Kvantitativ proteomstudie avslöjar fibrinogenväg vid polycystisk leversjukdom Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Resultat
3.1. Njure och lever följer inte samma cystiska mekanismer
Tidigare studier visade att tidig inaktivering av Pkd1-genen (före p12) utlöser snabb utveckling av polycystisk sjukdom (cystiskt fönster), medan inaktivering efter p14 leder till sen cystbildning efter 4–5 månader, med en mild fenotyp (icke-cystiskt fönster) [19]. Med hjälp av samma ortologa modell av ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], undersökte vi om detta fönster för njurutveckling överensstämde i tid med ett liknande fönster för leverutveckling. För att göra en direkt jämförelse med våra tidigare studier [37], inducerades möss med tamoxifen för att inaktivera Pkd1-genen vid postnatala dagar 14 (p14) och 12 (p12) och avlivades vid en ålder av 30 dagar (p30). Intressant nog observerade vi en cystisk fenotyp vid båda tidpunkterna med olika grad av sjukdom (lindrig och svår), vilket tyder på att njuren och levern har oberoende cystiska utvecklingsfönster (Figur 1a) och/eller möjliga olika tidpunkter och progression av sjukdomen . Inga skillnader hittades mellan hanar och honor vid denna slaktålder mellan båda inaktiveringsfönstren (n=6 användes för varje grupp av mutanter). P14-mutantdjuren uppvisade en mildare fenotyp än p12-mutantgrupp med lägre värden på cystiskt index, antal cystor och leverfunktion enligt ALP-serumvärde (Figur 1b–d). Detta är den första studien som visar olika utvecklingsfönster/mekanismer för Pkd1-lever- och njurbrist. Dessa molekylära skillnader måste bestämmas i framtida studier.
Figur 1. Karakterisering av fenotypen av cystisk lever vid dag 30 form p12 och p14 stadier. Pkd1-deletion vid p12 bär en allvarligare cystogenes. (a) Representativa makroskopiska och mikroskopiska bilder av hematoxylin-eosin färgade från lever av Pkd1cond/cond;Tam-Cre mus Wild Type (WT, Pkd1cond/cond;Tam-Cre−) och mutant (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) med Pkdl-gendeletion inducerad av tamoxifen vid postnatal dag 14 (p14-grupp) och 12 (p12-grupp). Alla möss avlivades vid p30. Skalstång, 2 mm (övre panel) 100 µm (nedre panel). n representerar antalet prover per grupp, och Bd betyder gallgång. (b,c) Hepatiskt cystiskt index och antal cystor av de olika fenotyperna. (d,e) ALP- och ALT-värden i blodserum. Staplar representerar medelvärden ± SEM i alla fall. p < 0,05 av Students t-test (tvåsvans) ansågs vara ett signifikant resultat. ns representerar ingen betydelse. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Klicka för att cistanche herba för njursjukdom
3.2. Hagelgevär och SWATH-MS Proteomic Analysis i PLD
Som det hänvisas till i figur 2 utförde vi differentiell proteomanalys vid båda cystiska stadierna (p12 - allvarlig cystisk sjukdom - och p14 - mild cystisk sjukdom -) av mutanter (KO) i jämförelse med vildtypsdjur (WT), för att identifiera och karakterisera relevanta molekylära mekanismer som genomgår levercystogenes och sjukdomsprogression.
Figur 2. Illustrerat arbetsflödesschema. Vi använde en ADPKD murin modell (Pkd1cond/cond; Tam-Cre möss) där den genetiska inaktiveringen av Pkd1 inducerades av tamoxifen administrering på postnatal dag 10 (p10) och p11 (snabb sjukdomsprogression) eller p15 och p16 (fördröjd sjukdomsprogression) ) enligt utvecklingsväxlingen för njurcystogenes, som definierar de två grupperna i studien som heter p12 respektive p14 [19]. För båda grupperna använde vi en n lika med eller mer än sex vildtyps (WT) och mutant (KO) individer i varje tillstånd, och alla djur avlivades vid p30. Vi studerade det differentiella proteomet av WT- och KO-lever i båda svårighetsgraderna av levercystisk sjukdom (Figur 1), med användning av både kvantitativ proteomisk SWATH-MS och hagelgevärsdataberoende DDA-MS-analys. Av proteinerna med en betydande förändring i överflöd använde vi bioinformatik Figur 2. Illustrerat arbetsflödesschema. Vi använde en ADPKD-musmodell (Pkd1cond/cond;Tam-Cre-möss) där den genetiska inaktiveringen av Pkd1 inducerades av tamoxifenadministrering på postnatal dag 10 (p10) och p11 (snabb sjukdomsprogression) eller p15 och p16 (fördröjd sjukdomsprogression) ) enligt utvecklingsväxlingen för njurcystogenes, som definierar de två grupperna i studien som heter p12 respektive p14 [19]. För båda grupperna använde vi en n lika med eller mer än sex vildtyps (WT) och mutanta (KO) individer i varje tillstånd, och alla djur avlivades vid p30. Vi studerade det differentiella proteomet av WT- och KO-lever i båda svårighetsgraderna av levercystisk sjukdom (Figur 1), med användning av både kvantitativ proteomisk SWATH-MS och hagelgevärsdataberoende DDA-MS-analys. Av proteinerna med en betydande förändring i överflöd använde vi bioinformatiska verktyg för att upptäcka nya terapeutiska mål och vägar involverade i sjukdom. Slutligen validerade vi dessa mål med först i silico (DDA vs SWATH-analys) och slutligen in vivo-strategier, såväl som RT-qPCR, Western blotting och immunhistokemi. p betyder postnatal dag
Proteinuttrycksmönster i levercystogenes Först utförde vi proteomisk masspektrometrianalys med hagelgevärsdataberoende förvärv DDA-MS eller DDA. Denna analys gör det möjligt att karakterisera proteomet från kompletta och individuella prover, vilket ger närvaro/frånvaro av proteiner med hög känslighet men utan att tillhandahålla deras kvantifiering. Vi ansåg uteslutande alla proteiner som uttrycks differentiellt i mer än fem oberoende prover från totalt sex prover, för p14- och p12-stadier av vildtyp respektive mutanta individer (Figur S1). Vid p14 identifierades 1 WT-exklusiva (eller nedreglerade för sjukdomen) och 7 MUT exklusiva (uppreglerade) proteiner, medan vid p12 observerades åtta WT-exklusiva och sex MUT-exklusiva proteiner (Figur S1).
Därefter använde vi en metod som gjorde det möjligt för oss att kvantifiera differentiellt uttryckta proteiner. Vi utförde en SWATH-MS kvantitativ proteomisk analys på samma prover som vi använde för DDA, och erhöll ~1500 proteiner per prov och mer än 2000 proteiner i varje studiegrupp. Först utförde vi normalisering av total area summa (TAS) för att utvärdera att våra prover följde ett normalt distributionsmönster, som visas i figurerna S2 och S3. Därefter studerade vi proteinet med signifikanta skillnader mellan vildtyps- och mutantgrupper. Tabell 1 visar proteinerna med en signifikant förändring i överflöd med en tvåfaldig ökning (uppreglerad) eller minskning (nedreglerad) och ett signifikant justerat p-värde (enligt det parametriska Students t-test) i WT vs. MUT-prover vid p14 och p12. Totalt visade sex proteiner signifikanta skillnader i proteinöverflöd mellan WT p14- och MUT-p14-grupperna (fem uppreglerade proteiner och ett nedreglerat protein). Mellan WT-p12 och MUT-p12 visade 26 proteiner (20 proteiner uppreglerade och 6 proteiner nedreglerade) signifikanta skillnader (Figur 3a och Tabell 1). Grafiskt kan dessa variationer observeras genom vulkanplottar, som genererades genom att plotta log(2)-faldiga förändringar för alla proteiner som identifierats mot deras -log(10) p-värde (Figur 3b). Betydande skillnader mellan proteinöverflödsnivåer kan visualiseras i värmekartan med individualiserade värden enligt områdena i spektralbiblioteket och dess klustringsnivå i klustervärmekartaanalysen (figur 3c och S4). Dessa kluster som detekteras av SWATH-MS-analysen hjälper oss att identifiera de kvalitativt separerade proverna som ska beaktas för den kvantitativa analysen (Figur S5). En oövervakad multivariat statistisk analys utfördes med användning av principal komponentanalys (PCA) för att jämföra data mellan prover (Figur S6). Värmekartan och PCA-data visade reproducerbarhet bland provets triplikat eftersom de tre replikaten var nära klustrade i båda analyserna. Vi kan observera både i PCA och i heatmap-klusteranalysen (figurerna S5 och S6) hur vissa prover inte grupperade sig korrekt, överlappande mellan båda klustren. Icke desto mindre kan vi se tendensen att separera data i vildtyps- och mutantkluster. Det lägre antalet proteiner med signifikanta skillnader i p14 vs p12 kan motiveras av olika svårighetsgrad (Figur 2), vilket tyder på att antalet proteiner och vägar ökar baserat på svårighetsgraden och sjukdomsstatusen för den cystiska fenotypen.
3.3. Clustering, Pathway Enrichment och Protein-Protein Interaction Analysis of Gene Expression in PLD
För att fastställa funktionen relaterad till de differentiellt uttryckta proteinerna som identifierats av SWATH-MS-analys, använde vi flera bioinformatiska verktyg och former av analyser. Gene Ontology (GO) termer och väganalyser utfördes med FunRich [39,40], String [41] och Reactome [42]. Proteinerna sorterades i FunRich genanrikningsanalys. När det gäller den biologiska processen var den mest berikade gruppen av proteiner för p14-gruppen (mild cystisk) relaterade till fettsyratransport och prostaglandinbiosyntes, och för p12-gruppen (svår cystisk) med fibrinogen/fibrinaktivitet, cell-cell/matrisadhesion och metabolisk process (Figur 4a, övre panelen). ANXA2 och fibrinogenkomplexet var de två mest berikade cellulära komponenterna i p14- respektive p12-grupper. Dessutom var det extracellulära utrymmet den cellulära komponenten med den högsta andelen proteiner i båda grupperna (Figur 4a, nedre panelen). På liknande sätt etablerades samma analys med stränganalys, som identifierade olika metaboliska processer som den huvudsakliga biologiska processen, och det extracellulära utrymmet som den mest berikade cellkomponenten; överensstämmer med GO-resultat (Figur S7a). Slutligen upprepade vi analysen med Reactome-plattformen och fann att metabolism och immunsystem var de mest berikade vägarna (Figur S7b).
Protein-protein- eller klusteranalys baserad på stränganalys utfördes också för att undersöka möjliga protein-protein-interaktioner (interaktioner med experimentella bevis). Många proteininteraktioner identifierades i olika grupper (Figur S8), men ett kluster vid p14 och ett annat vid p12 var de mest relevanta baserat på antalet interaktioner mellan proteiner och uttrycksnivån (Figur 4b). P14-klustret innehåller annexin A2-protein (ANXA2_P07356) associerat med flera cellulära funktioner, såsom fibrinolys, cellmotilitet (i epitelceller), ett protein relaterat till aktin interaktioner mellan cytoskelett och cell-matris [43], som interagerar med två andra proteiner involverade i den intracellulära lipidtransporten (FABP1_P12710 och FABP5_Q05816). Intressant nog identifierades en annan relevant grupp av proteiner i p12-klustret med en mycket stark protein-protein-interaktion mellan flera fibrinogener (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 och FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogener är involverade i hepatocyttillväxt, och de medierar blodplättsspridning, interstitiell kollagen och fibrotiska lesioner [44]. Dessutom visade sig ytterligare proteiner interagera med fibrinogener (Figur S8), såsom serumamyloid p-komponent (SAMP_P12246), hemopexin (HEMO_Q91X72) eller hydroxisyraoxidas 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). I enlighet med strängresultat var ANXA2 och fibrinogenkomplex också de mest berikade cellulära komponenterna som identifierats av FunRich-analys (Figur 4a). Intressant nog, när vi jämförde data som erhållits genom DDA- och SWATH-analys, bekräftade vi att flera proteiner identifierade av SWATH också identifierades av DDA-analys, inklusive flera relaterade till fibrinogenkomplexproteiner (SAMP/Apcs och S10A9/S100a9; Tabell S3).
3.4. Validering av SWATH–MS-analys avslöjar fibrinogenkomplexet som en ny molekylär mekanism relaterad till PLD
Baserat på dessa data valde vi från SWATH-MS-analysen (Figur S9) de förändrade proteinerna relaterade till fibrinogenkomplexet vid p12- och p14-stadierna för in vivo-validering med RT-qPCR, Western blotting och immunhistokemi, för att fastställa deras bekräftelse som möjligt mål för sjukdomen. Åtta av 1 0 av dessa utvalda proteiner validerades på mRNA-nivå med RT-qPCR (Figur 5); en uppreglerad på 14-stadiet (ANXA2_P07356) och på p12-gruppen (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 och FIBG_Q8VCM7), och en ned- reglerad vid p12-gruppen (HAOX2_Q9NYQ2). Intressant nog var genuttryck av de två proteinerna med mer avstånd eller färre interaktioner till fibrinogengruppen (ILK och S10A9) de enda som inte validerades (Figur 5c).
Uppreglering av fibrinogenkomplexet (ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG och HAOX2 proteiner) bekräftades ytterligare genom Western blotting (WB) analys (Figur 6). Generellt sett var genuttryck och WB mycket överensstämmande med SWATH-MS proteomiska data. Slutligen utförde vi också immunhistokemivalidering av fibrinogenkomplexet i muterade och polycystiska leverprover (Figur 7). Fibrinogenfärgning var starkt uppreglerad i cystbeklädnade epitelceller och gallgångsdilatationer (Figur 7a). Dessa resultat avslöjar för första gången fibrinogenkomplexet som en möjlig väg relaterad till levercystogenes och som ett möjligt framtida terapeutiskt mål för PLD.
Figur 5. Validering av möjliga PLD-mål med RT-qPCR. Genuttryck av 8 till 10 utvalda mål korrelerade med SWATH-MS-data. RT-qPCRs av uppreglerade utvalda p14-målannexin A2 (Anxa2) (a); uppreglerad p12 riktar sig mot amyloid p-komponent, serum (Apcs, SAMP-gen), fibrinogen-liknande 1 (Fgl1), fibrinogen betakedja (Fgb), hemopexin (Hpx), fibrinogen alfakedja (Fga), fibrinogen gammakedja (Fgg) (b), integrinkopplat kinas (Ilk) och S10{{30}} kalciumbindande protein A9 (S100a9) (c); och nedreglerad pl2-målhydroxisyraoxidas 2 (Hao2) (d). n=6 användes för varje proteingrupp. Gapdh användes som en hushållsgen. Staplar representerar medelvärden ± SEM. Students t-test med tvåsvans användes och ett värde på p < 0,05 ansågs signifikant. ns: ej signifikant (p Större än eller lika med 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figur 7. Fibrinogenkomplex är uppreglerat i det cystiska epitelet. (a,b) Representativa bilder av fibrinogenimmunhistokemi i gallgången (övre panelen) och leverparenkym (nedre panelen) (a) och dess kvantifiering (b). n=6 användes för varje grupp. Immunhistokemianalysen visade en uppreglering av fibrinogen genom cystisk epitel. Proverna motsvarade p12-gruppen. Skalstaplar representerar 100 µm. Bd betyder gallgång. Staplar representerar medelvärden ± SEM. Students t-test med tvåsvans användes och ett värde på p < 0,05 ansågs signifikant. *** p < 0,001.
Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Handla för fler specifikationer:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
