Kvalitetsmarkörer av Cistanches Herba Baserat på Antioxidant Spectrum-Effect Relation

Sammanfattning: Mål: Att etablera en forskningsmetod för kvalitetsmarkörer (Q-markörer) förCistanches Herba(CH)baserat påantioxidantspektrum-effekt förhållande, vilket ger en grund för studier av dess farmakologiska substanser och kvalitetskontroll. Metoder: Ultrahögpresterande vätskekromatografi (UPLC) användes för att fastställa fingeravtrycksprofiler för 10 batcher av CH. En modell för celloxidativ skada etablerades med hjälp av H2O2, och antioxidantkapaciteten hos CH bestämdes baserat på den halvmaximala hämmande koncentrationen av reaktiva syreämnen, såväl som nivåerna avsuperoxiddismutasochkatalassomfarmakologiska indikatorer. Spektrum-effektsambandet konstruerades genom principalkomponentanalys, Pearson-korrelationsanalys och partiell minsta kvadraters regressionsanalys. Deaktiva komponenterutsattes förfarmakologisk validering. 

Resultat:Fingeravtrycksprofiler för CH etablerades med hjälp av UPLC, vilket identifierade 17 vanliga toppar. Baserat på spektrum-effektkorrelationsanalys valdes nio komponenter ut. De farmakologiska valideringsresultaten visade att geniposidinsyra, 8-epilogansyra,echinakosid,akteosid, isoakteosid, ochtubulosid Auppvisade antioxidantaktivitet på ett koncentrationsberoende sätt.

Slutsats: Denna studie undersökte Q-markörer för CH baserat på förhållandet mellan spektrum och effekt, och gav referensinformation för dess farmakologiska substansgrund och förbättring av kvalitetsstandarden.

Nyckelord:Cistanches Herba; Q-markör;spektrum-effekt förhållande; antioxidant

Cistanche deserticola är den torkade köttiga stjälken med fjällande blad av Cistanche deserticola YCMa eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, en växt som tillhör familjen Cistanche deserticola orbaceae. Den är varm till sin natur, söt och salt i smaken; den återgår till njurens och tjocktarmens meridianer; det ger näring till njurens yang, fyller på essens och blod, fuktar tarmarna och laxermedel, och är ett viktigt läkemedel för att tonifiera njuren och fylla på essensen [2-3]. Njurarna lagrar essens, och essens och blod kommer från samma källa. Om essens och blod är bristfälliga kommer det att påverka människokroppens övergripande livsaktiviteter; den essensproducerande märgen lagras i benen, och hjärnan är märghavet. Om njuressensen är otillräcklig kommer benen att förlora sin näring och hjärnan kommer att få brist, vilket resulterar i ben Degenerativa förändringar som lös struktur, tandlossning, minnesförlust, demens och nedsatt immunförsvar [4-6]. Cistanche deserticola innehåller fenyletanoidglykosider, iridoider, lignaner och andra strukturella komponenter, inklusive echinacoside, verbascoside, verbascoside, genipinic acid och 8-epistryanic acid. tubulin A, etc. [7]. Den nuvarande kvalitetskontrollen av Cistanche deserticola i 2020 års upplaga av "Farmkopén för Folkrepubliken Kina" anger endast innehållet av echinacoside och verbascoside, som inte helt kan återspegla multikomponent- och multi-target-verkansegenskaperna hos traditionell kinesisk medicin. , vilket inte bidrar till dess kvalitetskontroll och utvärdering.

För att förbättra kvalitetskontrollnivån för traditionell kinesisk medicin och optimera kvalitetsutvärderingen av traditionell kinesisk medicin, föreslog akademikern Liu Changxiao det nya konceptet med kvalitetsmarkör (Q-markör) för traditionell kinesisk medicin [8]. Bland dem är "effektivitet" kärnelementet i "Fem principer" för Q-markören [9] och är också kärnan i kvalitetsutvärderingen av traditionella kinesiska läkemedel.

Med tanke på den nuvarande forskningsstatusen med dålig korrelation mellan kvalitetsstandarder och läkemedelseffektivitet är det av stor betydelse att utforska Q-markörer för traditionella kinesiska läkemedel och fastställa mer vetenskapliga och rimliga kvalitetsstandarder för att förbättra kvaliteten på traditionella kinesiska läkemedel. Spektrum-effektförhållandet kopplar fingeravtryckstopparna för traditionell kinesisk medicin med specifika farmakodynamiska data för att hitta de effektiva substanserna i traditionell kinesisk medicin, vilket återspeglar den inneboende kvaliteten hos traditionell kinesisk medicin [10]. Etableringen av en matematisk modell för spektral effektivitet kan förtydliga QMarker för traditionell kinesisk medicin ur ett "helhetsperspektiv" perspektiv, vilket ger mer referens för senare kvalitetskontroll av traditionell kinesisk medicin, formulering av kvalitetsstandarder och screening av aktiva ingredienser. Den här studien använder fingeravtryck kombinerat med halvinhiberingshastigheten för reaktiva syrearter (ROS IC50), innehållet av superoxiddismutas (SOD) och katalas (CAT) för att studera spektrum-effektförhållandet för traditionell kinesisk medicin, och använder huvudkomponentanalys (PCA) ), Pearson korrelationsanalys (PCC) och partiell minsta kvadraters regressionsanalys (PLS) för att heltäckande analysera Q-markören för Cistanche deserticola för att ge en grund för dess kvalitetskontroll.

1 material

1.1 Prov

Cistanche deserticola skördades från Yutian County, Xinjiang, och planteringsbasen Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) i Inre Mongoliet. Det identifierades av forskaren Zhang Tiejun från Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight och Cistanche deserticola.

YC Ma, detaljerad information visas i tabell 1.

1.2 Testa medicin

Echinaceaside (batchnummer: 111670-201907, renhet: 91,8 %) och verbascoside (batchnummer: 111530-201914, renhet: 95,2 %) köptes båda från China Institute of Food and Drug Control; isoreskosid (batchnummer: 61303-13 -7), salidrosid (batchnummer: 10338-51-9), 8-epistrychnoic acid (batchnummer: 82509-41-9), genipininsyra (batchnummer: Z24A10X95926) , tuberos B (batchnummer: 112516-04-08), 2-acetyleugenolglykosid (batchnummer: 94492-24-7) köptes från Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., renhet större än eller lika med 98%; Cistanche-glykosid A (batchnummer: MUST -20062806, renhet: 98,51%), floridin A (batchnummer: MUST19110102, renhet: 98,57%) köptes från Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; kromatografiskt ren acetonitril och myrsyra köptes från Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company; Renat vatten (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimetylsulfoxid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company i USA); CellTiter 96® AQueous single solution cell proliferation detection kit (G3580, Promega Company of the United States); CAT-detektion Kitet (S0051), SOD-aktivitetsdetektionskit (S0101M) och ROS-detektionskit (S0033S) köptes från Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrument

Waters H-klass-PDA ultrahögpresterande vätskekromatograf (Waters Company, USA); Sartorius BT25S elektronisk våg (Sartorius Company, Tyskland); H1650 höghastighetsskrivbordscentrifug (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikroplattläsare (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologiskt mikroskop (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 celler

Humana embryonala njurceller HEK 293-celler användes i detta experiment och köptes från den kinesiska vetenskapsakademins cellbank.

2 metoder

2.1 Upprättande av fingeravtryckskarta

2.1.1 Beredning av testlösning: Väg 2 g Cistanche deserticola läkemedel, tillsätt 10 gånger mängden vatten, värm och återlopp 3 gånger, 1 timme varje gång, centrifugera vid 1.0 ×105r·min-1 i 15 minuter (centrifugalradien är 300 mm), kombinera supernatanterna och koncentrera till en stamlösning med en masskoncentration på 100 mg·mL-1, späd den 10 gånger, och filtrera det genom ett 0,22 µm mikroporöst filtermembran för att erhålla det.

2.1.2 Beredning av blandad referenslösning

Ta 8-epistrrychnic syra, salidrosid, echinaceaside, cistanche glykosid A, genipinic acid, verbascoside, antocyanosid A, isorbascosid och 2'-acetyl eugenol. Referensämnen för glykosid och angiosid B mättes i lämpliga mängder och vägdes noggrant. Tillsätt 50 % metanollösning för att lösa upp och förbered en blandad referenslösning med en masskoncentration på 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kromatografiska förhållanden

ACQUITY UPLC®BEH C18 kolumn (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobil fas är acetonitril (A) ~ 0,1% myrsyralösning (B), gradientelueringsprogram (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6~10 min, 8%~15%A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); detektionsvåglängden är 237 nm; flödeshastigheten är 0,4 ml·min –1; kolonntemperaturen är 40 grader; injektionsvolymen är 3 µL.

2.1.4 Val av referenstoppar

I ultra-performance vätskekromatografi (UPLC) kromatogram av Cistanche deserticola valdes toppen med det största toppareaförhållandet, måttlig retentionstid och god separation som referenstopp för fingeravtrycksspektrumet. 2.1.5 Metodologisk undersökning Precisionstest: Ta T1-provet och förbered testlösningen enligt metoden under 2.1.1. Injicera provet 6 gånger kontinuerligt och registrera fingeravtrycket. Resultaten visar att den relativa topparean RSD för varje topp är 0.10%~4.61%. , RSD för den relativa retentionstiden är 0,08%~1,32%, vilket indikerar att instrumentet har god precision.

Repeterbarhetstest: Ta T1-provet och förbered 6 prover av testlösningen parallellt enligt metoden under 2.1.1, och injicera provet kontinuerligt. Resultaten visar att den relativa topparean RSD för varje kromatografisk topp är 1,35%~4,80%, och den relativa retentionstiden RSD är 0,10%~1,80%, vilket uppfyller kraven för fingeravtrycket och visar att repeterbarheten av instrumentet är bra.

Stabilitetstest: Ta T1-provet och förbered testlösningen enligt metoden under 2.1.1, injicera prover för testning vid 0, 2, 4, 8 och 12 timmar och registrera fingeravtrycket. Den beräknade RSD för den relativa topparean för varje kromatografisk topp är 0,53%~4,82%, och RSD för den relativa retentionstiden är 0,09%~2,17%, vilket uppfyller kraven av fingeravtrycket och indikerar att testprodukten är stabil inom 12 timmar.

2.2 Forskning om antioxidanteffekten av Cistanche deserticola

2.2.1 Beredning av Cistanche deserticola moderlut:Ta moderluten under punkt 2.1.1, filtrera och sterilisera och späd den med odlingsmedium till önskad koncentration före användning.

2.2.2 Effekter av Cistanche deserticola och positiv kontroll VE på livsdugligheten för HEK 293-celler

Ställ in den normala gruppen (cellsuspension), administreringsgrupp för Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE-grupp (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), varje Ställ in 6 duplikatbrunnar vid varje koncentration och odling i 24 timmar. Tillsätt 20 µL CellTiter 96® AQueous singellösningsreagens till varje brunn för att detektera cellviabilitet. Fortsätt odla i 2 timmar. Använd en mikroplattläsare för att detektera absorbansvärdet (OD) för varje brunn vid 490 nm. Beräkna cellöverlevnad enligt formel (1). Överlevnadsfrekvens (%)=(OD-experimentgrupp/OD-blankgrupp) × 100 % (1)

2.2.3 Effekt av Cistanche deserticola på ROS inducerad av H2O2 i HEK 293-celler

Cellerna delades in i normal grupp (cellsuspension) och administreringsgrupp för Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL-1 Cistanche deserticola och 60 µm·L-1 H2O2), och odlades i 24 timmar. Följ stegen i ROS-detektionssatsen för efterföljande operationer, observera cellfärgningen direkt genom ett mikroskop och använd en mikroplattläsare för att detektera fluorescensintensiteten för varje grupp. Parameterinställningarna använde en excitationsvåglängd på 488 nm och en emissionsvåglängd på 525 nm. Experimentet upprepades tre gånger.

2.2.4 Effekt av Cistanche deserticola på H2O2-inducerad SOD av HEK 293-celler

Dela upp cellerna i normalgrupp (cellsuspension) och modellgrupp

(60 µm·L–1 H2O2), VE-grupp (60 µm·L–1 VE och 60 µm·L–1 H2O2), administreringsgrupp för Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola och 60 µm·L–1 H2O2), samla upp cellerna efter 24 timmars odling, tillsätt SOD-provberedningslösning för att lysera cellerna, centrifugera vid 4 grader, 12000 r·min-1 i 5 minuter (centrifugalradien är 300 mm), ta supernatanten som provet som ska testas, följ SOD-detektionssatsen Följ stegen nedan. Experimentet upprepades tre gånger.

2.2.5 Effekt av Cistanche deserticola på H2O2-inducerad CAT i HEK 293-celler

Följ metoden under 2.2.4 och gruppadministration, tillsätt lyslösning, centrifugera vid 4 grader, 12000 r·min-1 i 10 minuter (centrifugradien är 300 mm), ta supernatanten och följ stegen i CAT-detektionskit. Uppföljande verksamhet. Experimentet upprepades tre gånger.

2.2.6 Statistisk analys

SPSS 26.0 programvara användes för statistisk analys. Varje grupp av data representerades av (±±(). Envägsanalys av varians utfördes på data som överensstämde med normalfördelningen. Om varianserna var lika användes metoden med minst minst signifikanta skillnader. Om varianserna var ojämna, användes Dunnetts T3-metod GraphPad Prism 8 för att rita grafer, och P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Spectrum-effekt korrelationsanalys av Cistanche deserticola antioxidant

2.3.1 PCA Toppareorna för de vanliga topparna för 10 partier av Cistanche deserticola som har etablerat fingeravtryck standardiserades med Z-värde och gjordes till en 10 × 17 orderdatamatris, som importerades till SPSS 26.0-programvaran för PCA.

2.3.2 PCC Använd SPSS 26.0 för att utföra bivariat analys för att studera det spektrala effektivitetsförhållandet mellan Cistanche deserticola-fingeravtryck och antioxidanter.

Signifikanstestning använder ett tvåsidigt test (T) med P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Importera de experimentella resultaten av Cistanche deserticolas standardiserade topparea och antioxidant till SIMCA-P 14.1-programvaran, ställ in topparean som X-variabeln och ställ in det farmakodynamiska indexet som Y-variabeln för att utföra PLS.

2.4 Cistanche deserticola Q-markör antioxidantaktivitet verifiering

2.4.1 Beredning av aktiv ingrediens moderlut

Väg noggrant upp lämpliga mängder genipininsyra, 8-epistrichnic acid, echinaceaside, verbascoside, isorebascosid och antocyanosid A och tillsätt DMSO för att lösa upp dem i 10 mmol·L–1 för kontroll. produktlösning.

2.4.2 Effekt av aktiva ingredienser på HEK 293 cytotoxicitet

Efter att HEK 293-celler inkuberats i 24 timmar, 100 µL av aktiv ingredienslösningar under punkt 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1) olika koncentrationer sattes till varje brunn och stimuleringen fortsatte. CellTiter 96® AQueous singellösningsreagens tillsattes till cellerna 24 timmar senare för att detektera cellviabilitet.

2.4.3 Antioxidanteffekten av aktiva ingredienser på H2O2-inducerade HEK 293-celler

Celler grupperades enligt följande: normalgrupp, modellgrupp, VE-grupp grupperades som i 2.2.4, experimentgrupp (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktiv ingrediens och 60 µm·L–1 H2O2), odlade i 24 timmar. Bestäm intracellulära ROS-nivåer, SOD- och CAT-enzyminnehåll enligt metoderna under 2.2.3, 2.2.4 respektive 2.2.5.

Supporttjänst från Wecistanche

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop