Reaktivt syreartförmedlad apoptos av primära och metastaserade humana koloncancerceller

INTRODUKTION

Kolorektal cancer är en av de vanligaste cancerformerna i världen (Brenneret al., 2014), och dess förekomst ökar ständigt med uppskattningsvis 2,4 miljoner fall 2035, på grund av modern kost och livsstil, tillsammans med minskad fysisk aktivitet. Aktuella ansträngningar är inte tillräckliga för att bekämpa den nuvarande epidemin av kolorektal cancer och därför behövs nya tillvägagångssätt för effektiv förebyggande och behandling inklusive förändringar i livsstil i kombination med säkrare alternativa insatser som fytoterapeutika (Weidneret al., 2015). Fytoterapi, användningen av medicinalväxter för att behandla sjukdomar, har varit en oundviklig del av den antika mänsklighetens historia. Medicinalväxter har länge använts som alternativa behandlingskällor för cancer, och representerar mer än sextio procent av anticancermedel som används inom konventionell medicin (Balunas och Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). Några av de mest kända exemplen inkluderar utdrag frånCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) och Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg och Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Flera örtextrakt och fytokemikalier visades utöva antitumöreffekter vid kolorektal cancer som tillskrivs induktion av produktion av reaktiva syrearter (ROS) och associerad apoptos av cancerceller som i fallet med extrakt frånMelissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Bland fytoterapeutiska kandidater,Cistanche tubulosa, en Orobanchaceae parasitisk ökenväxt (Jiang et al., 2009) som är utbredd i torra och halvtorra regioner i Afrika, Asien och Medelhavsområdet, har visat sig ha värdefulla medicinska egenskaper. Cistanche tubulosa har använts flitigt inom traditionell medicin och föreslås ha botande effekter vid njurbrist, sjuklig leukorré, metrorragi, kvinnlig infertilitet och senil förstoppning (Jiang et al., 2009). Förutom dess traditionella medicinska användningsområden, viktiga läkemedel egenskaperna hos Cistanche Tubulosa har studerats intensivt under det senaste decenniet, inklusive vasorelaxant (Yoshikawa et al., 2006), leverskyddande (Morikawa et al, 2010), antihyperglykemiska och hypolipidemiska effekter (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa föreslogs också som en potent förstärkare av immunsystemet, en promotor för benbildning och ett medel mot åldrande och mot trötthet (Xu et al., 2014). Dessutom har Cistanche tubulosa-extraktet visats blockera amyloidavlagring i Alzheimers sjukdomsmodell (Wu et al., 2015). Trots dess olika terapeutiska användningsområden har effekten av Cistanche Tubulosa som ett potentiellt anticancermedel ännu inte studerats.

I detta arbete har vi undersökt anticancereffekten av Cistanche Tubulosa på två primära och två metastaserande tjocktarmscancercellinjer och de potentiella mekanismerna bakom denna effekt.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIAL OCH METODER

Insamling och beredning av växtextrakt

Proverna av Cistanche tubulosa samlades in från ökenområdena i Qatar 2014 och växtens äkthet bekräftades av herbatologen. Verifikationsprover arkiveras på Toxikologi- och multifunktionsavdelningen vid ADLQ. De soltorkade växtproverna maldes med Retsch Knife Mill Grindomix GM300 till fint pulver. Tjugo gram pulver extraherades med 200 ml ultrarent vatten över natten vid 37 grader på en roterande skakapparat vid 200 rpm. Den råaCistanche tubulosa extrakt (CTE)centrifugerades under 3 0 min vid 8000 rpm för att pelletera olösliga föreningar, supernatanten samlades upp och frystorkades med användning av en Labconco Freezone 6 plus frystork. Det torkade extraktet rekonstituerades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Tyskland) till en koncentration av 20 mg/ml och sterilfiltrerades genom ett 0,2- mikron membranfilter.

Cellinjer och cellunderhåll

Humana kolonkarcinomcellinjer CaCo2, SW620 och LoVo erhölls från Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Tyskland) medan HCT 116-cellinjen var en vänlig gåva från Biological and Environmental Sciences, Department vid Qatar University. CaCo2 och HCT11 härleddes från det primära stället för kolonkarcinom medan SW620 och LoVo härleddes från det metastatiska stället. SW620-, HCT116- och LoVo-celler odlades och hölls i DME-medium medan CaCo2-celler hölls i Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Tyskland). Cellerna odlades som monolager odlade vid 37 grader i respektive medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS, SIGMA, Tyskland) och 1% Penicillin/Streptomycin (SIGMA, Tyskland) i en fuktad atmosfär innehållande 5% koldioxid.

Cellviabilitetsanalys

{{0}}[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium (MTT)-analysen användes för att utvärdera den cytotoxiska aktiviteten hos CTE på liknande sätt som beskrivits tidigare (Jaganjac et al., 2010). Såddätheten för CaCo2-, HCT116-, SW62-0- och LoVo-celler odlade i 96-brunnsplattor var 104 celler per brunn. Celler ströks ut i respektive medium kompletterat med 10 % FBS 24 timmar före behandling. Efter 24 timmar avlägsnades mediet och cellerna behandlades med 0, 0,25, 0,5, 1 och 2 mg/ml CTE under 24, 48 och 72 timmar vid 37 grader i en fuktad atmosfär innehållande 5 % CO2. Efter CTE-behandling avlägsnades mediet och 40 µL MTT-lösning (0,5 mg/ml) sattes till varje brunn.

Efter 3 timmars inkubation avlägsnades MTT-lösningen, formazanprodukten löstes i dimetylsulfoxid (DMSO, SIGMA, Tyskland), och absorbansen mättes vid 590 nm med en mikroplattläsare (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Schweiz) .

Apoptosanalys

Apoptos i CaCo2-, HCT116-, SW620- och LoVo-celler detekterades med PE Annexin V Apoptos Detection Kit I med 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) som ett livsviktigt färgämne (Becton) Dickinson International, Belgien) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat såddes celler i 24-brunnsplattor med en densitet av 5×104 celler/brunn i ett respektive medium kompletterat med 10 % FBS under 24 timmar före tillsatsen av CTE (0, 0,5) eller 1 mg/ml). Efter 24 CTE-inkubation skördades cellerna, tvättades två gånger med kall fosfatbuffrad saltlösning och färgades med Phycoerythrin (PE) Annexin V och 7-AAD i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Färgade celler analyserades inom 1 timme med flödescytometri med användning av FACS. Aria III flödescytometer och FACSDiva-mjukvara (Becton Dickinson) vid låg flödeshastighet med minst 104 celler. Behandling av celler under 4 timmar med 6 µM kamptotecin (SIGMA) användes som en positiv kontroll för analysen.

Intracellulär ROS-produktion

Intracellulär ROS-produktion undersöktes med användning av 2,7--diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA, SIGMA, Tyskland). DCFH-DA är en icke-fluorescerande sond, som oxideras med intracellulär ROS till den fluorescerande föreningen 2,7- diklorfluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA-analysen utfördes på liknande sätt som vi har beskrivit tidigare (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Kortfattat var ympdensiteten för CaCo2-, HCT116-, SW620- och LoVo-celler odlade i 96-brunnssvarta plattor 104 celler per brunn. Celler ströks ut i respektive medium kompletterat med 10 % FBS under 24 timmar. Före behandling inkuberades celler med 10 µM DCFH-DA vid 37 grader under 30 minuter i 5 % CO2 / 95 % luft. Cellerna tvättades sedan och behandlades med 0, 0,5 och 1 mg/ml CTE i mediet utan fenolrött. Den intracellulära ROS-bildningen övervakades kontinuerligt under 25 timmar vid 37 grader och 5 % CO2 med användning av en mikroplattläsare med toppfluorescens och gaskontrollmodul (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Schweiz). Fluorescensintensiteten mättes med en excitationsvåglängd på 500 nm och emissionsdetektion vid 529 nm. De godtyckliga enheterna, relativa fluorescensenheter (RFU), baserades direkt på fluorescensintensitet.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA NJURENS FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generering av mitokondriell superoxid

Förmågan hos CTE att inducera superoxidgenerering av mitokondrier uppskattades med användning av cellpermeabla, mitokondrierriktade MitoSOX Red-sond (Life Technologies) och Hoechst 33342 för nukleär färgning (Life Technologies). CaCo2-, HCT116-, SW62-0- och LoVo-celler såddes i 96-brunnsplattor med en densitet av 104 celler per brunn i ett respektive medium kompletterat med 10 % FBS under 24 timmar . Celler laddades sedan med 4 µM MitoSOX och 2 µM Hoechst 33342 under 20 minuter, överskott av färg tvättades och brunnarna behandlades med 0, 0,5 och 1 mg/ml CTE under 24 timmar vid 37 grader och 5 % CO2. Fluorescensintensiteten mättes med en excitationsvåglängd på 510 nm och emissionsdetektion vid 580 nm för MitoSOX och en excitationsvåglängd på 350 nm och emissionsdetektering vid 461 nm för Hoechst 33342 med användning av en mikroplattläsare 20In fluorescence 20In Trading AG, Schweiz)

Statistisk analys

Beskrivande statistik visades som medelvärdet +/− SD. Betydelsen av skillnader mellan grupper bedömdes med hjälp av Student t-test och Chi-square test. När mer än två grupper jämfördes använde vi ensidig ANOVA med lämplig post hoc-testning. SPSS 11.01 för Mircosoft Windows användes. Skillnader med P mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

RESULTAT

Effekten av CTE på proliferationen av humana koloncancercellinjer visas i figur 1. Alla CTE-koncentrationer som testades visade en stark hämmande effekt på CaCo2-cellinjen på ett koncentrations- och tidsberoende sätt (figur 1A). 72 timmars CTE-behandling hämmade tillväxten av CaCo2-celler med mer än 60% jämfört med kontroll (p < 0.05 för alla koncentrationer). Betydande inverkan av CTE-behandling på HCT116-celltillväxt upptäcktes också vid alla tidpunkter vid de två högsta koncentrationerna (1 mg/ml och 2 mg/ml), och nådde en minskning på mer än 70% vid den senare koncentrationen (Figur IB, p < 0,05). Även om de två lägre CTE-koncentrationerna (0,25 och 0,5 mg/ml) signifikant minskade HCT116-tillväxten av celler efter 24 timmar (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Tids- och koncentrationsberoende hämning av proliferation med CTE bekräftades ytterligare i LoVo-celler med mer än 60% vid högsta koncentration (p < 0.05) (Figur 1C), och alla fyra testade CTE-koncentrationerna minskade tillväxten av SW620-celler efter 48 timmar (Figur 1D, p < 0.05 för alla). Efter 72 timmars behandling observerades samma effekt endast för de två högsta koncentrationerna (p < 0,05) medan koncentrationer på 0,25 och 0,5 mg/ml inte visade någon signifikant effekt jämfört med kontroll (p > 0,05). Effekten av 0,5 och 1 mg/ml CTE-behandling på induktion av apoptos testades ytterligare i alla fyra cellinjerna (Figur 2). Ett ökat antal celler i tidig apoptos upptäcktes i HCT116 och LoVo efter 24-timmesbehandling med 0,5 mg/ml (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:Effekt avCistanche tubulosapå livsdugligheten hos koloncancercellinjer. Cellviabilitet mätt med MTT-analys av (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- och (D) SW620-celler presenteras som en procentandel av den obehandlade tjocktarmscancercellinjen. Medelvärden (±SD) för 5 replikat av det representativa experimentet anges: (*) signifikans sid<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2: Cistanche tubulosa vattenextrakt inducerar apoptos i humana koloncancerceller. Annexin-V-FITC flödescytometrianalyser av (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo och (D) SW620-celler presenteras som procentandel av obehandlad tjocktarmscancercellinje. Medelvärden (±SD) för 3 replikat av det representativa experimentet anges: (*) signifikans sid<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 3: Cistanche tubulosa vattenextrakt inducerar intracellulär ROS-produktion i ett tids- och dosberoende. ROS-produktion mätt med DCFH-DA-analys i (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- och (D) SW620-celler presenteras som RFU-medelvärden (±SD) för respektive 5-replikat av ett representativt experiment. (*) Betydelse sid<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Fig. 4: Cistanche tubulosa vattenextrakt inducerar mitokondriell superoxidproduktion i humana tjocktarmscancerceller. Fluorescensintensiteten för mitokondrierinriktade MitoSOX Röd sond i A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- och (D) SW620-celler presenteras som en procentandel av obehandlad koloncancercellinje. Medelvärden (±SD) för 5 replikat av det representativa experimentet anges: (*) signifikans sid<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKUSSION

Även om tidigare studier har rapporterat många medicinska egenskaper hos Cistanche tubulosa, är detta den första rapporten om dess anti-proliferativa effekt i maligna celler. Cistanche tubulosa bioaktiva föreningar extraherade med vatten, ett mycket polärt lösningsmedel, visade stark anticancerbioaktivitet. Vi har tidigare jämfört effektiviteten av Cistanche tubulosa solubiliserad i vatten mot andra lösningsmedel som metanol och etylacetat, men vattenextrakt uppvisade de mest lovande anticanceraktiviteterna (data visas inte).

Vi har visat förmågan hos CTE vid 1 mg/ml och 2 mg/ml att hämma 60 % av tillväxten av både primära och metastaserande koloncancercellinjer, vilket avslöjar en potentiellt viktig roll förCistanche tubulosasom behandling av tjocktarmscancer. Jämfört med normala celler kännetecknas cancerceller generellt av en störning i redoxhomeostas och en vanlig strategi för nuvarande anticancerterapier är att öka cellulär oxidativ stress (Yang et al, 2013). Även om fysiologiskt låga nivåer av ROS har en viktig roll som signalmolekyler, kan överdriven ROS-produktion bidra till cancerinstabilitet och malignitet (Liou och Storz, 2010). Paradoxalt nog gör denna obalans i cellulär redoxhomeostas cancerceller mer sårbara för ROS-inducerad celldöd (Jaganjac et al., 2008; Nogueira och Hay, 2013). Den anti-proliferativa effekten av CTE som rapporterats i denna studie kan förmedlas av olika extra- och intracellulära mekanismer av kända och okända föreningar i extraktet, riktade mot flera vägar som spelar viktiga roller i apoptos. För att skilja mellan olika former av celldöd undersökte vi den potentiella mekanismen som är ansvarig för den observerade CTE-inducerade cytotoxiciteten.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Våra data indikerar att CTE ökar intracellulär ROS-produktion och följaktligen ROS-inducerad celldöd. Redoxtillståndet i cellen spelar också en avgörande roll för att reglera apoptos och den mitokondriella elektrontransportkedjan är en av de viktigaste platserna för cellulär ROS-generering (Trachootham et al., 2008). Dessutom kan den intracellulära ROS orsaka cellulär apoptos via både mitokondrierberoende och oberoende vägar (Sinha et al., 2013). Faktum är att våra data också indikerar att CTE-inducerad fosfatidylserin-externisering är en vanlig effekt vid apoptos, i både primära och metastaserande cancercellinjer, vilket tyder på att mekanismen för CTE-inducerad död förmedlas av apoptos snarare än nekros. Aktiveringen av apoptos i cancerceller är en korrigerande strategi och många anticancerläkemedel kan utöva apoptotiska effekter i cancerceller.

Föreningar eller extrakt med pro-apoptotisk aktivitet i cancerceller är därför potentiellt användbara i läkemedelsforskning mot cancer (Wong, 2011). För att avgöra om den CTE-inducerade pro-apoptotiska effekten förmedlas av mitokondrierinducerad ROS-mekanism, mätte vi superoxidproduktion med en mitokondrierriktad fluorescerande sond i CTE-behandlade celler. Våra data visar tydligt att CTE stimulerar mitokondriell superoxidproduktion, vilket tyder på att Cistanche tubulosa anticanceraktivitet åtminstone delvis förmedlas genom mitokondrierinducerad ROS-mekanism.

SLUTSATSER

Sammanfattningsvis tyder våra data på att vattenextraktet från ökenväxten Cistanche tubulosa kan representera en lovande kandidat för en anticancerstrategi i kombination med andra konventionella terapier för förebyggande och behandling av tjocktarmscancer. Vi visar också att toxiciteten hos växtextraktet mot cancerceller medieras av ökad intracellulär ROS-produktion och, åtminstone delvis, av mitokondrieberoende apoptos. Ytterligare studier pågår för att isolera och karakterisera de individuella biologiskt aktiva beståndsdelarna som är ansvariga för anticanceraktivitet.

Mer forskning behövs för att utvärdera den potentiella användningen av detta extrakt som ett effektivt kemopreventivt medel och för att förstå verkningsmekanismerna på tjocktarmscancerceller på molekylär nivå. Ytterligare prekliniska och kliniska studier behövs också för att bekräfta de observerade gynnsamma hälsoeffekterna avCistanche tubulosa för att förebygga cancer.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE FÖRBÄTTRAR MINNET ANTI-TRATTHET PHGS75% ECH 30% ACT 12%