Quercetin undertrycker inflammatorisk cytokinproduktion i reumatoid artrit fibroblastliknande synoviocyter
Apr 22, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt.Reumatoid artrit (RA) är en kronisk, progressiv och systemisk autoimmun sjukdom som huvudsakligen kännetecknas av symmetrisk multijoint synovit. Quercetin har antiinflammatoriska, antioxiderande och immunreglerande aktiviteter och visar därför högt medicinskt värde. Den aktuella studien syftade till att observera effekten av quercetin på fibroblastliknande synoviocyter (FLS) vid RA. Reumatoid artrit fibroblastliknande synoviocyter (RAFLS) förbehandlades med 50 nmol/l quercetin i 2 timmar och stimulerades sedan med TNF-a i 24 timmar för efterföljande experiment. RAFLS transfekterades med kort interfererande (si)-X-inaktivt specifikt transkript (XIST), mikroRNA (miR)-485mimic,miR-485hämmare eller si-PSMB8 eller kombination. ELISA, PCR och western blotting användes för att utvärdera effekten av quercetin på RAFLS behandlade med TNF -a. Det avslöjades att quercetin hämmade produktionen av inflammatoriska cytokiner och uttrycket av XIST i RAFLS inducerad av TNF-a. Bioinformatikanalys visade att XIST fungerade som en svamp för miR-485 och att proteasomsubenhetstyp-8 (PSMB8) var ett direkt mål för miR-485. Dessutom fungerade PSMB8 som en suppressor i inflammatorisk cytokinproduktion av RAFLS inducerad av TNF-a. Totalt sett observerades quercetin att hämma produktionen av inflammatoriska cytokiner och uttrycket av XIST i RAFLS inducerade av TNF-a. Dessutom kan XIST-tystnad undertrycka den inflammatoriska reaktionen genom att sponga miR-485 i celler behandlade med TNF-a. Sammantaget kan quercetin undertrycka utvecklingen av RA in vitro.
Introduktion
Reumatoid artrit (RA) är en vanlig inflammatorisk sjukdom som kännetecknas av inflammatorisk cellinfiltration som leder till degeneration av synovium, ledbrosk och ben (1). Förekomsten och utvecklingen av RA involverar frisättning av ett stort antal inflammatoriskacytokineroch mediatorer, vilket orsakar irreversibel förstörelse av brosk och ben i leden (2). Med ökningen av en åldrande befolkning i det mänskliga samhället har förekomsten av RA visat en ökande trend i utvecklade länder från 1995 till 2001 (3,4). För närvarande bygger RA-behandling på icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, glukokortikoider, metotrexat och andra symtomatiska metoder för att kontrollera sjukdomen. Dessa läkemedel kan förbättra symtomen på RA, men långvarig användning har starka toxiska biverkningar, som att hämma kroppens immunfunktion (5). Därför är det av stor vikt att hitta säkra och effektiva läkemedel för behandling av RA.
Quercetin är den viktigaste bioflavonoiden i människans kost och finns allmänt i blommor, blad och frukter av växter (6,7). Quercetin har antiinflammatoriska, antioxiderande och immunreglerande aktiviteter (8,9) och visar därför högt medicinskt värde. Kliniska studier har visat att quercetin har en god effekt på att lindra knäartros, samt reumatoid led- och kroppsvärk efter träning (10-12). Fibroblastliknande synoviocyter (FLS) är de huvudsakliga effektorcellerna och kan frisätta en mängd olika inflammatoriska cytokiner, vilket förvärrar progressionen av RA (13,14). Dessutom kan TNF-a främja aktiveringen och benresorptionen av osteoklaster, och kan inducera uttrycket av andra inflammatoriska faktorer, adhesionsmolekyler och proteaser associerade med ben och brosk; vilket orsakar förtjockning av det synoviala foderskiktet och förvärrar det inflammatoriska svaret i lederna ytterligare (15). Den aktuella studien syftade därför till att observera effekten av quercetin på FLS vid RA och utforska den möjliga mekanismen förquercetinvid behandling av RA.
Material och metoder
Cell kultur. De primära cellernas RAFLS erhölls från The Cell Bank of the Type Culture Collection of The Chinese Academy of Sciences (kat. nr.408-05a). Alla celler hölls i DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) innehållande 10 procent FBS (HyClone; Cytiva) 100 U/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin i en inkubator vid 37 grader. Efter odling i 24 timmar förbehandlades RAFLS med 50 nmol/l quercetin (MilliporeSigma) i 2 timmar vid 37 grader och stimulerades sedan med 50 ng/ml TNF-a i 24 timmar vid 37 grader för följande experiment.
Cistanche kan förbättra immuniteten
Celltransfektion. Små störande (si)-RNA:n riktade mot XIST (si-XIST; slutlig koncentration, 20 nM) och dess förvrängda negativa kontroll (NC) siRNA (slutlig koncentration, 20 nM), miR-485hämmare (slutkoncentration, 30 nM) och förvrängd inhibitorkontroll (miR-NC; slutkoncentration, 30 nM) och miR-485-härmar (slutlig koncentration, 15 nM) och förvrängd härmarkontroll (miR-NC-härmare; slutlig koncentration, 15 nM) erhölls från Shanghai GenePharma Co., Ltd. Totalt lx10 graders RAFLS ströks ut på plattor med sex brunnar under 12 timmar, sedan transfekterades konstruktionerna till RAFLS genom att blanda med Lipofectamine*2000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid 37 grader i 15 minuter enligt tillverkarens instruktioner . Totalt 24-72 timmar efter transfektion samlades de transfekterade cellerna in för efterföljande experiment. Sekvenserna för de transfekterade molekylerna var följande: si-XIST, 5'-GCAAAUGAAAGCUACCAAU-3'; si-NC, 5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3'; miR-485-hämmare, 5'-UCACGCGAGCCGAACGAACAA-3'; anti-miR-NC, 5'-CAGUACUUUUUGUGUAGUACAAA-3';miR-485 mimik, 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCUCUCU-3'; miR-NC, 5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3!
Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA). Koncentrationen av inflammatoriska cytokiner i transfekterade och icke-transfekterade RAFLS (IL-1, IL-6 och IL-8) bestämdes med användning av ELISA-kit (kat.nr KE00021, KE00139 och KE00006; Proteintech Group, Inc.) enligt tillverkarens protokoll. En mikroplattläsare användes för att avläsa absorbansen vid 450 nm.
Omvänd transkription-kvantitativ(RT-q)PCR-analys. Totalt cellulärt RNA extraherades från transfekterade och icke-transfekterade RAFLS med användning av TRIzol"-reagenset (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). cDNA-syntes utfördes med användning av Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas; Thermo Fisher Scientific, Inc.) enligt tillverkarens instruktioner. Kvantitativ analys av XIST- och PSMB8-uttryck utfördes med användning av SYBROPremix Ex Taqm-reagens (Takara Bio, Inc.) och GAPDH användes som endogen kontroll. Termocyklingsförhållandena var följande: 94 grader för 3 min; 40 cykler av 94 grader för 30 sek, 55 grader i 30 sek och 72 grader i 1 min; och 72 grader i 10 min. Expressionsnivån för miR-485 analyserades med SYBRO PrimeScript"M miRNA RT-PCR-kit (Takara Biotechnology Co., Ltd. och U6 litet nukleärt RNA användes som intern referens. Termocyklingsförhållandena var som följer: denaturering vid 95 grader i 10 sekunder; 40 cykler av 95 grader i 5 sekunder och 60 grader i 20 sekunder; följt av analys av dissociationskurvan vid 95 grader i 60 sekunder, 55 grader i 30 sekunder och 95 grader i 30 sekunder. Primers köptes från Sangon Biotech Co., Ltd., och primersekvenserna var följande: GAPDH Forward, 5-CTTGGTATCGTGGA AGGACTC-3' och omvänd, 5'-GTAGAGCAGGGATGATGATG TTCT-3'; U6 framåt, 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAAT-3' och bakåt, 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3'; IncRNA XIST framåt, 5'-AATGGAACGGCTGA GTTTTAC-3' och bakåt, 5'-TCATCCGCTTGCGTTCAT AG-3'; miR-485 framåt, 5'-CAGAGCTGGCCGTGAT-3 och bakåt, 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGACGAATTC-3'; PSMB8 framåt, 5'-GCTGCCTTCAACATAACATCA-3' och bakåt, 5'-CTG CCACCACCACCATTA-3! Det relativa uttrycket analyserades med 2-AACq(16).
Western blotting. Totalt protein isolerades från RAFLS med användning av förkall RIPA-lysbuffert (Beyotime Institute of Biotechnology) inklusive en proteashämmare. Totalt protein kvantifierades med ett BCA-proteinanalyskit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Totalt 30 ug proteinprover per bana separerades med 10 procent SDS-PAGE och överfördes därefter till ett nitrocellulosamembran (MilliporeSigma). Membranen blockerades med 5 procent fettfri mjölk vid rumstemperatur under 1 timme. Därefter inkuberades membranen över natten vid 4 grader med primära antikroppar riktade mot PSMB8(1:1,000; kat.nr abl80606) och GAPDH (1:1,000; kat.nr. abl81602)(alla från Abcam). Membranen inkuberades med en pepparrotsperoxidas-märkt sekundär anti-kanin-IgG-antikropp (1:1,000;sc-2027; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) vid rumstemperatur under 1 timme. Proteinband visualiserades med användning av ett ECL-detektionskit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) och analyserades med programvaran Quantity One v4.6.2 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). GAPDH användes som laddningskontroll.
Luciferas reporteranalys. XIST-fragmenten och PSMB8 3'-otranslaterade regioner innehållande vildtyp (WT) eller mutant (MUT)miR-485-bindningsställen erhölls från Shanghai GenePharma Co., Ltd. De klonades in i eldflugan luciferasgenreportervektor pmiRGLO (Promega Corporation). Plasmiden syntetiserades av Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. Sedan 48 timmar efter transfektion med LipofectamineD 2000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid 37 grader med 5 procent CO, utfördes luciferasanalysen med användning av dubbelluciferasreporteranalyssystemsatsen (Promega Corporation) ) enligt tillverkarens instruktioner. Luciferasaktiviteten analyserades med användning av en Modulus enkelrörs multimodläsare (Promega Corporation) i jämförelse med Renilla luciferasaktivitet. Följande sekvenser användes: XIST-WT Forward, 5'-CGCCAGCTTCGACAATTCGAC-3 och omvänd, 5'-ACT TGAAGCGGCCATACGTTGACAA-3';XIST-MUT forward, 5'-TCAAAACCCAACTAGAGGACGATTTGTGA{{20} ', och omvänd, 5'-AACCCAGAAAACCGTACGGCAATCGT-3';
PSMB8-WT framåt, 5'-CCGCTAAGTCCGAGTAGTCA-3' och bakåt, 5'-ATAAGAATGCGGCCGAATTCATGG GAA-3'; och PSMB8-MUT framåt, 5-TTAGGACACGCA TCGGATTACGCTATTAT-3' och bakåt, 5'-GACACCTGT TTACGGCTACCCGCAAATATGCCAA-3'.
Bioinformatik analys. Bindningsplatserna mellan miR{{0}} och XIST, såväl som miR-485 och PSMB8, förutspåddes av StarBase v2.0 (http://www.microrna.gr/lncBase) eller TargetScan-programvaran v7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/), respektive.
Statistisk analys. Alla uppmätta data uttrycks som medel ± standardavvikelse. Skillnader beräknades med parat Students t-test för jämförelser mellan två grupper eller envägs ANOVA följt av Dunnetts eller Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. Alla statistiska analyser utfördes med GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) och SPSS 14.0 (SPSS, Inc.).P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" experiments="" were="" repeated="" three="">
Resultat
Quercetin hämmar produktionen av inflammatoriska cytokiner och uttrycket av XIST i RAFLS inducerade av TNF-a. Under TNF-a-stimulering var koncentrationen av inflammatoriska cytokiner (IL-1, IL-6 och IL-8) och expressionsnivån av XIST signifikant uppreglerade i RAFLS jämfört med de i NC(Fig. IA och B). Emellertid kunde behandling med quercetin markant undertrycka främjandet av TNF-a vid produktionen av inflammatoriska cytokiner, och expressionsnivån av XIST minskade markant i FLS (Fig. IA och B). Dessa resultat indikerade att quercetin kunde undertrycka inflammationsreaktionen i RAFLS inducerad av TNF-a.
XIST fungerar som en svamp för miR{{0}}. Därefter undersöktes de potentiella molekylära mekanismerna och de möjliga målen för XIST förutspåddes med hjälp av StarBase-databasen v2.0.
Bioinformatikanalysen visade att miR-485 hade ett potentiellt bindningsställe med XIST-sekvensen (Fig.2A). Transfektion med miR-485-härmaren visades uppreglera uttrycket av miR-485 i RAFLS (Fig.2B). Samtidigt härmar miR-485 markant undertryckt luciferasaktivitet i XIST-vildtypen jämfört med den i NC(Fig.2C). TNF-a kunde signifikant nedreglera expressionsnivån av miR-485 i RAFLS, som räddades av quercetin (Fig. 2D). XIST var signifikant underuttryckt i RAFLS efter transfektion med si-XIST (Fig. 2E). Dessutom , XIST-tystnad främjade signifikant uttrycket av miR-485, vilket reverserades av miR-485-hämmaren i RAFLS-behandlad med TNF-a(Fig.2F). Dessa resultat indikerade att XIST interagerade med miR-485.
PSMB8 är ett direkt mål för-485. Enligt TargetScan-analys identifierades ett mycket konserverat förmodat bindningsställe med miR-485 vid den PSMB8 3'-oöversatta regionen (Fig. 3A). MiR-485-härmaren undertryckte signifikant fluorescensen i PSMB8-vildtypen jämfört med den i NC (Fig. 3B). TNF-a kunde signifikant uppreglera uttrycksnivån av PSMB8in RAFLSs, vilket var omvänt av quercetin (Fig. 3C). miR-485-hämmaren kunde signifikant nedreglera expressionsnivån av miR-485 i RAFLS (Fig. 3D). Dessutom minskade uttrycket av PSMB8 signifikant i RAFLS efter transfektion med si-PSMB8 ( Fig. 3E).miR-485-hämmare kunde signifikant öka uttrycket av PSMB8 vid mRNA- och proteinnivåerna, vilket avskaffades av si-PSMB8 i RAFLS behandlade med TNF-a (Fig. 3F). Dessa resultat visade att miR-485 riktade sig direkt mot PSMB8.
PSMB8 fungerar som en suppressor vid produktionen av inflammatoriska cytokiner i RAFLS inducerade av TNF-a. Efter transfektion med si-PSMB8 minskade koncentrationerna av inflammatoriska cytokiner (IL-1, IL-6 och IL-8) signifikant i transfekterade RAFLS behandlade med TNF-a jämfört med de otransfekterade celler behandlade med TNF-a (Fig. 4A). Dessutom undertryckte quercetin den inflammatoriska reaktionen i RAFLS under TNF-a-stimulering, vilket
räddades genom transfektion med si-PSMB8 (Fig. 4B). Dessa resultat indikerade att PSMB8 kunde undertrycka inflammationsreaktionen i RAFLS inducerad av TNF-a.
Diskussion
Som en naturlig aktiv produkt från växter är quercetin en sekundär metabolit isolerad och extraherad från Fagaceae-växter genom naturlig medicinsk kemi (17). Under tidigare år har quercetin verifierats att hämma det inflammatoriska svaret vid ett antal sjukdomar, inklusive maligna tumörer ( 18), diabetiker Mellitus (19) och ateroskleros (20). Den aktuella studien utvärderade rollen av quercetin på utvecklingen av RA. Det antas att när fibroblaster väl har aktiverats i patogenesen av RA, kommer en serie inflammatoriska faktorer och extracellulära matrisnedbrytande enzymer att produceras för att mediera det inflammatoriska svaret, vilket orsakar den progressiva förstörelsen av ben och brosk och påverkar kvaliteten
av livet allvarligt (21,22). Den aktuella studien observerade att quercetin undertryckte den inflammatoriska cytokinproduktionen av FLS inducerad av TNF-a.
As a class of non-coding transcripts, IncRNAs are >200 nukleotider i längd och reglerar genuttryck på epigenetiska, transkriptionella och post-transkriptionella nivåer (23,24). lncRNA XIST identifierades ursprungligen i regleringen av X-inaktivering i den kvinnliga däggdjurs somatiska cellen (25). Tidigare forskning tyder på att avreglerat uttryck av XIST är involverat i den inflammatoriska reaktionen av vissa sjukdomar inklusive inflammatorisk neuralgi och akut lunginflammation (26,27). I enlighet med tidigare forskning fann den aktuella studien att expressionsnivån av XIST var uppreglerad i FLS inducerade av TNF-a, som avskaffades av quercetin. ncRNA kan reglera genuttryck genom att sponga miRNA (28). Bioinformatikanalys visade att miR-485 hade ett potentiellt bindningsställe med XIST-sekvensen.cistanche deserticola maDessutom nedreglerades nivån av miR-485-uttryck i FLS som behandlats med TNF-a. Dessutom främjade XIST-tystnad effektivt miR-485-uttryck i celler efter transfektion.
miRNA kan rikta in sig på den 3'-otranslaterade regionen av mRNA för att kontrollera genuttryck (29).cistanche effekterDen aktuella studien avslöjade att PSMB8 är ett direkt mål för miR-485. PSMB8 kan fungera som en subenhet av immunoproteasomen för att inducera ett inflammatoriskt svar enligt följande. Yamagishi (30) rapporterade att specifik hämning av PSMB8 kan minska utsöndringen av inflammatoriska faktorer och därmed fördröja inflammationssvaret av diabetes mellitus. Koerner et al (31) avslöjade att involveringen av PSMB8 i det inflammatoriska svaret är nära förknippat med utvecklingen av kolorektal cancer. Den aktuella studien avslöjade att TNF-a signifikant kunde uppreglera uttrycksnivån av PSMB8 i RAFLS. Dessutom kan si-PSMB8 hämma koncentrationen av inflammatoriska cytokiner i RAFLS behandlade med TNF-a. Dessutom kunde quercetin inte undertrycka den inflammatoriska reaktionen i RAFLS behandlade med si-PSMB8 under TNF-a-stimulering. Dessa data antydde att PSMB8 fungerar som en suppressor vid produktionen av inflammatoriska cytokiner i RAFLS inducerade av TNF-a.
Den aktuella studien observerade att undertryckandet av inflammatorisk cytokinproduktion av quercetin i FLS inducerade av TNF-a är lovande in vitro. Effekten in vivo och effekten av farmakokinetik och penetration av synovialmembranet på quercetin har dock ännu inte undersökts. Således planeras ytterligare studier för att försöka studera effekten av quercetin på RA in vivo.
Sammanfattningsvis,cistanche deserticoladen aktuella studien observerade quercetin-hämmad produktion av inflammatoriska cytokiner och XIST-uttryck i RAFLS inducerade av TNF-a. Dessutom kan XIST-tystnad undertrycka den inflammatoriska reaktionen genom att sponga miR-485 i celler behandlade med TNF-a. Sammantaget kan quercetin undertrycka utvecklingen av RA in vitro.
Denna artikel är hämtad från Mottaget 17 juni 2020; Godkänd 11 juni 2021DOI: 10.3892/etm.2021.10695
