellskada och kan förbättras genom samodling med EPC.
Ang II kan också skada celler genom att främja utsöndringen av inflammatoriska cytokiner, medan EPC kan förhindra inflammation (32). Därefter undersöktes det huruvida Ang II främjar utsöndringen av inflammatoriska cytokiner i PRK, och om EPC:er kunde utöva sin skyddande roll genom att hämma utsöndringen av inflammatoriska cytokiner. Utsöndringen av IL-1, IL-6 och TNF-uppreglerades signifikant i PRK genom tillägg av Ang II. Däremot var nivåerna av IL‑1, IL‑6 och TNF‑ (Fig. 2E‑G) jämförelsevis lägre i PRK som samodlats med EPC:er (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Den skyddande effekten av EPC utövas via MV.De mekanismer via vilka EPC utövar skyddande effekter på Ang II-induceradnjureceller analyserades ytterligare genom att isolera MV från EPC (Fig. 3A). EPC-MV märktes med PKH26 och sattes till PRK tillsammans med Ang II i en Transwell-platta, som tidigare beskrivits. PKH26-fluorescens detekterades i cytoplasman hos PRK:er (Fig. 3B), vilket tyder på att EPC-MV:er hade smält samman med PRK:er. Sedan fann man att Ang II-inducerad minskad spridningshastighet, främjade apoptos och cykelstopp i G1-fasen, hämmades av EPC-MVs (Fig. 3C-E). I likhet med PRK som samodlats med EPC, hade PRK odlade i närvaro av EPC-MV och exponerade för Ang II minskade nivåer av ROS och MDA (Fig. 4A och B), ökade GSH- och SOD-nivåer (Fig. 4C och D) och minskad utsöndring av de inflammatoriska cytokinerna IL‑1, IL‑6 och TNF‑ (Fig. 4E‑G), jämfört med Ang II-gruppen.
Diskussion
Så vitt vi vet, visade den här studien för första gången att EPC kan skydda PRK från Ang II-inducerad cellskada. Denna skyddande effekt förmedlas, åtminstone delvis, av MV som utsöndras av EPC och smälter samman med PRK under samodling. Genom att lägga till berikade MV till PRK exponerade för Ang II fann man att EPC-MV enbart kunde skydda PRK från Ang II-inducerad skada genom att hämma oxidativ stress och inflammation. MV definieras som membrannanodebris (0.05-1 µm) (33) och avges från cellytan efter aktivering, stress eller apoptos. Vidare kan MV härledas från olika celltyper, såsom blodplättar, endotelceller, EPC och vita blodkroppar (34,35). MV uttrycker specifika cellytmarkörer, som varierar med ursprungscellen och deras bildning och kan utöva antiinflammatoriska, antikoagulerande och angiogena effekter (36). MV som frigörs från EPC kan bära den biologiska informationen från sin modercell och därmed utöva en liknande funktion på målcellerna (33). Till exempel skyddar EPC-MV kardiomyocyter från Ang II-inducerad hypertrofi och apoptos (28), förbättrar endotelfunktionen och förmågan att reglera angiogenes (37) och lindrar endoteldysfunktion inducerad av oxidativ stress (38). Så vitt vi vet har dock effekten av EPC-MV på hypertensiv nefropati inte rapporterats tidigare. Därför syftade den här studien till att undersöka de potentiella skyddande effekterna av EPC:er och EPC-MV:er injurcellsskada.
I föreliggande studie etablerades en PRK-skadamodell genom att inducera skada med Ang II. I enlighet med tidigare rapporter (26,39), minskade Ang II PRK-proliferation, ökade apoptos och stoppade cellcykeln vid G1-fasen innan den gick in i S-fasen. Baserat på dessa hypertonirelaterade markörer drogs slutsatsen att den Ang II-inducerade PRK-hypertensionsmodellen framgångsrikt etablerats. Dessutom fastställdes det att samkultur med EPC skyddade PRK från Ang II-inducerad skada. Efter saminkubation av EPC med PRK plus Ang II, minskade nivåerna av oxidativ stressenzymer och inflammatoriska faktorer i PRK. Således kan de potentiella mekanismerna via vilka EPC:er utövar sina skyddande effekter på PRK:er involvera reglering av oxidativ stress och inflammation. Så vitt vi vet, visade den aktuella studien för första gången att EPC kan förbättra Ang II-inducerad oxidativ stressrespons och inflammation i PRK.
EPC:er skyddar effektivtnjurfunktioni CKD (40) och tjänar en viktig roll för att upprätthålla vaskulär integritet och reparera endotelskada (15), samt minska vaskulärt läckage, förbättra organfunktionen och öka överlevnaden vid sepsis (41). Ackumulerande bevis tyder på att EPC kan utöva en skyddande roll via utsöndring av MV (37,42,43). För att testa den skyddande effekten av EPC-MV i PRK, isolerades EPC-MV:er och märktes med PKH26, och sedan saminkuberades de märkta MV:erna med PRK plus Ang II. EPC-MV fusionerade med PRK och hämmade signifikant den oxidativa stressresponsen och inflammationen som inducerades av Ang II, och dessa resultat liknar de av Fu et al (44). Den hämmande effekten av EPC-MV på nivåerna av oxidativ stressenzymer var större än den för enbart EPC; detta kan hänföras till att MV finns i en högre koncentration i PRK som behandlats med EPC-MV än i de som samodlats med EPC. Dessa fynd tyder på att den skyddande effekten av EPC på PRK mot Ang II-inducerad cellskada kan bero på utsöndrade MV. En begränsning av den föreliggande studien är att de potentiella mekanismerna via vilka EPC-MV reglerar mikroRNA/mRNA/signaltransduktionsaxlar inte undersöktes fullständigt. Rollen och mekanismerna genom vilka EPC-MV utövar skydd motnjurskadabör utvärderas i en djurmodell för hypertensiv nefropati, vilket är en lovande riktning för framtida forskning. Sammanfattningsvis visade den här studien att EPC kan skydda PRK från Ang II-inducerad oxidativ stress och ökad inflammation via utsöndring av MV. Detta ger en ny riktning för behandling av hypertensiv nefropati och etablerar en in vitro-modell för att studeranjurskada.
