för mer information:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²och Elena Levtchenko^1,*

^{Del I: Njur- och extranjurmanifestationer hos vuxna zebrafiskmodeller av cystinos}

¹Laboratory of Pediatric Nephrology, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgien; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Institutionen för patologi, Leiden University Medical Center, 2300 RC Leiden, Nederländerna; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Neural Circuit Development and Regeneration Research Group, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgien; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, Division of Animal and Human Health Engineering, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgien; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Molecular Neurobiology, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Belgien; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Institutionen för pediatrisk medicin, enheten för laboratorium för metabolisk biokemi, Bambino Gesù barnsjukhus, IRCCS, 00146 Rom, Italien; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgien; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Department of Pediatric Nephrology, Radboud University Medical Center, 6525 GA Nijmegen, Nederländerna

^*Korrespondens: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: plus 32-16-34-38-22

^† Dessa författare bidrog lika mycket till detta arbete.

Abstrakt:Cystinosär en sällsynt, obotlig, autosomal recessiv sjukdom orsakad av mutationer i CTNS-genen. Denna gen kodar för den lysosomala cystintransportören cystinos, vilket leder till ackumulering av lysosomal cystin i alla kroppens celler, med njurarna som de först drabbade organen. Den nuvarande behandlingen med cysteamin minskar cystinackumulering men vänder inte den proximala tubulära dysfunktionen, glomerulär skada eller förlust avnjur-fungera. I vår tidigare studie har vi utvecklat en zebrafiskmodell av cystinos genom en nonsensmutation i CTNS-genen och har visat att zebrafisklarver rekapitulerarnjurefenotyp som beskrivs hos människor. I den aktuella studien karakteriserade vi den vuxnecystinoszebrafiskmodell och utvärderade sjukdomens långsiktiga effekter pånjureoch extrarenal organ genom biokemiska, histologiska, fertilitets- och lokomotoriska aktivitetsstudier. Vi fann att vuxencystinosZebrafisk uppvisar cystinansamling i olika organ, förändrad njurmorfologi, försämrad hudpigmentering, minskad fertilitet, förändrad rörelseaktivitet och okulära anomalier. Sammantaget visar våra uppgifter att den vuxnecystinosZebrafiskmodellen reproducerar flera mänskliga fenotyper av cystinos och kan vara användbar för att studera patofysiologi och långtidseffekter av nya terapier.

Nyckelord:njuresjukdom;cystinos; zebrafiskmodell;njur-och extrarenal manifestation; fenotypiska egenskaper hos vuxna

1. Introduktion

Cystinosär en autosomal recessiv lagringsstörning orsakad av mutationer i CTNS-genen som kodar för den lysosomala cystinprotonen co-transporter cystinos, som transporterar cystin från den lysosomala lumen till cytosolen. Flera organ är involverade i sjukdomen, såsom muskler, testiklar, ögon och hjärna, och bland allt,njurarär de första och mest allvarligt drabbade organen [1]. Den vanligaste och allvarligaste kliniska varianten är den infantila nefropatiskacystinos, där den första kliniska manifestationen ärnjur-Fanconis syndrom, kännetecknat av en försämrad proximal tubulär epitelcell

(PTE) reabsorption som resulterar i urinförlust av aminosyror, glukos, lågmolekylära till medelmolekylära proteiner och andra metaboliter. PTEC-skadan följs av progressiv glomerulär dysfunktion och, när den lämnas obehandlad, leder den till slutstadietnjuresjukdom [1]. Det nuvarande terapeutiska tillvägagångssättet består av cysteamin, som är en cystinutarmande aminotiol som bryter disulfidbryggan av cystein, vilket resulterar i bildandet av aminosyracystein och en cysteamin-cysteinblandad disulfid. Den sistnämnda molekylen kan lämna sosomer via aminosyratransportören PQLC2[2]. Men behandling med cysteamin, även om den minskar lysosomala cystinackumulering, fördröjer bara sjukdomens utveckling [3–5]. Därför ytterligare förståelse av patogenesen avcystinosoch att utveckla nya är våldtäktsalternativet fortfarande på forskningsagendan. Flera djurmodeller har utvecklats för att rekapitulera cystinosfenotypen [6,7]. En av de mest använda modellerna är musen Ctns−/− C57BL/6, som utvecklar cystinackumulering och mild proximal tubulopati. Den visar dock inte glomerulär skada och fenotypen har visat sig vara beroende av den genetiska bakgrunden [8].

Hittills har zebrafiskmodeller blivit ett attraktivt verktyg för att undersöka mänskliga sjukdomar på grund av flera fördelar som deras snabba utveckling, höga fruktsamhet, lägre underhållskostnader och tillgången på lätttillämpbara genredigeringsteknologier [9]. I en tidigare studie presenterade vi en medfödd zebrafisklarvmodell med en homozygot nonsensmutation i exon 8 av ctns−/− genen, vilket resulterade i en funktionell förlust av cystinos [10], vilket leder till cystinackumulering i hela kroppen, ökad larver deformitet, försenad utveckling, ochnjureskada. Långsiktiga sjukdomskonsekvenser hos vuxna zebrafiskar har dock ännu inte studerats. I den aktuella studien syftade vi till att karakteriseranjur-och extrarenala manifestationer i den vuxna zebrafiskmodellen avcystinos.

Klicka till OrganicCistanche för njursjukdom

2. Resultat

2.1. Cystin ackumuleras i Ctns−/− Zebrafish

Cystinosanses vara en multisystemisk störning som resulterar i cystinansamling i alla kroppens celler. I vårt tidigare arbete fann vi att cystinos (ctns−/−) zebrafiskar uppvisar cystinackumulering från larvstadiet av utveckling och i flera organ upp till 8 månaders ålder [9]. För att utvärdera om vår modell upprätthåller cystinackumulering i de senare stadierna av sjukdomen, mätte vi cystinnivåer i hela kroppen,njure, testiklar, ögon, muskler och hjärna hos 18-månadsgamla ctns−/− zebrafiskar jämfört med åldersmatchade zebrafishar av vildtyp. Vi fann en 54-faldig ökning av cystininnehållet i hela kroppen (Figur 1A) och en 146-faldig ökning av njuren (Figur 1B) av ctns−/− zebrafish jämfört med vildtypszebrafisk. Dessutom observerade vi omfattande cystinansamling i testiklarna, ögonen, musklerna och hjärnan (Figur 1C-F) hos ctns-/- zebrafiskar.

2.2. Njurmanifestation

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish Present PTEC-skada

Sedannjureär det mest allvarligt drabbade organet, undersökte vi de histologiska egenskaperna hos njuren med hjälp av Hematoxylin och Eosin(H&E) och Periodic Acid-Shiff(PAS) färgning. Vi noterade närvaron av grumlig svullnad, hyalinliknande eosinofila droppar och cytoplasmatiska vakuoler i PTEC av ctns-/- zebrafiskar (Figur 2B, D) men inte i vildtypszebrafiskar (Figur 2A, C). Notera att ingen distal tubulär skada hittades. Cystinkristaller observerades tidigare i PTEC som cytoplasmatiska vakuoler med rektangulära eller polymorfa former [11]. Därför undersökte vi om dessa strukturer också fanns i tubuli av zebrafisk. Vi hittade många cytoplasmatiska vakuoler i PTEC av ctns-/- zebrafiskar genom toluidinblå färgning (Figur 3B, D, indikerad med asterisker). Dessutom hittade vi vakuumutrymme med rektangulära eller polymorfa former (Figur 3B, D, indikerad med pilspetsar). Vi bekräftade detta fynd genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) (Figur 3F). Dessa strukturer fanns inte i PTEC hos vildtypszebrafiskar (Figur 3A, C, E). Intressant nog, förutom närvaron av polymorfa-formade vakuoler, observerade vi en partiell förlust av borstgränsen i PTEC-ultrastruktur (Figur 3F).

Figur 1. Cystininnehåll i homogenat av vildtyp och ctns−/− zebrafisk. (A–F) Cystininnehåll i hela kroppen (A),njure(B), testiklar (C), ögon (D), muskler (E) och hjärna (F) hos vildtyps- och ctns−/− 18-månadsgamla zebrafiskar. Cystinkoncentrationen uttrycks som nmol/mg protein. Varje prick representerar en zebrafisk, totalt n=3 vildtyp och n=3 cent−/− 18-månadsgamla zebrafiskhanar; oparat t-test med Welchs korrigering, tvåsidigt: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Figur 2.Njurehistologi hos vildtyp och ctns−/− zebrafisk. (A, B) Representativa bilder avnjur-tubuli av vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månadsgamla zebrafiskar. Detaljer om proximala tubuli med hyalinliknande eosinofila droppar (svarta pilspetsar) och cytoplasmatiska vakuoler (*). H&E-färgning. Skalstaplarna representerar 50 µm. (C,D) Representativa bilder av PAS-färgning av njurtubuli av vildtyp (C) och ctns-/- (D) 18-månadsgamla zebrafiskar. Detaljer om proximala tubuli med hyalinliknande droppar (svarta pilspetsar) och cytoplasmatiska vakuoler (*). PAS-färgning. Skalstaplarna representerar 50 µm. PT: proximal tubuli; DT: distal tubuli.

Figur 3.Njurecystinkristaller i vildtyps- och ctns−/− zebrafisk PTEC. (A,B) Representativa toluidin blåfärgade bilder avnjur-proximala tubuli i vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månader gamla zebrafiskar. Skalstaplarna representerar 50 µm. (C,D) Figurerna 3C, D visar en högre förstoring av figur 3A,B. Detaljer om njurproximala tubuli med cytoplasmatiska vakuoler ((D); *), rektangulära och polymorfa vakuolära utrymmen ((D); svarta pilspetsar). (E, F) Representativa TEM-bilder av den renala proximala tubuli av vildtyp (E) och ctns−/− 18-månadsgamla zebrafiskar (F). (F) Partiell förlust av proximaltubulebrushborders(PB) och ackumulering av rektangulära och polymorfa vakuoler (*) observerades i den renala proximala tubuli av ctns-/- zebrafisk. Vyn med hög förstoring av rektangeln i det nedre högra hörnet visar de polymorfa vakuolerna och en stor vakuol med raka membrankantsegment (en rak linje). Skalstaplarna representerar 5 µm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish visar glomerulär hypertrofi

Eftersom glomerulära skador vanligtvis följer PTEC-lesioner, utvärderade vi den glomerulära histologin för ectns-/- zebrafiskarna, och vi observerade att ctns-/− malezebrafiskarna visade signifikant förstoring av Bowmans kapsel (Figur 4B, E4) och glomerulärt utrymme (Figur B, B, 4 men inte B, B tu) , G) jämfört med vildtypszebrafiskhanar (Figur 4A, E–G). Detsamma bekräftades för glomerulär tuft hos kvinnlig zebrafisk som bär på ctns-/− mutationen (Figur 4F), och en liknande trend observerades vid mätningar av Bowmans utrymme och Bowmans kapsel (Figur 4E, G). Ingen proliferation av mesangiala celler eller glomeruloskleros observerades. På TEM-bilderna observerade vi inga förändringar på det glomerulära basalmembranet, podocytfotprocessen eller onormalt fenestrerade endotelceller i glomeruli av ctns-/- zebrafisk (Figur 4D) jämfört med vildtypszebrafisk (Figur 4C).

Figur 4. Glomerulär morfologi hos vildtyp och i ctns−/− zebrafisk. (A, B) Representativa bilder av glomerulus av vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månadsgamla zebrafiskar. PAS-färgning. Skalstaplarna representerar 50 µm. (C,D) Representativa TEM-bilder av glomerulus av vildtyp ( ctns−/− (D) zebrafisk. Skalstreckarna representerar 1 µm. (E–G) Kvantifieringen av ytareorna på Bowmans kapsel (E), glomerulär tofs (F) och Bowmans utrymme (G) av vildtyp och zebrafisk i båda könen.

2.2.3. Ctns−/− Zebrafish visar ökad apoptos på PTEC-nivå

Därefter undersökte vi omcystinosutlöste celldöd i vår zebrafiskmodell [10,12]. Vi utförde klyvd kaspas-3 immunfärgning injur-vävnader av vildtyp och ctns-/- zebrafisk och vi observerade en signifikant ökning av kluvna caspase3-proteinnivåer i PTEC av ctns-/− zebrafisk (Figur 5B, D, G) jämfört med vildtypszebrafisk (Figur 5A, C, G) hos båda könen. Uttrycket av klyvt kaspas-3 var huvudsakligen närvarande i celler som visar de polymorfa cytoplasmatiska vakuolerna (Figur 5B, D). Inget uttryck av kluvet kaspas-3 var närvarande i glomeruli, både i vildtyp och ctns−/− zebrafisk (Figur 5E, F).

Figur 5. Ökad apoptos i PTEC med vakuoler i ctns−/− zebrafisk. (A, B) Representativa bilder av den klyvda caspas-3-immunfärgningen av tubuli av vildtyp (A) och ctns-gamla zebrafiskar. Skalstaplarna representerar 50 µm. (C,D) De nedre panelerna visar en högre förstoring av de boxade områdena i de övre panelerna. Detaljer om PTEC med cytoplasmatiska vakuoler (*). Skalstaplarna representerar 50 µm. (E, F) Representativa bilder av den kluvna caspas-3-immunfärgningen av glomerulus av vildtyp (E) och ctns-/- (F) 18-månadsgamla zebrafiskar. Skalstaplarna representerar 50 µm. (G) Kvantifieringen av det tubulära kaspas{10}}-färgningspositiva området i vildtyp och zebrafisk i båda könen. Varje prick representerar en zebrafisk, totalt n=3 vildtyp och ctns−/− 18-månadsgamla zebrafiskar. Tvåvägs ANOVA med Fishers minst signifikanta skillnad (PLSD) test: ** p < 0,01;="" ***="" p=""><>

2.3. Extra njurmanifestationer

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish visar ett karakteristiskt hypopigmenterat fläckigt hudmönster

Cystinospatienter visar ofta för tidigt åldrande av huden, hypopigmentering och blont hår [1,13]. Intressant nog observerade vi ett hypopigmenterat prickmönster av huden på ctns−/− zebrafisk, medan vildtypsfiskar presenterade det typiska svartrandiga mönstret. Fenotypen finns hos båda könen under hela deras liv (Figur 6A, B). För att undersöka skillnaden i pigmentering utförde vi PAS-färgning på zebrafiskhuden och vi fann att ctns−/− zebrafish visar förändrad fördelning av melaninskiktet i epidermis, vilket orsakade det ljusfläckiga mönstret (Figur 6C, D).

Figur 6. Hypopigmenterat fläckigt hudmönster hos ctns−/− zebrafiskar. (A, B) Representativa bilder av vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månadsgamla zebrafiskar. Skalstreckarna representerar 0,5 cm. De svarta pilspetsarna indikerar de olika randiga hudmönstren. (C,D) PAS-färgade bilder av epidermis hos vildtyp (C) och ctns−/− (D) 18-månadsgamla zebrafiskar. De svarta pilspetsarna framhäver melaninskiktet. Avbrottet i melaninskiktet finns i ctns−/− (D) medan det saknas i vildtypszebrafisk (C). Skalstaplarna representerar 50 µ

2.3.2. Ctns−/− Zebrafisk visar spermatogena cystor berikade med spermier

Cystinosär känt för att påverka testiklarnas funktioner, vilket resulterar i azoospermi och infertilitet hos manliga patienter [14–16]. Ursprunget till azoospermi är fortfarande oklart, även om spermatogenesen har visat sig vara intakt på testikelnivå. I motsats till manliga patienter är kvinnor med cystinos fertila [17]. I vår zebrafiskmodell är både kvinnliga och manliga ctns−/− zebrafiskar fertila. För att undersöka om ctns−/− mutation påverkar testikelns anatomi utförde vi PAS-färgning och vi fann ökad ansamling av spermier i de spermatogena cystorna hos ctns−/− zebrafiskar

Figur 7. Spermatogena cystor berikade på spermier i ctns−/− zebrafiskar. (A, B) Representant H&E färgade bilder av testiklar av vildtyp (A) och ctns−/− (B) 18-månadsgamla zebrafiskar. Mörkblå och rundad färgning representerar de spermier som samlats i de spermatogena cystorna (anges med asteriskerna). Skalstaplarna representerar 200 µm.

2.3.3. Ctns−/− Zebrafiskhonor visar minskad äggproduktion

För att undersöka reproduktionssystemets funktionalitet mätte vi äggproduktionen och andelen befruktade ägg hos både vildtyps- och ctns−/− zebrafisk. Vi fann att ctns-/-honor visar en minskad äggproduktion (Figur 8A) och minskad andel befruktade ägg (Figur 8B) jämfört med vildtypshonorna.

Figur 8. Äggproduktion och procentandel befruktade ägg i vildtyp och ctns−/− zebrafisk. (A) Äggproduktionen mättes som ett totalt antal ägg i vildtyps- och ctns−/− zebrafisk 18-månadsgamla zebrafiskar. Äggproduktionshastigheten är 1,941 hög hos vildtypszebrafisk jämfört med ctns−/− 18 månader gammal zebrafisk (hastighetsförhållande=1.941); 95 procent CI (nedre gräns=1.165, högre gräns=3.234); Poisson regressionsanalys; p=0.011. (B) Andelen befruktade ägg mättes på det totala antalet ägg. Oddsen för de befruktade äggen är 3,504 höga i vildtypszebrafiskar jämfört med ctns−/− 18-månader gamla zebrafiskar (oddskvot=3.504); 95 procent CI (nedre gräns=2.005, högre gräns=6.124); Logistisk regressionsanalys; p < 0,001;="" n/a:="" ej="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafisk visar minskad rörelseaktivitet

Sedan muskelförtvining och svaghet har diagnostiserats icystinospatienter, i allmänhet från det andra decenniet av livet [1,18], utvärderade vi rörelseaktiviteten i vår zebrafiskmodell. Vi upptäckte att ctns-/- zebrafiskar från båda könen visade minskad rörelseaktivitet jämfört med vildtypszebrafisk, vilket tyder på en försämrad muskelfunktion (Figur 9). Histologisk analys av skelettmuskelvävnad avslöjade dock inte uppenbara abnormiteter i ctns-/- zebrafisk.