Kvantitativ bedömning av inflammatoriska infiltrat i njurtransplantationsbiopsier med hjälp av multiplex tyramidsignalförstärkning och djupinlärning

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Abstrakt

Fördröjd graftfunktion (DGF) är en stark riskfaktor för utveckling av interstitiell fibros och tubulär atrofi (IFTA) vid njurtransplantationer. Kvantitativ bedömning av inflammatoriska infiltrater i njurbiopsier av DGF-patienter kan avslöja prediktiva markörer för IFTA-utveckling. I denna studie kombinerade vi multiplex tyramidsignalförstärkning (mTSA) och konvolutionella neurala nätverk (CNN) för att bedöma den inflammatoriska mikromiljön i njurbiopsier av DGF-patienter (n=22) tagna 6 veckor efter transplantationen. Patienterna stratifierades för IFTA-utveckling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Introduktion

Fördröjd graftfunktion (DGF) efter njurtransplantation är multifaktoriell och huvudsakligen relaterad till donatoregenskaper och ischemitid. DGF beskrivs generellt som behovet av dialys inom 7 dagar efter transplantation och är en stark riskfaktor för kronisk njurtransplantatskada [1–3]. En klassisk komponent av kronisk njurskada är närvaron av interstitiell fibros och tubulär atrofi (IFTA). Emellertid går inte alla DGF-patienter vidare till utvecklingen av IFTA, och det komplexa förhållandet mellan DGF och IFTA är fortfarande dåligt förstått. Detta beror först på fördröjningen mellan potentiellt orsakande händelser och funktionell nedgång, och för det andra på de varierande och komplexa effekterna av potentiella inducerare som avstötning och biverkningar av medicinering [1, 4]. Den allmänna förekomsten av inflammation och specifika makrofager har beskrivits i många studier som en prediktor för transplantatförlust [5-8]. De underliggande patologiska processerna är dock inte helt klarlagda, och höga nivåer av inflammation leder inte alltid till långvarig förlust av transplantat. Som ett resultat av miljöstimuli får makrofager specialiserade funktioner och polariseras till olika fenotyper. Många studier tyder på att specifika makrofagsubtyper (alternativt aktiverade makrofager) är involverade i vävnadsremodellering genom att inducera vävnadsreparation eller fibros. Polariseringen mot en vävnadsremodellerande (ibland pro-fibrotisk) fenotyp är känd för att vara beroende av ett brett spektrum av miljöstimuli, bland annat tillhandahållna av T-hjälparlymfocytsubtyper [9-11]. Bedömning av T-hjälparcellpopulationer i transplantatet vid tidpunkten för DGF avslöjade en utbredd T-hjälpare 1-subtyp, men korrelationer till transplantatresultat eller progression till IFTA har inte undersökts hittills [12]. En omfattande bedömning av den inflammatoriska mikromiljön specifikt fokuserad på makrofager och undergrupper av T-hjälparceller i noggrant utvalda patientkohorter kan ge insikt i varför vissa, men inte alla DGF-patienter går vidare till utvecklingen av IFTA.

En omfattande undersökning av inflammatoriska infiltrat hämmas dock av flera (tekniska) begränsningar. Traditionell immunhistokemi (IHC) och immunfluorescenstekniker stöder visualiseringen av endast ett begränsat antal cellmarkörer i en vävnadssektion. Seriell sektionering av små, värdefulla vävnadsfragment såsom njurbiopsier är inte önskvärd och tolkningen av relationer mellan celler i olika sektioner är svår. Dessutom kommer kvantitativ bedömning av de inflammatoriska infiltraten genom visuell uppskattning med en signifikant nivå av interobservatörsvariabilitet [13]. Traditionella bildbehandlingstekniker som pixeltröskelvärde, vattendelar och morfologibaserad segmentering förlitar sig på förkunskaper om alla morfologiska cellrepresentationer och vävnadsfärgningsintensitet genom en datamängd [14-16]. Därför saknar dessa metoder ofta robusthet för biologiska och tekniska bildvariationer och översätts dåligt till nya eller externa datamängder. Framväxten av digital patologi har påskyndat utvecklingen av alternativa metoder för bedömning av helbildsbilder (WSI) [17, 18]. Modeller för djupinlärning, specifikt faltningsneurala nätverk (CNN) har visat sig vara kapabla att segmentera och detektera relevanta biologiska strukturer i histopatologiska bilder [19-23]. Dessa tekniker har potential att gå från subjektiv visuell uppskattning och traditionell bildbehandling till exakt, objektiv och reproducerbar celldetektering.

Syftet med denna studie är att utveckla en metod för objektiv, kvantitativ bedömning av multipla inflammatoriska cellmarkörer, som kringgår behovet av omfattande seriell sektionering av objektglas. För att göra det kombinerar vi multiplex IHC, multispektral avbildning och modeller för djupinlärning. För att demonstrera tillämpbarheten av dessa tekniker studerar vi korrelationerna mellan den inflammatoriska mikromiljön, kvantifierad av djupinlärningsmodeller, med utvecklingen av IFTA i övervakningstransplantatbiopsier av DGF-patienter.

cistanche-extrakt som behandlar njursjukdomar

Material och metoder

För att bedöma den inflammatoriska mikromiljön i njurbiopsier av DGF-patienter utförde vi multiplex IHC på övervakningsbiopsier tagna 6 veckor efter transplantation. Patienterna stratifierades för IFTA-utveckling (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vävnadsprover

Vi använde övervakningsbiopsier från njurtransplanterade mottagare vid Hannover Medical School (Hannover, Tyskland), förvärvade inom ramen för ett prospektivt övervakningsbiopsiprogram. Inklusionskriterier var: DGF-förekomst (definierad som<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA-bedömning

Omfattningen av interstitiell fibros (ci) och tubulär atrofi (ct) (IFTA) vid 6 veckor och 6 månader, uttryckt med Banffs lesionsgraderingssystem [24] erhölls från patologirapporten. För att bedöma sambandet mellan tidiga inflammatoriska infiltrater och IFTA-utveckling mer i detalj, digitaliserades alla PAS-färgade objektglas för ny granskning med en Pannoramic 250 Flash II digital diasscanner (3DHistech, Ungern) med en 20 × objektiv med en upplösning på 0,24 μm/pixel. PAS WSI för båda tidpunkterna (6 veckor och 6 månader) poängsattes för omfattningen av IFTA (procentandel av ytan, med 10 procents intervall) av tre njurpatologer. Patologernas genomsnittliga IFTA-poäng användes som ett slutresultat för att beräkna förändringen i IFTA mellan 6 veckor och 6 månader efter transplantationen. Patienterna stratifierades efter en absolut ökning av IFTA-poäng på 10 procent eller mer (n=13) och ingen eller<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Dessutom jämfördes Banff-lesionspoängen mellan tidpunkter med Wilcoxon signed ranks test. Detta avslöjade signifikanta skillnader mellan 6 veckors och 6 månaders biopsier för Banff-kategorierna ti (p=0.017), ci (p=0.004) och ct (p=0.011) .

Multiplex TSA-färgning

Vi utförde multiplex IHC med hjälp av mTSA för att visualisera flera cellmarkörer i biopsierna på 6 veckor. Efter inkubation med en primär och sekundär antikropp behandlades vävnaden med fluorescensmärkt tyramid. Pepparrotsperoxidaset från den sekundära antikroppen katalyserar bildningen av aktiva tyramidradikaler. Tyramidradikalerna binder kovalent till tyrosinresterna på antigenet. Denna permanenta bindning möjliggjorde värmeinducerat avlägsnande av det primär-sekundära antikroppskomplexet samtidigt som den fluorescerande tyramidavlagringen bevarades [25]. Detta möjliggjorde den efterföljande successiva inkubationen med ytterligare antikroppar från samma art mot målantigenerna.

mTSA utfördes på två på varandra följande objektglas från 6 veckors övervakningsbiopsier. Vi utvecklade två mTSA-paneler för att bedöma den inflammatoriska infiltraten och den peritubulära kapillären i våra patientgrupper. Panel I bestod av anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 och CD34 antikroppar. Panel II användes för att undersöka T-hjälparcellen och makrofagpolariseringen genom att använda anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 och CD163 antikroppar. Antikroppsspecifikationer, utspädningar och färgningsordningar listas i tilläggstabell 1. Alla objektglas deparafiniserades i xylen, dehydrerades i 95 procent etanol, tvättades i kranvatten och kokades för epitopåtervinning i 10x utspädd trisborat-EDTA (TBE) 0658, VWR Life Sciences, USA) buffert. Efter nedkylning tvättades objektglasen i 3 procent väteperoxidaslösning för endogen peroxidasblockering och tvättades med en trisbuffrad saltlösningsbuffert med 0,05 procent Tween 20 (822184, Merck KGaA, Tyskland) (TBS-T). Proteinblockering utfördes med användning av TBS-T med 1 procent bovint serumalbumin (BSA) (mTSA steg 1). Primära antikroppar inkuberades i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid fyra grader Celsius (mTSA steg 2). Efter tvätt i TBS-T inkuberades objektglasen med en HRP-konjugerad sekundär antikropp (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nederländerna) i 30 minuter vid rumstemperatur (mTSA steg 3). Därefter utfördes TSA med Opal TSA-fluoroforer från en Opal 7-färgmanual IHC-kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) (mTSA steg 4) (fluoroforer och deras motsvarande antikroppar listas i tilläggstabell 1). Antikropp-TSA-komplexet avlägsnades med en kokningscykel i TBE-buffert (mTSA steg 5). mTSA steg 1–5 upprepades tills objektglasen färgades med alla antikroppar från den berörda panelen. Objektglasen täcktes med fluoromount-G med DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplex TSA-validering

Upprepade kokningscykler kan påverka målepitopaffiniteten. Vissa antikroppar visar ett svagare färgningsmönster efter att vävnaden har kokats flera gånger, andra antikroppar behöver fler kokcykler för att uppnå optimal färgningsintensitet, och andra påverkas inte alls. Vi bedömde denna effekt för alla antikroppar med hjälp av kromogen IHC på FFPE-kontrolltonsilvävnad. För varje testad antikropp (n=9) skars sex sektioner (4 μm tjocka). Alla objektglas deparafiniserades i xylen, dehydrerades i 95 procent etanol, tvättades i kranvatten och kokades för epitopåtervinning i 10x utspädd TBE (kokningscykel ett). Efter nedkylning lagrades ett objektglas per testad antikropp i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). De återstående objektglasen kokades igen. Denna cykel upprepades fem gånger. Alla objektglas tvättades därefter i 3 % väteperoxidaslösning och följdes av sköljning i PBS. Primära antikroppar (kompletterande tabell 1) inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur. Efter inkubation tvättades objektglasen i PBS. Objektglas färgade med anti-CD68-, Tibet- och GATA3-antikroppar krävde ytterligare en inkubation med post-antikroppsblockering (PAB) i 15 minuter (VWRKDPVB-blockering, Immunologic, Nederländerna). Efter inkubation tvättades objektglasen i PBS och inkuberades med en HRP-konjugerad sekundär antikropp (efter PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nederländerna, för andra, se tilläggstabell 1 för sekundär antikropp). Visualisering utfördes med användning av 3,3'-diaminobensidin (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nederländerna). Resultaten visualiseras i tilläggsbild 1. Baserat på dessa resultat bestämde vi den optimala antikroppsordningen för mTSA-experimenten, enligt listan i tilläggstabell 1.

Om epitoper av intresse är samlokaliserade kan tyramidavlagringarna störa varandra. För att testa för denna steriska hämning använde vi tonsillkontrollvävnadsglas och färgade dessa med våra mTSA-paneler. Antikroppsuttrycket i mTSA jämfördes med det i enkelfärgade objektglas, som gick igenom samma antal kokcykler. Vi observerade inga skillnader i färgningsmönster mellan de enkel- och multiplexfärgade objektglasen (exempel inkluderade från panel I, kompletterande figurer 2 och 3). Alla primära antikroppar i mTSA användes i samma spädning som användes för kromogen IHC. Intensiteten hos den fluorescerande signalen optimerades genom att justera utspädningarna av TSA-lösningen.

Multiplex TSA-avbildning

Multispektral avbildning utfördes med ett Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) med ett 20x objektiv, med en upplösning på 0,49 μm per pixel, och med DAPI, FITC, CY3, Texas Red och Cy5 spektralkuber. Vectra-systemet tillåter manuellt val av regioner för multispektral insamling, som sedan delas upp av systemet i brickor (Fig. 1.1). Spektra för autofluorescens och alla Opal TSA-fluoroforer var förinspelade i ett spektralt "bibliotek" med hjälp av Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektralbiblioteket gjorde det möjligt att sönderdela multiplexbrickan till flera enkla brickor som representerade bidraget från varje fluorofor ("unmixing"). Detta resulterade i monokroma, flerkanaliga plattor, där varje kanal motsvarade en enda fluorofor och därmed antikropp (Fig. 1.2).

Konvertering till artificiellt ljusfält IHC

Baserat på lagrade koordinater syddes brickorna för att skapa en flerkanalig WSI med hjälp av ett anpassat python-skript (Fig. 1.3). Kanalerna som representerar DAPI-signalen (IDAPI) och kanalerna som representerar en av antikropparna (IIHC) omvandlades till artificiell hematoxylin- respektive DAB-färgning (fig. 1.4 och 1.5). Baserat på känt kromatiskt hematoxylin och DAB Cx, Cy-koordinater efter transformation av nyans-mättnad-densitet (HSD) förvärvades fläckvektorer i tidigare studier [26, 27]. Dessa färgningsvektorer användes för att beräkna röd-grön-blå värden för det artificiella ljusfältet IHC (Fig. 1.5), som:

med CR, st ljusabsorptionen av färgst i den röda delen av spektrumet. Värden för B och G beräknades på liknande sätt.

Bildanalys

Regioner av intresse (ROI)

Regioner av intresse (ROI) kommenterades för varje fall i kohorten med hjälp av den automatiska bildanalysplattformens programvara (ASAP; version 1.9, tillgänglig som öppen källkod på GitHub). Dessa ROI bestod av kortikalt tubulointerstitium, vilket utesluter kapseln, glomeruli och artärerna. Eftersom inflammation i renala subkapsulära regioner anses ospecifik i transplantationspatologi, analyserades biopsierna i denna studie primärt exklusive subkapselregionen (definierad som 400 µm under kapseln). Sekundärt upprepade vi analyserna inklusive den subkapsulära regionen. Visuella exempel på ROI finns i tilläggsbild 4.

Lymfocytdetektering CNN I

De artificiella ljusfälts-IHC-bilderna som representerar CD3-, CD4-, CD8- och CD20-färgning analyserades med hjälp av en befintlig CNN med en U-Net-arkitektur [22, 28]. Detta nätverk var speciellt designat för detektion av cytoplasmatiska lymfocytmarkörer i IHC. CNN-prestanda kan uttryckas i precision, återkallelse och en F1--poäng, där:

CNN uppnådde en precision på {{0}}.76, ett återkallande av 0.79 och ett F1-poäng på 0}.78 på testsetet som användes i originalpapperet, bestående av traditionell IHC WSI. Detektering av individuella positiva celler kräver tröskelvärde för CNN-utgången, följt av efterbearbetning. Eftersom CD3-färgningen i mTSA-panelen var starkare jämfört med CD4, CD8 och CD20 användes en lägre objektdetektionströskel för de tre sistnämnda (0,4) och den ursprungliga objektdetektionströskeln för CD3 (0,7). För att bedöma CNN-prestandan på det artificiella ljusfältets IHC WSI i denna studie, användes fyra artificiellt ljusfälts IHC WSI (CD8 och CD20 från två patienter) som en testuppsättning i denna studie. Punktkommentarer (n=1115) genererades med ASAP-programvara. Efter applicering av nätverket beräknades precision, återkallelse och F1--poäng för att bedöma CNN-prestanda. Detektioner ansågs vara sanna positiva om de hittades inom 4 µm (genomsnittlig lymfocytdiameter) från en marksanteckning. När två detektioner hittades inom ett 4 µm-intervall ansågs endast detektionen som var närmast annoteringen som sann positiv. Därefter användes lymfocytdetektering CNN I för analys av alla artificiella ljusfälts-IHC WSI representerande cytoplasmatiska lymfocytmarkörer (CD3, CD4, CD8 och CD20).

Lymfocytdetektering CNN II

Analysen av artificiellt ljusfält IHC WSI med nukleära färgningsmönster (som presenteras av T-bet och GATA3) kanaler som representerar DAPI och CD4 valdes ut för att kombineras i en WSI (4). Färgvektorer som förvärvats i tidigare studier användes för att artificiellt färga DAPI-signalen blå (hematoxylin) och CD4-signalen brun (DAB), vilket resulterade i ett artificiellt ljusfält IHC WSI (5).

krävs utbildning, validering och testning av ett nytt CNN. För detta ändamål skars nio objektglas från njure, tonsiller och appendix FFPE kontrollvävnad. Dessa objektglas IHC-färgades med anti-Tibet (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) och anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nederländerna) antikroppar. Objektglasen digitaliserades med en Pannoramic 250 Flash II digital diabildskanner med en upplösning på 0,12 μm/pixel. Två observatörer producerade 5726 punktkommentarer över olika regioner med ASAP-programvara. Anteckningar från fem bilder användes för att träna en U-Net-arkitektur CNN med patchar på 256 × 256 pixlar med en pixelstorlek på 0,49 μm/pixel. Två WSI användes för validering av CNN och för att bestämma objektdetektionströskeln (0,4). CNN-prestandan på traditionella IHC WSI bedömdes på ett undanhållet testset med två IHC WSI. CNN-prestanda på artificiellt ljusfält IHC WSI bedömdes på en sekundär testuppsättning bestående av fyra artificiella ljusfälts IHC WSI (Tibet och GATA3 från två patienter) med 1082 punktkommentarer. Precision, återkallelse och F1-poäng beräknades för att bedöma prestandan på båda testseten. Detektioner ansågs vara sanna positiva om de hittades inom 4 µm från en marksanningsanteckning. När två detektioner hittades inom ett 4 µm-intervall ansågs endast detektionen som var närmast annoteringen som sann positiv. Därefter användes lymfocytdetektering CNN II för analys av alla artificiella ljusfält IHC WSI som representerar nukleära (lymfocyt) markörer (Tibet och GATA3).

Makrofagdetektering CNN

I motsats till lymfocytdetektion är identifieringen av enskilda makrofager inte entydig. Speciellt i klustrade scener kan en betydande nivå av observatörsvariabilitet förväntas. Därför användes ett mycket större antal fall och mänskliga anteckningar för att träna en dedikerad, tredje CNN för detektering av CD68 plus och CD163 plus makrofager. IHC-färgade objektglas (n=111) från naturlig och transplanterad njurvävnad samlades in. IHC-färgningar utfördes med anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danmark eller klon KP1, M0876, Dako, Danmark) eller anti-CD163 (klon MRQ -26 eller 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antikropp. IHC-bilderna digitaliserades med hjälp av en panoramisk 250 Flash II-digital diabildskanner eller en Aperio AT2 Slide Scanner (Leica Biosystems, Wetzlar, Tyskland) med en upplösning på 0.24 eller 0 .25 μm/pixel, respektive. Fyra observatörer producerade 37 709 punktkommentarer över flera ROIs i WSI:erna, med hjälp av ett protokoll för makrofagannotering, som man kom överens om efter inledande pilotexperiment. Anteckningarna från 101 bilder användes för att träna en YoloV2-arkitektur CNN [29]. Yolo är speciellt lämpad för uppgifter som syftar till detektionsuppgifter. Nätverket, bestående av sju faltningslager, tränades på patchar på 256 × 256 pixlar extraherade med en upplösning på 0,98 μm/pixel med begränsningsrutor på 21 μm (baserat på genomsnittlig makrofagstorlek). Tio WSI användes för validering av CNN och för att bestämma objektdetektionströskeln (0,45) och icke-maximala undertryckningsparametrar (0,05). CNN-prestandan på traditionell IHC WSI bedömdes på ett undanhållet testset med tio IHC WSI. CNN-prestanda på artificiellt ljusfält IHC WSI bedömdes på en sekundär testuppsättning bestående av fyra artificiella ljusfälts IHC WSI (CD68 och CD163 från två patienter) med 1033 punktkommentarer. Precision, återkallelse och F1-poäng beräknades för att bedöma prestandan på båda testseten. Detektioner ansågs vara sanna positiva om de hittades inom 21 µm (genomsnittlig makrofagdiameter) från en marksanningsanteckning. När fler detektioner hittades inom ett 21 µm-intervall ansågs endast detektionen som var närmast annoteringen som sann positiv. Därefter användes makrofagdetekteringen CNN för analys av alla artificiella ljusfält IHC WSI representerande makrofagmarkörer (CD68 och CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dubbel positivitet

Cellernas positivitet för två markörer (dubbel positivitet) bedömdes genom att bestämma antalet pixlar mellan celldetektering i de olika kanalerna. Om avståndet mellan två lymfocytdetektioner var<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Cellantal beräknades inuti ROI, och celldensiteter baserades på cellantal och arean för den kommenterade ROI.

Rumsliga relationer

Automatiserad celldetektering i WSI möjliggör undersökning av rumsliga relationer mellan celler. Det genomsnittliga kortaste avståndet bestämdes (i regioner exklusive den subkapsulära regionen) för CD68 plus-celler och CD3 plus-, CD3 plus CD8 plus- och CD20 plus-celler i WSI för panel I för båda patientgrupperna och mellan CD163 plus-celler och CD4 plus , CD4 plus Tbet plus och CD4 plus GATA3 plus i WSI för båda patientgrupperna.

Peritubulär kapillär utsträckning

För att bedöma den peritubulära kapillärutbredningen analyserades oblandade WSI som representerar CD34-kanalen i Fiji (ImageJ version 2.0.0, USA, makron och plugins: "Open and Duplicate", "ASAP ROI Reader") [30]. Positiva pixlar bestämdes via automatisk tröskelvärde och uttrycktes därefter som procentandelen av det totala antalet pixlar inuti ROI.

Statistisk analys

Tätheterna för följande cellpopulationer beräknades i biopsierna på 6 veckor: T-lymfocyter (CD3 plus ), cytotoxiska T-lymfocyter (CD3 plus CD8 plus ), B-lymfocyter (CD20 plus ), makrofager (CD68 plus , panel I och II), polariserade makrofager (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), T-hjälpare 1-lymfocyter (CD4 plus Tbet plus) och T-hjälpare 2-lymfocyter (CD4 plus GATA3 plus). Spearmans korrelationskoefficienter beräknades för att bedöma om en korrelation fanns mellan T-hjälpare 1 och T-hjälpare 2 lymfocytdensitet (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) och polariserad makrofagdensitet (antingen CD68 plus CD163 plus eller CD163 plus). Vi observerade CD68-signal (fluorofor 540 nm) i de artificiella CD4 (fluorofor 520 nm) IHC:erna av en panel I. Därför rapporterar vi dessutom celldensiteterna för CD3 plus CD8−celler. För att bedöma skillnader mellan patientgrupper med olika IFTA-utfall rapporterar vi median-, lägsta- och maximala celldensitetsvärden per grupp. Signifikanta skillnader i celldensitet och peritubulär kapillärutbredning (definierad som CD34-positiv pixelprocent) mellan grupper utvärderades med Mann–Whitneys U-test för oberoende prover. Huruvida patienter med olika IFTA-utfall visar signifikant olika CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus cellförhållanden, bedömdes med hjälp av ett t-test för oberoende prover. Skillnader mellan patientgrupper i rumsliga relationer mellan CD68 plus- och CD163 plus-celler med andra immunceller bedömdes med avseende på signifikans med hjälp av Mann–Whitneys U-test för oberoende prover.

Resultat

CNN-baserad detektion av IHC-positiva celler

För att tillämpa befintliga CNN, som ursprungligen utvecklades för ljusfältsmikroskopi, omvandlades mTSA-fluorescensbilder till artificiella ljusfältsbilder. Exempel på mTSA-färgade regioner med deras motsvarande artificiella ljusfälts-IHC-bilder ingår i fig. 2. Ett exempel på ett artificiellt ljusfälts-IHC WSI visas i tilläggsbild 4. WSI:erna med flera upplösningar kan öppnas och ses i digital bildvisning programvara som ASAP och Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Som visualiseras i fig. 2 var det artificiella ljusfältet IHC WSI lämpligt för automatiserad analys av CNN:er som ursprungligen utvecklades för traditionell IHC WSI.

Tre CNN användes för den kvantitativa bedömningen av inflammatoriska celler i de 6 veckorna mTSA-färgade transplantationsbiopsierna: för lymfocytdetektion med cytoplasmatisk (CNN I) och nukleär (CNN II) IHC-färgning och för makrofagdetektion. Tabell 2 visar CNN-prestanda (precision, återkallelse och F1-poäng) för uppsättningar av både DAB-färgade IHC WSI och artificiella ljusfälts IHC WSI:er. CNN:s prestanda var vanligtvis lika bra som eller bättre än baslinjen CNN som beskrevs tidigare (med ett F1-poäng på 0.78), som visade sig ha prestanda jämförbar med erfarna manuella observatörer [22] . Medan lymfocytdetekteringen CNN II visade något reducerad prestanda på virtuella ljusfältsbilder jämfört med de verkliga DAB-bilderna (på vilka CNN tränades), observerades motsatsen för CNN för makrofagdetektion.

Ett exempel på en framgångsrik automatisk dubbelpositivitetsbedömning finns i fig. 3.

Korrelation mellan olika celltyper

Den starkaste korrelationen observerades mellan CD4 plus GATA3 plus celldensitet och CD163 plus celldensitet (Spearmans koefficient 0.75, p < 0.001)="" i="" 6="" veckors="" biopsi="" (kompletterande="" fig.="" 5a).="" denna="" korrelation="" var="" svagare="" mellan="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celldensitet="" och="" cd163="" plus="" celldensitet="" (spearmans="" koefficient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (kompletterande="" fig.="" 5b)="" .="" när="" cellpopulationen="" begränsades="" till="" dubbelpositiva="" makrofager="" (cd68="" plus="" cd163="" plus="" ),="" var="" spearmans="" korrelationskoefficient="" 0.65="" (p="">< 0.01)="" med="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" celler="" och="" 0.66="" (p="">< 0.01)="" med="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" celler="" (kompletterande="" fig.="" 5c,="" d).="" att="" inkludera="" den="" subkapsulära="" regionen="" i="" analyserna="" förändrade="" inte="">

Jämförelse av inflammatoriska infiltrat mellanpatienter som utvecklas till IFTA jämfört med icke-IFTA

Patienter som utvecklades till IFTA efter 6 månader visade signifikant högre CD163 plus celltätheter i biopsierna som togs 6 veckor efter transplantation (median 505 celler/mm2) jämfört med patienter som inte utvecklades till IFTA (median 370 celler/mm2; p=0 .043) (tabell 3). Inkludering av den subkapsulära regionen resulterade i en liten minskning av denna effekt (p=0.051). CD68 och CD4 användes i båda panelerna. Objektglas färgade med mTSA-panel I visade mer CD68-positivitet än objektglasen färgade med mTSA-panel II. CD4-celldensiteten är högre i mTSA-panel II jämfört med mTSA-panel I (tabell 3).

Den peritubulära kapillärutbredningen var liknande i 6 veckors biopsier av DGF-patienter med olika IFTA-utfall (tabell 3), både när man exkluderade (p=0.74) och inklusive (p=0}.90) den subkapsulära regionen från/i analysen.

Bedömning av CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus cellkvoter visade ett signifikant högre förhållande hos patienter med<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Det genomsnittliga kortaste avståndet från CD68 plus celler till CD3 plus , CD3 plus CD8 plus och CD20 plus celler (panel I) och från CD163 plus celler till CD4 plus , CD4 plus Tbet plus och CD4 plus GATA3 plus celler (panel II) gjorde inte skiljer sig nämnvärt mellan patientgrupper. Resultaten visas i fig. 4.

Cistanche-extrakt: förbättra njurfunktionen och fysisk styrka

Diskussion

I den här studien utvecklade vi en metod för korrekt och objektiv kvantifiering av inflammatoriska cellinfiltrat i transplantatbiopsier av njurtransplanterade patienter med DGF som kringgår omfattande seriell skärning av njurbiopsimaterial. För detta ändamål kombinerade vi multiplex IHC, tyramidsignalförstärkning, multispektral avbildning och kvantifiering av CNN. Vi var de första att konvertera multispektrala data till en enda artificiell kromogen bild per cellmarkör, vilket underlättade WSI-analys och tillämpning av CNN:er designade för IHC i ljusfält. Vi designade två nya CNN för detektering av kärnfärgade lymfocyter och makrofager och visade generaliserbarheten hos CNN:er utvecklade på traditionell IHC WSI till artificiellt ljusfält IHC WSI. Tillämpligheten av vår metod visades genom att använda de kvantitativa resultaten som erhållits av CNN för att studera korrelationer av den inflammatoriska mikromiljön i 6 veckors biopsier av DGF-patienter med utveckling av IFTA 6 månader efter transplantation.

Vi använde en kommersiellt tillgänglig manuell färgningskit för multiplex IHC för att visualisera immunceller och peritubulära kapillärer i övervakningsbiopsier erhållna 6 veckor efter transplantation. Multiplexfärgningsproceduren bestod av flera tvätt-, inkubations- och vävnadskokningssteg och involverade flera reagenslösningar. Omfattande metodvalideringar och kvalitetskontroller är därför av stor betydelse, och användningen av specifika antikroppar som ger konsekvent färgningsintensitet rekommenderas. Trots de utförda valideringsstegen sågs makrofagliknande färgningsmönster i CD4-kanalerna på objektglas från mTSA-paneler I och II. CD4- och CD68-färgningscykler utfördes inte i följd, så detta fenomen kunde inte orsakas av ofullständig strippning av CD68-antikroppen (kompletterande tabell 1). Även om sällsynta förekomster av makrofager dubbelpositivitet med CD4 har beskrivits [31], ligger en mer rimlig förklaring i närheten av fluoroforernas emissionsspektra som användes för CD4 (520 nm) och CD68 (540 nm) visualisering, båda täckta genom FITC-filtrerkuben i fluorescensmikroskopet. Detta kan orsaka "blödning" av den starka CD68-signalen in i CD4-kanalen. Mycket av denna signal uteslöts från analys i panel I eftersom endast CD4 plus-celler som var dubbelpositiva med CD3 användes för allmän T-hjälparcellsanalys. Icke desto mindre bestämde vi oss för att indirekt utvärdera allmänna T-hjälparceller också, genom att använda CD3 plus CD8− som ersättning. I panel II användes CD4 enbart i kombination med Tibet och GATA3, vilket begränsar risken för användning av falskt positiva detektioner.

Lägre CD68-positivitet observerades i panel II jämfört med panel I. Vi antar att detta är resultatet av sterisk hämning av tyramidavsättning som tillhör CD163 ("paraplyeffekt") [32]. Vi observerade signifikant fler CD163-positiva celler i den studerade kohorten än i tonsillvävnad som användes för att kontrollera sterisk hämning, vilket möjligen förklarar varför denna effekt inte upptäcktes under valideringen.

Multiplex IHC har kombinerats med multispektral avbildning för undersökning av tumörmikromiljön i flera onkologiska studier, och nyligen även för analys av njurallotransplantatavstötning [33–35]. För att extrahera bidraget från alla markörer i mTSA-objektglas avbildas sektioner med ett Vectra-system eller ett liknande fluorescensmikroskop med en multispektral uppställning. Efter att ha spelat in en översiktsbild med låg förstoring delar Vectra-systemet in vävnaden i brickor och skannar automatiskt brickorna multispektralt. Detta resulterar i bildrutor med flera bidragande spektra. Eftersom spektra för de enkla fluoroforerna är kända från det förinspelade spektrala "biblioteket", är det möjligt att sönderdela multiplexbrickorna till flera enkla brickor som representerar bidraget från varje fluorofor ("unmixing"). I de flesta studier analyseras de oblandade bilderna därefter med kommersiell programvara. I många fall stöder dessa program inte WSI-analys, har svårt att analysera klustrade celler och är ofta inte motståndskraftiga mot artefakter och färgningsvariationer. Genom att konvertera de oblandade brickorna till artificiella ljusfälts-IHC WSI:er kunde vi tillämpa en befintlig CNN speciellt designad för lymfocytdetektering i IHC [22] (kallad lymfocytdetektion CNN I). Detta nätverk kan upptäcka individuella och klustrade lymfocyter med hög noggrannhet samtidigt som det är motståndskraftigt mot bakgrundsfärgning (Fig. 2, CD3). Dessutom tränade vi två nya CNN för detektion av celler med nukleära färgningsmönster (Tibet, GATA3) (lymfocytdetektering CNN II) och för detektion av makrofager. Makrofager är notoriskt svåra att upptäcka på grund av deras spridda färgningsmönster. Makrofagdetekteringen CNN tränades därför med hjälp av kommentarer från fyra olika experter. Innan anteckningarna gjordes planerades flera möten där kriterierna för att kommentera makrofager diskuterades och utvärderades. Detta resulterade i ett nätverk som kan detektera makrofager på ett reproducerbart sätt samtidigt som det är robust för icke-specifik färgning (tabell 2, fig. 2 och kompletterande fig. 6). Såvitt vi vet är detta den första algoritmen för makrofagdetektion i skannade histopatologiska sektioner. Vi testade prestandan för alla tre nätverk på en testuppsättning bestående av traditionell IHC WSI (liknande de som används under träning) och på en sekundär testuppsättning som bestod av artificiellt ljusfälts-IHC WSI, genererat från de multispektralt inspelade bilderna. Alla CNN:er visar mycket bra prestanda på de primära testseten och liknande F{11}}poäng på de sekundära testseten. Prestandamåtten för lymfocytdetektering CNN I beräknades på normal vävnad, artefakter och cellkluster. Det artificiella ljusfältets IHC i det andra testsetet innehöll inga vävnadsartefakter och färre cellkluster. Detta kan förklara den övergripande bättre prestandan för detta nätverk på den andra testuppsättningen. Makrofagdetekteringen CNN tränades och testades på anteckningar från fyra olika annotatorer. Även om anteckningskriterier diskuterades särskilt, observerades variationer i annoteringsstil ändå. CNN:s känslighet ligger därför förmodligen någonstans mitt i ytterligheterna i annoteringsstilen. Anteckningarna för den andra testuppsättningen genererades av en annotator, som till synes matchade CNN-känsligheten.

Genom att använda de beskrivna CNN:erna kunde vi undersöka det inflammatoriska infiltratet med oöverträffad noggrannhet i en unik serie av noggrant utvalda tidiga övervakningsbiopsier av transplanterade patienter med DGF.

Tyvärr var flera prover tvungna att uteslutas från analys, mestadels på grund av otillräcklig kvarvarande vävnad efter diagnostisk upparbetning. Även med den begränsade storleken på datamängden fann vi signifikant högre CD163 plus celldensiteter i biopsier av DGF-patienter som utvecklats till utvecklingen av IFTA, vilket är i linje med den potentiellt profibrotiska rollen för dessa celler [11]. Även om den observerade trenden överensstämde med publicerade data, kunde vi inte bekräfta den skadliga effekten av den tidiga närvaron av CD68 plus makrofager som tidigare har rapporterats för andra njurtransplanterade patientgrupper [7, 36, 37]. Vi fann en positiv korrelation mellan tätheterna av CD4 plus GATA3 plus celler och CD163 plus celler, vilket kan bekräfta bidraget från T-hjälpare 2 lymfocyter mot en pro-fibrotisk mikromiljö. Även om inga nya prediktiva biomarkörer för IFTA-utveckling hos DGF-patienter upptäcktes i denna studie, utvecklade vi framgångsrikt metoder för noggrann, reproducerbar och skalbar bedömning av inflammatoriskt infiltrat i gles vävnad som transplantationsbiopsier. Dessa metoder är värdefulla för framtida kvantitativa studier av inflammation i histopatologisk vävnad.

För att lindra adrenal trötthet med cistanche, klicka här för att få mer information

Datatillgänglighet

Samarbetsförfrågningar som involverar användning av data som presenteras i denna studie kan riktas till motsvarande författare (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) eller FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Erkännanden

Vi tackar Mark Gorris och Kiek Verrijp för deras råd om mTSA-färgning och bildbehandling, Merijn van Erp för att utveckla anpassad ImageJ-funktionalitet, och Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg och Martijn Otten för att ha genererat grundsanning för makrofagdetektionsnätverket. Dessutom tackar vi Irina Scheffner för hennes hjälp med den kliniska datainsamlingen.

FörfattarbidragMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH och JAWML

utformade studien. Patientmaterial och kliniska data samlades in och tillhandahölls av JS, WG och FF. FF samordnade de insatser som utfördes på MHH. JHB, EJS och JK fick PAS-sliden för IFTA-procent. MH utförde mTSA-färgningar, valideringar av panel I och II och avbildning och omblandning av panel I. VV-avbildad och oblandad panel II. DJG utvecklade metoderna för att konvertera mTSA-plattor till artificiellt ljusfält WSI. MH utförde omvandlingarna. ZS-C utvecklade lymfocytdetekterings-CNN och skrev skripten för lymfocytkvantifieringar. JL utvecklade makrofagdetekterings-CNN och skrev skripten för makrofagkvantifieringar. MH utförde cell- och kapillärkvantifieringarna. NSS beräknade cellavstånden. MH, BS, LBH och JAWML analyserade data. MH gjorde figurerna och utarbetade tidningen. Den slutliga versionen av manuskriptet reviderades och godkändes av alla författare.

FinansieringDetta arbete stöddes av ERACoSysMed-initiativet (projekt SysMIFTA) som en del av EU:s ramprogram Horizon 2020 som erbjuds av ZonMw (bidrag nr. 9003035004), med samfinansiering av det tyska ministeriet för forskning och utbildning (BMBF), anslag nr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) och FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML fick konsultarvoden från Philips (Nederländerna) och bidrag från

ContextVision, Philips (Nederländerna) och Sectra (Sverige), utanför det inlämnade arbetet. JK fick finansiellt stöd från Dutch Kidney Foundation (projekt DEEPGRAFT, anslag nr 17OKG23).

Efterlevnad av etiska standarder

IntressekonfliktFörfattarna deklarerar inga konkurrerande intressen.

Etiskt godkännande och samtycke till att deltaDatainsamling och analys utfördes med informerat patientsamtycke och med godkännande av etiknämnden (nr 2765) vid Hannover Medical School.

Förlagets anteckningSpringer Nature förblir neutral med avseende på jurisdiktionsanspråk i publicerade kartor och institutionella anknytningar.

Fri tillgångDen här artikeln är licensierad under en Creative Commons Attribution 4.0 internationell licens, som tillåter användning, delning, anpassning, distribution och reproduktion i vilket medium eller format som helst, så länge du ger lämplig kredit till den ursprungliga författaren/författarna ) och källan, tillhandahåll en länk till Creative Commons-licensen och ange om ändringar har gjorts. Bilderna eller annat material från tredje part i denna artikel ingår i artikelns Creative Commons-licens om inte annat anges i en kreditgräns till materialet. Om material inte ingår i artikelns Creative Commons-licens och din avsedda användning inte är tillåten enligt lagstadgade regler eller överskrider den tillåtna användningen, måste du få tillstånd direkt från upphovsrättsinnehavaren.

Referenser

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Försenad graftfunktion vid njurtransplantation. Am J Transplantation. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Riskfaktorer för långvarig transplantatförlust hos njurtransplanterade mottagare med kronisk allograftdysfunktion. Exp Clin Transplantation. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Samband mellan fördröjd graftfunktion och allograft- och patientöverlevnad: en systematisk översikt och metaanalys. Nephrol Dial Transplantation. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Fördröjd njurtransplantatfunktion: från mekanism till translation. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Poängsättning av total inflamation är överlägsen den nuvarande Banff-inflamationspoängen när det gäller att förutsäga utfall och graden av molekylär störning i njurallotransplantat. Am J Transplantation. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Förutsäga efterföljande nedgång i njurallotransplantatfunktion från tidiga övervakningsbiopsier. Am J Transplantation. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Makrofagernas roll i utvecklingen av human renal allograftfibros under det första året efter transplantation. Am J Transplantation. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativt aktiverade makrofager i patogenesen av kronisk njurallotransplantatskada. Barnläkare Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofager plasticitet och interaktion med lymfocytundergrupper: cancer som ett paradigm. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Njurmikromiljöer och makrofagfenotyper bestämmer progression eller upplösning av njurinflammation och fibros. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofager vid organtransplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T-hjälpare 1, 2 och 17 cellundergrupper hos njurtransplanterade patienter med fördröjd transplantatfunktion. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Poängsättning av tumörinfiltrerande lymfocyter: från visuell uppskattning till maskininlärning. Seminarium Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. En bildanalysbaserad metod för kvantifiering av indexparametrar för kronisk allograftskada. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Tillämpa vattendelarealgoritmer för segmentering av klustrade kärnor. Cytometri. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Effektiv cirkulär tröskel. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992– 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. En undersökning om djupinlärning i medicinsk bildanalys. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Bildanalys och maskininlärning i digital patologi: utmaningar och möjligheter. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostisk bedömning av djupinlärningsalgoritmer för detektion av lymfkörtelmetastaser hos kvinnor med bröstcancer. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Deep-learning-baserad histopatologisk bedömning av njurvävnad. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.