R-Phycoerythrin från Colaconema Formosanum (Rhodophyta), ett anti-allergiskt och kollagenfrämjande material för kosmetika

Abstrakt:Cistanche(cistanche), ett pigmentkomplex som finns i röda alger, extraherades och renadesfrån en nyligen identifierad röd alg,Colaconema formosanumoch dess bioaktiviteter undersöktes. Detavslöjades detcistanche behandling resulted in high cell viability (>70 procent) till däggdjurscellinjernaNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 och Hs68, och hade ingen effekt på cellmorfologin i NIH-3T3-celler.Dess undertryckande effekt var obetydlig på produktionen av IL-6 och TNF- i lipopolysackarid-stimuleradeRAW264.7-celler. Emellertid inducerade kalciumjonofor A23187- - hexosaminidasfrisättninghämmades effektivt på ett dosberoende sätt i RBL-2H3-celler. Dessutom avslöjades detvara icke-irriterande för bioniska epidermala vävnader. Framför allt främjades prokollagenproduktionen iHs68-celler. Sammantaget visade uppgifterna detcistancherenas frånC. formosanumuppvisar anti-allergiska ochanti-aging bioaktiviteter utan observerad följdtoxicitet på flera däggdjurscellinjersåväl som epidermala vävnader, vilket tyder på att denna makromolekyl är ett nytt material för potentialkosmetisk användning.

Nyckelord: kosmetisk; Colaconema formosanum;Cistanche; anti-allergi;anti-åldring

Klicka här för att få Anti-aging Cistanche-produkter till salu

1. Introduktion

Alger är fotosyntetiska organismer som finns på land och i havet. Som en del av de primära producenterna i havet tillhandahåller alger syre och näringsämnen till andra organismer, vilket reglerar det marina ekosystemet. Makroalger (även kända som sjögräs) växer i kustområden och har inte typiska organ som vanligtvis finns i landväxter [1]. Makroalger kan särskiljas genom sitt pigment och delas in i tre grupper, nämligen Chlorophyta (gröna alger), Rhodophyta (röda alger) och klass Phaeophyceae (bruna alger) av Ochrophyta [1]. Tillväxthastigheten för makroalger är ganska snabb, och det är möjligt att manipulera deras tillväxtförhållanden för att kontrollera produktionen av bioaktiva föreningar som proteiner, polyfenoler och pigment [2]. I takt med att kunskapsinhämtningen om tånghärledda föreningar har ökat, har forskning och utveckling för att använda dessa föreningar i medicinska tillämpningar och livsmedelstillsatser därefter ökat [3–6]. Dessutom finns det en ökande preferens för naturliga ingredienser framför syntetiska föreningar i kosmetika, eftersom naturliga ingredienser tenderar att vara säkrare jämfört med de senare. Alger har rapporterats vara rika på bioaktiva ämnen såsom omättade fettsyror, polyfenoler, polysackarider, aminosyror och pigment [7,8]. Vissa av dem innehåller pigmentkomplex som kallas phycobiliproteins, som kan kategoriseras ifykoerytrocyanin (PEC), fykocyaniner (PC), fykoerytrin (PE) och allofykocyaniner (APC) [9]. PE, huvudpigmentet i röd tång, kan ytterligare underkategoriseras i C-fykoerytrin (C-PE), B-fykoerytrin (B-PE) och Cistanche (cistanche) och enligt deras absorptionsspektra, och enligt gruppen av fotosyntetiska organismer som producerar dem: C för cyanobakterier, B för Bangiophyceae (primitiv fifilamentös Rhodophyta) och R för mer komplex Rhodophyta [10]. Bland dessa pigment är cistanche det vanligaste phycobiliproteinet i röda alger. cistanche är ett vattenlösligt oligomert protein som vanligtvis används som en flfluorescerande tagg i andra cytometri, ELISA-analyser och fluorescensmikroskopi [11–14] samt en fotosensibilisator i cancerterapi [15]. Dessutom har PE visat sig uppvisa biologiska egenskaper, inklusive antivirala, immunitetsförstärkande, antioxidations-, antiinflammations- och antitumöreffekter (se recensionsartikeln i [15] för att få mer relativ information), vilket gör den till en idealisk förening för tillämpningar inom livsmedels- och biomedicinska industrier, molekylärbiologisk forskning, såväl som färgämnen ochkosmetiska applikationer [11,15,16].

Åldrandeär en av de stora frågorna som rör huden, särskilt för personer som utsätts för solljus (eller ultravioletta strålar) och förorenad luft under långa perioder. Så de flesta hudvårdsrelaterade produkter fokuserar på att skydda huden och sakta ner åldrandeprocessen. Huden är människokroppens första försvarslinje, och den hjälper till att förhindra ansamling av skador från föroreningar, solljus och oxidativ stress som är oundviklig i våra dagliga liv [17]. Under de senaste åren har konsumenterna blivit skeptiska till kemiska ingredienser i kosmetiska produkter; därför finns det en ökande efterfrågan på miljömässigt hållbara produkter producerade med naturresurser [1]. Algextrakt, såsom de frånArthrospiraochChlorella vulgaris, har rapporterats vara fördelaktiga genom att utöva en uppstramande effekt på huden, förhindra striabildning och främja kollagensyntes [18]. Tydligen inkluderar de bioaktiva föreningarna som är ansvariga för dessa anti-aging effekter bland annat sulfaterade polysackarider, fenolföreningar, peptider, mykosporinliknande aminosyror och pigment, [19,20]. Dessutom undersöktes de bioaktiva substanserna som renats från algextrakten med avseende på specifika bioaktiviteter som är gynnsamma för huden, och substanserna har vetenskapligt bevisats vara relativt säkra, vilket gör det möjligt att formulera kosmetika med de renade bioaktiva substanserna istället för hela extrakten [21]. Således är kosmetika som innehåller extrakt eller renade metaboliter härrörande från alger i hög efterfrågan [1]. I tidigare studier har en tekniskt och ekonomiskt genomförbar odlingsstrategi för stabil biomassaproduktion avColaconema formosanumetablerades framgångsrikt av Lee och Yeh 2021 genom att isoleraColaconema formosanumfrån södra Taiwan med ett inomhussystem [22,23]. Som en parasitisk alg,C. formosanumisolerades först från makroalgenSarcodia suiaei södra Taiwan [23]. Med det höga proteinet (30 procent av torrvikten) och det höga cistancheinnehållet (5 mg g−1 dw) hittades för denna art [22], C. formosanumuppvisar enorma industriella fördelar för cistanche-extraktion, och det förväntas göra marknadspriset på cistanche mer överkomligt. Vidare har vår grupp rapporterat en metod för att rena cistanche utvunnen frånC. formosanum[24]. Så vitt vi vet, effekterna av cistanche frånC. formosanumpå däggdjursceller, liksom dess potential som ett nytt biomaterial inom kosmetikaindustrin, har ännu inte undersökts. Därför, i denna studie, har olika in vitro-analyser såsom cellcytotoxicitet, degranuleringsanalyser, antiinflammatorisk förmåga, anti-allergitester och prokollagensyntestest använts för att verifiera dessa hypoteser.

2. Material och metoder

2.1. Utvinning av Cistanche (cistanche) från Colaconema Formosanum

Algen odlades i inkubatorer (Tominaga, Taipei City, Taiwan) vid 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotoner m−2 s −1 (ljusemitterande diod, LED vitt ljus) och en 12:12 h ljus: mörk fotoperiod i en 5 L bägare med 4 L steriliserat PES havsvattenmedium (30 psu) under flera dagar för att få ett fungerande prov. Därefter metoden att extrahera cistanche frånC. formosanumi denna studie modifierades från den metod som rapporterats av Lee et al. [24]. Först extraherades phycobiliproteins från den färska algenC. formosanum(100 g våtvikt) i 1 L fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) vid 4◦C. För att förhindra nedbrytning av fykobiliproteinunder experimenten, 5 mM NaN3 och 4 mM EDTA sattes till PBS. Den färska algenhomogeniserades med en FastPrep{{0}}-homogenisator (TeenPrep, 6 cykler, 4,0 m·s−1i 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Extraktet filtrerades grovt för att avlägsna skräp, ochfiltratet utsattes för centrifugering vid 20,000 rpm med användning av en cylindercentrifug (Beckman Coulter, Brea, Kalifornien, USA). Den röda supernatanten, kallad cistancheextrakt, uppsamlades ochlagras vid 4◦C i mörkret. Cistancheextraktet utsattes därefter för fraktioneringmed (NH4)2SÅ4 vid 20–60 procent (w/v) mättnad vid 4◦C. Fast ammoniumsulfat var långsamttillsattes genom försiktig omrörning och lösningen fick vila i 2 timmar, följt av centrifugeringvid 10,000 rpm i 20 minuter vid 4◦C och fällningsbildning. Fällningen löstesi PBS (pH 7,4) och dialyserades över natten mot samma buffert. Den dialyserade rödfärgadelösningen skickades genom en 0.22-µm membranfilter (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Rening av cistanche genom jonbyteskromatografi med användning av snabbproteinvätskaKromatografi (FPLC)

De dialyserade proverna av cistanche utsattes för jonbyteskromatografi ien laddad HiTrap DEAE FF-kolonn (5 mL), som förutjämviktades med 50 mM PBS (pH 7,4) innehållande 10 mM NaCl. Efter att proverna passerats genom tvättades kolonnen noggrant med användning av en jämviktsbuffert. Jonbyteskromatografi utfördes därefter med en elueringshastighet av 5 ml/min med linjär gradienteluering som sträckte sig från 0,0 till 500 mM NaCl. De eluerade röda fraktionerna uppsamlades. Den elueradefraktioner analyserades med UV-Vis-spektrofotometri med användning av ett NGC-medeltryckkromatografisystem (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) vid våglängder på 280, 498, 566,och 620 nm. De erhållna cistanchefraktionerna analyserades ytterligare med användning av en absorptionspektrum från 300 till 700 nm och passerade genom en 0.22-µm filter (Merck Millipore,Burlington, MA, USA).

2.3. Cell kultur

Som en murin makrofagcellinje odlades RAW264.7 med DMEM innehållande 4mM L-glutamin, 1,5 g/L natriumbikarbonat och 10 procent FBS.Alla cellinjer bibehölls konsekvent och hölls i en fuktkammare inställd på37 grader med 5 procent CO2, som slogs två gånger per vecka genom att använda standardprocedurer.

2.4. Morfologisk gradering och cellviabilitet

AnalyseraNIH-3T3-celler såddes i en 96-brunnsplatta (1× 104 celler per brunn, Corning, New York, NY, USA) med odlingsmedium och lämnades att sedimentera över natten. Celler behandlades sedan med ett odlingsmedium innehållande {{0}} (negativ kontroll), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 och 10µg/ml cistancheextrakt. Brunnarna innehållande medium kompletterat med 10 procent DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ingick också i försöket som en positiv kontrollgrupp. Efter 24-h inkubation analyserades morfologisk gradering för varje grupp med definitionen från [25], där betygen 0, 1, 2, 3 och 4 representerar ingen, liten,mild, måttlig respektive svår reaktivitet. Odlingsmediet ersattes med 1 mg/ml MTT-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-h efterbehandling och inkuberades i 3 timmar. Isopropanol tillsattes i brunnar efter avlägsnande av MTT-reagenset för att lösa formazan, och plattorna analyserades med en spektrofotometer (Jasco Spectrophotometer V-630) vid en våglängd av 570 nm [26]. Om nivån av cellviabilitet för den högsta dosen av cistancheextrakt var mindre än 70 procent av kontrollgruppen, ansågs det vara cytotoxiskt [25]. Procentandelen av cellviabilitet beräknades med hjälp av följande ekvation:

Cellviabilitet (optisk densitet, OD)=(OD för exponerade celler/OD för kontrollceller)× 100

2.5. Anti-inflammationstest

Att bestämmaanti-inflammationförmågan hos cistanche, interleukin-6 (IL-6) och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF ) upptäcktes i denna studie enligt protokollen som beskrivs i [27,28]. RAW264.7-celler såddes i en 24-brunnsplatta (5× 105 celler/brunn) (Corning, New York, NY, USA) och lämnades att sedimentera över natten vid 37 grader. Nästa dag sambehandlades celler med lipopolysackarider (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och ökande koncentrationer av cistanche (0 (negativ kontroll), 1,25, 2,5, 5, 10 och 20µg/ml). Samtidigt, en ytterligare cellgrupp som samtidigt behandlades med LPS och p38 MAPK-hämmaren SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) etablerades som en positiv kontrollgrupp. Efter 24 timmar samlades supernatanten för varje grupp upp för detektering av producerad IL-6 och TNF- . Supernatantprov applicerades på Quantikine® Kolorimetriska Sandwich ELISA-kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Procent av hämning ( procent )=100× (prov/kontroll). Dessutom utsattes cellerna för en MTT-analys för att utvärdera cellviabilitet efter behandlingar.

2.6. Degranuleringsanalys

Som en basofil leukemicellinje från råtta används RBL-2H3-cellinjen som en modell för mastceller. RBL-2H3-celler uppvisar fenotyper av slemhinnemastceller och är erkända som ett lysande verktyg för att undersöka regleringen av mastcellssvar [29]. Således användes RBL-2H3-cellinjen i detta test för att undersöka den potentiella effekten av cistanche på degranuleringen av mastceller. -hexosaminidas användes som en markör för att övervaka degranuleringen av mastceller [30]. De -hexosaminidasdetektionsmetod modifierades från referensen [31]. RBL-2H3-celler såddes vid 1× 105 celler per brunn i 24-brunnscellodlingsplattor (Corning, New York, NY, USA). Celler behandlades först med 1µM kalciumjonofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) följt av tillsats av olika doser av cistanche (0 (negativ kontroll), 1,25, 2,5, 5, 10 och 20µg/ml) och inkuberades i 2 timmar. Samtidigt, celler som inkuberades med 100µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) användes som en positiv kontroll. Metodiken som används för -hexosaminidas kvantifiering erhölls från tidigare publicerade studier [32,33]. Efter behandling, supernatanten (30µL) från varje brunn samlades upp och överfördes till en ny 96-brunnsplatta innan tillsatsen av 50µL av 4-nitrofenyl N-acetyl- -D-glukosaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/ml i citratbuffert (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Plattan fick stå vid 37 grader i 1 timme och reaktionen avslutades genom tillsats av 80µL av 0,5 M NaOH. Plattan analyserades sedan för eventuell bildning av p-nitrofenolat med användning av en spektrofotometer (Jasco, Halifax, NS, Kanada) vid en våglängd av 405 nm. Celler kvar från den ursprungliga odlingsplattan användes i en MTT-analys för att undersöka cellviabilitet efter behandlingar.

2.7. Hudirritationstest

För att verifiera att lokal applicering inte skulle orsaka irritation på huden, en epidermal vävnad användes för att efterlikna ett scenario där cistanche applicerades på vävnadsnivån. Enbedömning av epidermal irritation är ett nyckeltest för alla medicintekniska produkter eller kosmetiska produkter så att endast produkter som anses vara säkra för huden tillhandahålls konsumenterna. Traditionella djurförsök har rapporterats inte bara orsaka smärta och obehag för testdjur, utan ocksåSådana tester har inte heller alltid varit representativa för de effekter som observerats hos människor; sålunda anses det vara fördelaktigt att använda en rekonstruerad bionisk vävnad eftersom de har många celltyper omgivna av en lokal mikromiljö, som simulerar mänsklig hud in vivo [34]. Effekter av cistanche på hudirritation utvärderades genom att använda den bioniska epidermala vävnaden EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner och med experiment enligt metoden modifierad från referenser [35–37]. Insatserna som innehöll EpiDerm-provet sattes in i en 6-brunnsplatta (Corning, New York, NY, USA) innehållande förvärmt DMEM. Ett belopp på 100µL DMEM innehållande antingen {{0}} (negativ kontroll) eller 1 mg/ml renad cistanche (slutkoncentration 0,1 mg/ml) tillsattes i cellkulturinsatsen ovanpå EpiDerm-provet. Vävnad som behandlades med 5 procent natriumdodecylsulfat (SDS) fungerade som en positiv kontroll. Efter 1-h inkubation i en fuktig miljö på 37◦C, 5 procent CO2 inkubatorn togs inläggen bort och tvättades två gånger med PBS (pH 7,4), följt av placering i en 24-brunnsplatta innehållande 300µL av en 1 mg/ml MTT-lösning (i DMEM). Efter 3-h inkubation applicerades isopropanol för att lösa MTT-formazankristaller. Supernatanten överfördes till en 96-brunnsplatta och provet mättes vid en OD av 570 nm med användning av spektrofotometri. Relativ viabilitet beräknades enligt ekvationen som beskrivs i avsnitt2.4. Kemikalier anses vara irriterande när de minskar cellviabiliteten till mindre än 50 procent (Kategori 2), och kemikalier som resulterar i cellviabilitet på mer än 50 procent anses vara icke-irriterande (ingen kategori) [37]. 

2.8. Prokollagensyntes

TestaHs68-celler inokulerades i en 24-brunnsplatta (2× 105 celler/brunn) och lämnades att sedimentera över natten. Celler behandlades därefter med ett odlingsmedium innehållande {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 och 10µg/ml cistancheextrakt. Den positiva kontrollgruppen behandlades med 100 ng/ml transformerande tillväxtfaktor (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Därefter, 72-h efter behandling, samlades supernatanten från varje prov och utsattes för prokollagendetektion. Monoklonal anti-humant prokollagen typ IC-peptid (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japan). (MK101) användes enligt tillverkarens instruktioner för detektion av prokollagen. Dessutom utfördes MTT-analysen för att utvärdera cellviabilitet efter behandling.

2.9. Statistisk analys

Data analyserades med IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Vi utsatte först data för varje grupp för Kolmogorov-Smirnov-testet för att verifiera att de var normalfördelade ( > 0.05) [40]. Studentst-test användes för att analysera cellviabilitet, IL-6, TNF- , -hexosaminidashämning, epidermala vävnader och prokollagenproduktion. All data presenteras som medel± standardavvikelse (SD), med varje experiment utfört i femdubbla exemplar. Ap-värde < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.