Kvantitativ proteomstudie avslöjar fibrinogenväg vid polycystisk leversjukdom

Abstrakt:(1) Bakgrund: Polycystisk leversjukdom (PLD) är en heterogen grupp av medfödda sjukdomar som kännetecknas av gallgångsdilatation och cystutveckling härrörande från kolangiocyter. Ändå är cystogenesmekanismen för närvarande okänd och PLD-behandlingen är begränsad till levertransplantation. Nya och effektiva terapeutiska metoder behövs. I detta sammanhang har föreliggande arbete ett huvudsakligt syfte att hitta nya molekylära vägar, såväl som nya terapeutiska mål, involverade i den hepatiska cystogenesprocessen. (2) Metoder: Kvantitativ proteomik baserad på SWATH–MS-teknologi utfördes för att jämföra leverproteomer avVild typoch mutanta/polycystiska lever i enpolycystisk njursjukdom(PKD) murin modell (Pkd1cond/cond; Tam-Cre−/+). (3) Resultat: Vi identifierade flera proteiner förändrade i överflöd, med en tvåfaldig cut-off uppreglering eller nedreglering och en justeradp-värde signifikant relaterat till levercystogenes. Sedan utförde vi anrikning och en protein-proteinanalys som identifierade ett kluster fokuserat på leverfibrinogener. Slutligen validerade vi ett urval av mål med RT-qPCR,Western blotting,och immunhistokemi, hitta en hög korrelation med kvantitativa proteomikdata och validera fibrinogenkomplexet. (4) Slutsatser: Detta arbete identifierade en ny molekylär väg vid cystisk leversjukdom, som lyfter fram fibrinogenkomplexet som ett möjligt nytt terapeutiskt mål för PLD.

Nyckelord:PLD; STRÄNG; kvantitativ proteomik; terapeutiska mål

1. Introduktion

Polycystisk leversjukdom(PLD) är en heterogen grupp av medfödda sjukdomar som kännetecknas av gallgångsdilatation och cystorutveckling som härrör från kolangiocyter (epitelceller från gallgången). De många cystorna sprids och utvecklas genom leverparenkymet och äventyrar dess funktion [1]. PLD ärvs i dominant eller recessiv form och kan förekomma isolerat (isolerad polycystisk leversjukdomellerPLD) eller, vanligare, som enextrarenal manifestationav autosomaldominant polycystisk njursjukdom hos vuxna(PKD) [2]. Iautosomal dominant polycystisk njursjukdom(ADPKD), ~85% av patienterna utvecklar levercystor genom hela leverparenkym och dess svårighetsgrad kan variera från ett fåtal cystor till en allvarlig levercystogenes [3,4]. Samtidigt iautosomal recessiv polycystisk njursjukdom(ARPKD), levercystor kan utvecklas, men den huvudsakliga leverkomplikationen är en defekt ombyggnad av ductalplattan med medfödd leverfibros [5,6]. För båda är PLD den huvudsakliga extrarenala manifestationen och kräver klinisk behandling och behandling [2,5]. Det huvudsakliga kliniska tillvägagångssättet för PLD-patienter är att minska sina kliniska symtom. Hantering av gallgångskomplikationer är den huvudsakliga kliniska egenskapen som ska kontrolleras, och den slutliga behandlingsstrategin är vanligtvis levertransplantation [7], eftersom det inte finns någon effektiv farmakologisk behandling för PLD [2,5]. Flera molekylära vägar har associerats med sjukdomen [8], såsom ökad vätskesekretion [9,10], proliferation [11], fibros [12,13], ciliärdefekter [14] och andra [7,8]; men huvudmekanismen som genomgår cystogenes återstår att belysa. Identifieringen av nya potentiella terapeutiska mål är brådskande. Alla dessa studier baserades på molekylära studier med olika klassiska molekylära verktyg: 3D-cellkultur [7,8], immunhistokemi [7–9,11,12], ELISA [9,11], transmissionselektronmikroskopi (TEM) [12] , immuncytokemi [11], RT-qPCR (kvantitativ realtids-PCR) [7,8,10,11] och Western blot [7,8,10-12]. Att närma sig studiet av sjukdomar från nya perspektiv, väletablerade prekliniska djurmodeller och dra nytta av ny teknologi, kan vara en fördel i upptäckten av nya molekylära sjukdomsmekanismer för att översätta molekylära upptäckter till nya terapier.

Vätskekromatografi kopplad till tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) har varit den mest använda tekniken för karakterisering av sjukdomsproteomer samt identifiering av möjliga sjukdomsbiomarkörer eller läkemedelsscreening [15,16]. En framväxande strategi som heter SWATH–MS (sekventiell fönsterinsamling av all teoretisk fragment-jonspektra–massspektrometri) möjliggör en reproducerbar, pålitlig kvantifiering med hög genomströmning med upp till tusentals proteiner analyserade per biologiskt prov, och med möjligheten att utföra samtidigt ett stort antal analyser [16,17]. För denna teknik digereras proverna med trypsin och analyseras med vätskekromatografi kopplat till en tandemmasskromatografi som fungerar i det så kallade Data-Independent Acquisition (DIA)-läget [16] (se Material och metoder). Nästa generations proteomik SWATH–MS-teknologi gör det möjligt att kvantifiera proteomet och identifiera skillnader i proteinöverflöd i olika prover och förhållanden.

I den aktuella studien utförde vi en differentiell proteomisk kvantitativ analys baserad på SWATH-MS-teknologi vid polycystisk leversjukdom från muterade djurmodeller. Vi rapporterar en lista över proteiner med statistisk signifikans av differentiell proteinöverflöd, som kännetecknades av olika anrikningsanalyser och datakurering. Slutligen validerade vi SWATH-data genom att identifiera och lyfta fram fibrinogenkomplexet som en ny sjukdomsmekanism och ett möjligt nytt terapeutiskt mål för PLD.

2. Material och metoder

2.1. Murin modell

I denna studie använde vi en murin Pkd1 villkorlig knockout-djurmodell, C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Cre-mouse modellen användes som vilda typer (WT), och Cre+ som mutant (KO). Genotyper bekräftades med standard PCR, enligt de villkor och primrar som beskrivs [18]. Borttagning av Pkd1 skedde alltid på postnatal dag 10 och 11 (p10 och p11) med en enda intraperitoneal injektion av tamoxifen (10 mg/40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, USA nr. T5648), utspädd i majsolja (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, USA nr. C8267), båda dagarna i mamman till de kullar som ska induceras. Djuren avlivades vid postnatal dag 30 (p30). Grupperna upprättades av olika individer och organiserades slumpmässigt (randomisering) med ett förhållande på 1:1 mellan män och kvinnor i alla grupper. Anatomiska karaktäristiska egenskaper användes för att identifiera djurens kön. Mössen inhystes i en patogenfri anläggning (SPF) av de etablerade förhållandena vid University of Santiago.

2.2. Proteinextraktion och matsmältning

Vid p30-offringspunkten lagrades de dissekerade leverna vid -80 ◦C. Hela levern maldes i flytande kväve med användning av en flytande kvävekyld mortel (DD Biolab®, Barcelona, ​​Spanien nr. 088763), med hälften av vävnaden tilldelad proteinextraktion och den andra hälften till RNA-extraktion. Proteinextrakt framställdes med RIPA-lysbuffert (10 Mm TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % TRITON X-100 och 1 % natriumdeoxicholat). 1 % proteas- och fosfatasinhibitorer (Sigma® nr. P8340 och nr. P0044) tillsattes också. Detta vävnadslysat genomgick en centrifugeringsprocess (under 30 minuter vid 4 ◦C och 14,000 rpm). Supernatanten uppsamlades sedan och kvantifierades genom Bradford-proteinanalysen (Bio-Rad® nr. 5000001). Proteinalikvoter (100 µg) koncentrerades i ett enda band i en 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDSPAGE), skars och skickades för manuell nedbrytning som tidigare beskrivits [20]. Slutligen löstes de extraherade peptiderna i 0,1% myrsyra för ytterligare analys.

2.3. Proteomics

2.3.1. DDA-data

Beroende analys 4 µL av varje prov (över 4 µg protein) analyserades med hagelgevärsdataberoende förvärv (DDA) tillvägagångssätt med mikro-LC-MS/MS. Proverna separerades av Ekspert nLC425 mikro-LC-systemet (Eksigen®, Dublin, CA, USA) med användning av en YMC-TRIART C18 fällkolonn med en 3 mm partikelstorlek och 12 0 Å porstorlek (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, ​​Spanien) och en kolumn Chrom XP C{{10}} mm × 0.30 mm, 3 mm partikelstorlek och 120 Å porstorlek (Eksigen® 10 µL/min. De använda lösningsmedlen var lösningsmedel A (vatten, 0,1 % myrsyra) och lösningsmedel B (ACN, 0,1 % myrsyra). Gradienten var från 5 % till 95 % B under 30 min, 5 min vid 90 % B och, slutligen, ytterligare 5 min vid 5 % B för kolonnjämvikt, under en total tid av 40 min. Den kopplade masspektrometern var en hybrid quadrupol-TOF masspektrometer, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, USA) som arbetar med ett databeroende insamlingssystem i positiv jonmod. Med användning av masspektrometern utfördes en undersökningsskanning på 250 ms vid 400 till 1250 m/z följt av MS/MS-experiment vid 100 till 1500 m/z (25 ms insamlingstid) under en total cykeltid på 2,8 s. Fragmenterade prekursorer lades till i den dynamiska uteslutningslistan i 15 sekunder, alla joner med laddning +1 exkluderades från MS/MS-analysen. MS-råfil- och databassökningar kombinerades och utfördes med ProteinPilot programvara v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, USA) med hjälp av en musspecifik UniProt Swiss-Prot-databas. Det är nödvändigt att specificera jodacetamidcysteinalkylering som fixerad modifiering och trypsindigestion. Den falska upptäcktsfrekvensen (FDR) sattes till 1 för peptider och proteiner med ett konfidensvärde på över 99 % [21].

2.3.2. Generering av referenserna

Spektralbibliotek Spektralbiblioteket utfördes med en DDA-metod enligt beskrivningen ovan, men istället för varje oberoende prov utfördes en pool av varje grupp med 4 µL av varje prov (över 4 µg protein) körd för att erhålla mer representativt protein identifiering i spektralbiblioteket. Alla råfiler lanserades tillsammans i Uniprot-databasen för att erhålla spektralbiblioteket med hjälp av proteinpilotvillkoren som nämns i föregående avsnitt.

2.3.3. Kvantifiering genom SWATH och dataanalys

SWATH–MS-förvärvet utfördes med en DIA-metod. Vi använde 4 grupper med 4 biologiska replikat per grupp och 3 tekniska replikat per prov (se tabell S1 för mer information). Vävnaderna analyserades och i alla fall jämfördes i vildtyp (från Pkd1cond/cond; Tam-Cre−mouse) och mutant (från Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ mus) förhållanden. 4 µg protein per prov och tekniska replikat kördes med en SWATH-metod. För varje uppsättning prover optimerades bredden på de 100 variabla fönstren enligt jondensiteten som finns i bibliotekets DDA-körningar med ett Sciex SWATH-kalkylblad för variabelt fönster. Därför baserades SWATH-metoden på en cykel av upprepningar som bestod av förvärvet av 100TOF MS/MS-skanningar (400 till 1500 m/z, högkänslighetsläge, 50 ms insamlingstid) av isoleringsfönster av sekventiella överlappande prekursorvariabler med bredder (1 m/z överlappning) som täcker massområdet 400 till 1250 m/z med en tidigare TOF MS-skanning (400 till 1500 m/z, 50 ms insamlingstid) för varje cykel. Den totala cykeltiden var 6,3 s.

2.3.4. Dataanalys

Alla proteiner i jonbiblioteket som identifierades av ProteinPilot med en FDR under 1% kvantifierades med SWATH-metoden. När individuella prover tagits, utfördes den spektrala anpassningen och riktad dataextraktion av PeakView v.2.2. (SCIEX®, Framingham, MA, USA) som matchar referensspektralbiblioteket enligt beskrivningen nedan [22–26]. Retentionstiderna för peptiderna som valdes ut för varje protein justerades om i varje körning enligt de iRT-peptider som fanns i varje prov och eluerades längs hela tidsaxeln. De extraherade jonkromatogrammen genererades sedan för varje jon av det valda fragmentet; toppareorna för peptiderna erhölls genom tillsats av toppareorna för jonerna av motsvarande fragment. PeakView beräknade en FDR och en poäng för varje tilldelad peptid enligt de kromatografiska och spektrakomponenterna; endast peptider med en FDR under 5 % användes för proteinkvantifiering. På liknande sätt valdes upp till 10 peptider per protein och sju fragment per peptid för att erhålla områdena för proteinkvantifiering som en funktion av signalintensitet. Alla delade och modifierade peptider uteslöts från bearbetning. Fem minuters fönster och 30 ppm bredder användes för att extrahera jonkromatogrammen.

2.3.5. Analys av signalvägar

Olika funktionella analyser utfördes med användning av differentiellt uttryckta proteiner för att utvärdera de mest relevanta interaktionsnätverken, relaterade vägar eller cellulära komponenter och andra associerade proteiner eller vägar. UniProt-proteinaccessionsnummer (https://www.uniprot.org/, 28 augusti 2021) användes. Proteiner med skillnader i proteinöverflöd utsattes för: String® (https://string-db.org/, 25 oktober 2021) med hjälp av Gene Ontology (GO) termer och FunRich® (http://funrich.org/index.html , 21 oktober 2021) för att studera proteinnätverk och biologisk koppling mellan proteiner; och till Reactome® (https://reactome.org/, 25 oktober 2021) för att studera de vägar som är involverade i relation eller interaktion med signifikant uttryckta proteiner.

2.4. Histologi och mätning av cystiskt index

Den största leverloben hos djuren fixerades alltid i paraformaldehyd (4 % paraformaldehydbuffrad lösning, pH=7, Labbox nr. FORM-D0P-10K) över natten vid 4 ◦C. Leverrna dehydrerades sedan med xylen och etanol och bäddades slutligen in i paraffin. Tvärsnitt på 4,5 µm samlades in. För hematoxylin-eosin (HE) och Masson trikromfärgning användes standardprotokoll.

För kvantifieringar togs bilder av längsgående sektioner av den största leverloben alltid som representativa bilder, och minst sex olika sektioner per djur, visualiserade under ett Olympus BX51-mikroskop kopplat till en Olympus Camera DP70, användes för kvantifiering av cystiskt index och ett antal cystor. Kvantifieringen av båda parametrarna beräknades med ett mjukvaruverktyg för Automatic Cyst Recognition som heter CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1 juli 2020) som tidigare beskrivits [35].

2.5. Klinisk kemi

Blod samlades före dödshjälp och serum erhölls med BD Vacutainer SST II Advance-rör. Serumalanintransaminas (ALT) och alkaliskt fosfatas (ALP) mättes med användning av ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Healthineers, Erlangen, Tyskland).

2.6. RNA-extraktion

RNA isolerades som tidigare beskrivits [36] med användning av TRIzol-protokoll (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, USA, nr. T9424), i vilket kloroform (Sigma® nr. C2432) fungerade som denatureringsmedel för cellerna och isopropanol (Sigma® nr 650447) var utfällningsmedlet för RNA. Fällningen späddes i DEPC-vatten (Ambion®, Austin, TX, USA, nr AM9920), som också innehåller 1 % SUPERaseIn RNas-inhibitor (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr AM2694).

2.7. Kvantitativ PCR i realtid

Ett mikrogram totalt lever-RNA behandlades med DNas I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA, nr 18068015). Därefter utfördes omvänd transkription med SuperScript® III First-Strand Synthesis System-kit (Invitrogen®, nr. 18080051), och genuttrycksanalys genom kvantitativ realtids-PCR med användning av FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® nr. 04913914001) ) i ett Mx3005P-system (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, USA). Primrarna som används för denna studie designades med Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11 mars 2020) och är baserade på cDNA-referenssekvenserna publicerade i Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org) /index.html, 11 mars 2020). De fullständiga sekvenserna för alla primrar som används i studien finns i Tabell S2. Följande program användes för alla fullständiga PCR-reaktioner: ett denatureringssteg med 30 s vid 95 ◦C; 45 cykler på 30 s vid 95 ◦C, 1 min vid 60 ◦C och 30 s vid 72 ◦C; följt av ett kylningssteg. Som vi tidigare har utfört [36], kördes varje prov (n=6 för varje grupp) i tre exemplar i varje experiment. Resultaten analyserades genom den absoluta kvantifieringsmetoden. Följaktligen användes en standardkurva med kända koncentrationer i analysen och dessutom normaliserades varje prov till en konstant expressionsgen. I denna studie användes Gapdh-genen (glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas) som hushållningsgen.

2.8. Western Blotting

Western blotting-analyser utfördes på helleverlysat. Totalt proteininnehåll bestämdes med hjälp av Bradford-proteinanalys (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA, nr. 5000001) och samma mängd av varje protein (20–30 µg) var kokades vid 95 ◦C i 5 minuter och separerades i 10 % SDS-PAGE under reducerande förhållanden. PageRulerTM Pretained Protein Ladder (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 26616) användes som standard för proteinmolekylvikt. Därefter överfördes proteinerna till nitrocellulosamembran (Bio-Rad® nr. 1620115). För att undvika ospecifik bindning blockerades membranen i 1 timme vid rumstemperatur med en 2,5 % BSA-lösning (NZYTech®, Lisboa, Portugal, nr MB046) för fosforylerade proteiner, eller SuperBlock Blocking Buffer (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 37515). Därefter inkuberades membranen över natten vid 4◦C med primära antikroppar och tvättades därefter i 0,3 % Tween-20 i PBS. Slutligen inkuberades nitrocellulosamembranen under 1 timme vid rumstemperatur med de HRP-kopplade sekundära antikropparna. Signaler utvecklades med SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate-kit (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 34580) eller PierceTM ECL Western Blotting Substrate-kit (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA nr. 32109) tidigare till visualisering i ChemiDoc™ Imaging System (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA). Proteinband kvantifierades med hjälp av programvaran ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 26 mars 2021). Proteindensitometrinivåer normaliserades till hushållsproteinerna GAPDH eller -ACTIN. För varje grupp. N=6 användes i alla experiment.

Följande primära antikroppar används för Western blotting: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA #sc-28385), anti -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, nr sc-393948), anti-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotech nology Inc.®, Dallas, TX, USA, nr sc-271035), anti-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, nr sc-398806), anti-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, nr sc-133157), anti-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 113442), anti-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, USA, nr. CSB-RA009232A0HU) och anti- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA, nr 8457), som såväl som den sekundära antikroppen Get anti-kanin IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 31460) eller get anti-mus IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, nr 31430).

2.9. Immunhistokemi och kvantifiering

För immunhistokemi användes natriumcitratbuffert pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Danmark nr. S2369) för antigenåtervinning och vävnad blockerades med antikroppsspädningsmedel (Agilent Dako® nr. K8006). Antikroppen som användes för immunhistokemisk analys var fibrinogen (Agilent Dako® nr A0080) och det HPR-konjugerade detektionssystemet för immunodetektion. Slutligen utfördes immunhistokemins kvantifiering med funktionen "Delade kanaler" (grön kanal) från programvaran Fiji-ImageJ® (https: //imagej.net/software/fiji/, 13 oktober 2021). För varje prov användes n Större än eller lika med 6 bilder.

2.10. Statistik Analys

Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 som cut-off. Oövervakad multivariat statistisk analys med användning av principal component analysis (PCA) utfördes för att jämföra data över proverna.

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25 % ECHINACOSID OCH 9 % ACTEOSID FÖR NJURINFEKTION