Njurskyddande effekt av Beluga-linsförbehandling för ischemi-reperfusionsskada

Syng-ook Lee,¹ Så ung Chun,²EunHye Lee,²Bomi Kim,²BoHyun Yoon,² et al

Bakgrund och mål. Ischemi/reperfusion (I/R) skada, orsakad av akutnjureskada, orsakar histopatologiska förändringar, tubulicellapoptos, inflammation, oxidation och förlust av njurfunktion. Vi utvärderade de skyddande effekterna mot I/R-skada av förbehandling av belugalinser. Material och metoder. Möss delades in i fyra grupper: normala, obehandlade, låg- (2 mg) och högdos (8 mg) belugalinsbehandlingsgrupper. Beluga linser administrerades oralt i 2 veckor, följt av bilateral njurischemi i 20 minuter och reperfusion i 30 minuter. Blodprover ochnjurevävnader samlades in och analyserades för att undersöka njurfunktion, histopatologi, epitel- och endotelcellerskada, apoptos, oxidativ stress och inflammatoriska reaktioner. Resultat. De förbehandlade grupperna bibehöll njurfunktionen, med signifikant lägre nivåer av ureakväve i blodet (BUN) och kreatinin jämfört med de andra grupperna. Den histopatologiska analysen visade minskad proximal tubuliskada och minskad skaderelaterad molekyl (njureutsöndring av skademolekyl 1 (KIM-1) och neutrofil gelatinas-associerad lipokalin (NGAL) i de förbehandlade grupperna jämfört med de andra grupperna. Terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick-end-märknings- (TUNEL-) positiva celler och utsöndringen av apoptosrelaterade molekyler (Fas och kaspas 3) reducerades signifikant i de förbehandlade grupperna jämfört med de andra grupperna. De förbehandlade grupperna visade positivt uttryck av mikrokärlassocierad gen (differentieringskluster (CD31)) och negativ adhesionsmolekyl (intracellulär adhesionsmolekyl 1 (ICAM-1)). En antioxidanteffekt observerades i förbehandlingsgrupperna, med minskat uttryck av malonaldehyd (MDA) och ökad utsöndring av antioxidantenzym (superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT), glutation (GSH) och glutationperoxidas (GPx)). I de förbehandlade grupperna hämmades F4/80 plus makrofager och CD4 plus T-cellsinfiltration och nivåerna av proinflammatoriska cytokiner (interleukin-(IL-)1, IL-6 och tumörnekrosfaktor-(TNF-)) minskade; Men nivåerna av antiinflammatoriska cytokiner (transformerande tillväxtfaktor- (TGF-), IL-10 och IL-22) ökade. Slutsatser. Beluga-linsförbehandling visade skyddande effekter mot I/R-inducerad njurskada, via antiapoptotiska, antiinflammatoriska och antioxidanta aktiviteter.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedadesdeserticola förhindrarnjuresjukdom, klicka här för att få provet

1. Introduktion

Ischemi/reperfusionsskada (I/R) under partiell nefrektomi eller njurtransplantation, orsakar akutnjur-skada [1, 2] och kan resultera i en irreversibel försämring av njurfunktionen [3]. Ischemi utlöser apoptos i tubulära njurepitelceller, vilket förstärker de inflammatoriska svaren hos interstitiella celler. Reperfusion inducerar mikrovaskulär skada, vilket främjar inflammatorisk cellmigration, genom adhesionsfaktoruttryck på ytan av endotelceller [4-8]. I/R-skada orsakar också oxidativ stress, ökande reaktiva syrearter (ROS) och minskad antioxidantenzymaktivitet [9], vilket resulterar i ökad produktion av pro-inflammatoriska faktorer [10], aktivering av kaspasvägar och ökad apoptotisk celldöd, vilket så småningom orsaka förlust av njurfunktion [11]. För att förhindra I/R-inducerad njurskada har användning av antioxidanter, med antiinflammatoriska och antiapoptotiska funktioner, föreslagits [10–14].

Linssorter (gröna, röda, franska eller beluga) innehåller olika bioaktiva föreningar, särskilt antioxidanter [15]. Deras totala innehåll av polyfenol och flavonoid varierar från 27,30–30,30 mg (garvsyraekvivalenter)/g till 13,14–16,29 mg (quercetinekvivalenter)/g respektive [16]. Beluga-linser har visat sig ha signifikant höga polyfenolhalter och ROS-rensande effekter [16]. Vårt team rapporterade antioxidanteffekterna av linser, med hjälp av ett in vitro levercellinjeexperiment [16]. Beluga-linser visade signifikanta skyddseffekter mot alkoholinducerad cytotoxicitet i AML-12-celler jämfört med andra linssorter. De antiinflammatoriska effekterna av belugalinser observerades också i lipopolysackaridbehandlade RAW264.7-celler [17]. Beluga-linsbehandling minskade signifikant produktionen av kväveoxid (NO) och uttryck av inducerbart NO-syntas (iNOS) genom uppreglering av den nukleära faktor E2-relaterade faktorn 2- (Nrf2-) medierad heme oxygenas-1 (HO-1) väg. Dessa in vitro-experiment antydde de antioxidativa och antiinflammatoriska effekterna av belugalinser.

För att utöka användningen av belugalinser applicerade vi dem på en musmodell med njurskador på I/R-skada och utvärderade de njurskyddande effekterna. För detta experiment administrerades belugalinser i 2 veckor, som en förbehandling, följt av ischemi i 20 minuter och reperfusion i 30 minuter. De njurskyddande effekterna av förbehandling av belugalinser verifierades genom att analysera njurfunktion, histopatologi, epitel- och endotelcellskada, apoptos, oxidativ stress och inflammatoriska svar. Vi antog att förbehandling med belugalinser skulle förhindra I/R-inducerad njurskada, via antioxidant, anti-inflammatorisk och antiapoptotisk aktivitet.

2. Material och metoder

2.1. Djurgrupper och behandlingsförhållanden.

Alla procedurer utfördes med hjälp av ett djurprotokoll som har godkänts av Yeungnam University Institutional Animal Care and Use Committee (AEC2019-003). Möss (ICR, 8 veckor gamla, hanar, 23–25 g, Orient, Seongnam, Korea) delades slumpmässigt in i följande 4 grupper (n =7 per grupp): (1) Normal, normal kontrollgrupp; (2) Obehandlad, saltlösningsbehandlad grupp; (3) Låg, låg dos (2 mg/100 μL koksaltlösning/-BioMed Research International mus), 14-dag oralt administrerad förbehandlingsgrupp för belugalinser; och (4) Hög, hög dos (8 mg/100 μL koksaltlösning/mus), 14-dag oralt administrerad beluga-lins, förbehandlingsgrupp. Beluga-linser tillhandahölls av Prof. Syng-Ook Lee (Keimyung University, Daegu, Korea), och extraktberedningen och analys av bioaktiva föreningar rapporterades i en tidigare studie [16]. Efter behandling placerades djuren i liggande position, under narkos och ett ryggsnitt gjordes [1]. Njurartären och venerna för båda njurarna tilltäpptes med en vaskulär klämma i 20 minuter, följt av reperfusion i 30 minuter, enligt ett tidigare beskrivet protokoll [18, 19]. Blod samlades in genom hjärtpunktion och njurarna extraherades. Njurarna tvättades med fosfatbuffrad saltlösning; en njure användes för RNA- och proteinextraktion, medan den andra njuren användes för histologisk analys.

2.2. Histopatologiska och immunhistokemiska (IHC) analyser.

Histopatologiska undersökningar utfördes med användning av hematoxylin och eosin (H&E)-färgning, och skador utvärderades baserat på följande faktorer: närvaron av tubuliceller som faller in i lumen, kärnförlust i exfolierade celler, luminalt skräp, kollapsat luminalt utrymme och immuncellsinfiltering . Poängen uppnåddes av en patologisk specialist: poäng 0, ingen tubulär skada; poäng 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 procent av tubuli skadade. För IHC-analys fixerades njuren med 4 procent paraformaldehyd och parafininbäddade prover skars i 5 μm sektioner. H&E- och IHC-färgning utfördes efter rutinprocesser. Primära antikroppar mot immuncell (F4/80 och kluster av differentiering 8 (CD8), Abcam, Cambridge, Storbritannien) och endotelcell (CD31 och intracellulär adhesionsmolekyl 1 (ICAM-1), Abcam) markörer applicerades på sektioner , under 24 timmar vid 4 grader (spädning 1:200), följt av den sekundära antikroppen (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), i 1 timme vid rumstemperatur och 4′,6-diamidino{ {19}}fenylindol (DAPI) användes för att färga kärnor.

2.3. Proteinanalys.

För njurfunktionsanalys separerades serum, utan ett antikoagulant, och serumkoncentrationer av kreatinin och blodureakväve (BUN) detekterades med användning av ett Kreatinin Colorimetrisk Assay Kit och ett Quanti- Chrom Urea Assay Kit (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA ), respektive. För att bedöma skada på njurtubuli/kärl, oxidativ stress, antioxidantenzymer och apoptos, homogeniserades njurvävnad med varje buffert. För att analysera skada på epitelceller i njurtubuli utvärderades koncentrationer av njurskadamolekyl-1 (KIM-1) och neutrofilgelatinasassocierat lipokalin (NGAL) med hjälp av enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) (USCN Life Science Inc. ., Wuhan, Kina). För att analysera apoptos mättes Fas- och kaspas 3-koncentrationer med användning av respektive ELISA-kit (Abcam). För att utvärdera oxidativ stress mättes nivåerna av malonaldehyd (MDA) med ett MDA-analyskit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, Kina). Antioxidantenzymer, inklusive superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT), glutation (GSH) och glutationperoxidas (GPx), mättes med en total SOD-analyssats (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), ett CAT-analyskit ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), ett GSH fluorometriskt analyskit respektive ett GPx Assay Kit (BioVision Inc.). Alla kit användes enligt tillverkarens instruktioner.

2.4. Analys av genuttryck.

Totalt RNA extraherades med TRIzol-reagenset och cDNA syntetiserades från 20 ug totalt RNA med användning av ett cDNA-synteskit (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Realtids-PCR-förhållandena var följande: 95 grader i 10 minuter, följt av 40 cykler med 95 grader i 10 sekunder, 60 grader i 50 sekunder och 72 grader i 20 sekunder. Genamplifiering detekterades med användning av SYBR green, och 2−ΔΔCt-metoden användes för att analysera uttryck. Experiment utfördes i tre exemplar, med användning av följande primersekvenser: interleukin- (IL-) 1 , 5'-gcccatcctctgagactcat-3' och 5'-aggccacagg- tattttgtcg-3′; IL-6, 5'-agttgccttcttgggactga-3' och 5' -tccacgatttcccagagaac-3′; tumörnekrosfaktor- (TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3' och 5'-ctccctttgcagaactcagg-3′; transformerande tillväxtfaktor- (TGF-), 5'-tggttgtagaggg- caaggac-3' och 5'-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ och 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ och 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; och glyceraldehyd-3'-fosfatdehydrogenas (GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3' och 5'-cctgcttcacc- caccttcttga-3'.

2.5. TUNEL-analys.

För att bedöma apoptos utfördes en TdT-medierad dUTP nick-end-märkning (TUNEL) analys med ett apoptosdetektionskit (Chemicon, Bedford, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Kort, avparaffinerade och rehydrerade objektglas digererades med 2 0 ug/ml proteinas K, vid 37 grader i 15 timmar, för att avlägsna proteiner, och behandlades med 3,0 procent väteperoxid, för att släcka endogent peroxidas. Objektglasen nedsänktes i 1x TdT-jämviktsbuffert och en arbetsstyrka av TdT-enzymet tillsattes under 1 timme vid 37 grader. Ett anti-digoxigeninkonjugat applicerades på 3'-OH DNA-terminalen under 30 minuter och färgen framkallades med användning av ett peroxidassubstrat under 3 minuter. Efter DAPI-behandling monterades objektglasen. TUNEL-positiva kärnor räknades i alla visuella fält i varje vävnadsprov, under 200x förstoring.

2.6. Statistisk analys.

Alla värden uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Signifikanta skillnader för I/R-njurskadagruppen och beluga lins-I/R-förbehandlingsgrupperna utvärderades med hjälp av en variansanalys, följt av Tukeys post hoc-test, i SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9.{{ 2}}; Chicago, IL, USA). p-värden < 0.05="" ansågs="">

cistanche salsa fördelar

3. Resultat

3.1. Effekter av förbehandling av Beluga-linser på njurfunktionen.

De förbehandlade grupperna visade båda signifikanta skyddseffekter mot I/R-skada (Figur 1). De genomsnittliga BUN- och serumkreatininkoncentrationerna i den obehandlade gruppen var 89:92 ± 7:29mg/dL respektive 0:48 ± 0:16mg/dL. De förbehandlade grupperna visade signifikant reducerad BUN (låg: 22 :6±3:67mg/dL; hög: 21:6± 3:17mg/dL) och serumkreatinin (låg: 0:25 ± {{19} }:04mg/dL; höga: 0:23 ± 0:04mg/dL) koncentrationer jämfört med de i den obehandlade gruppen (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. Effekter av Beluga-linsförbehandling på tubulär epitelcellskada och apoptos.

Tubulär skada, särskilt atrofi av epitelceller, observerades ofta i den yttre njurmärgen, och nukleär förlust av exfolierade celler, luminala skräp på njurtubuli, kollapsat luminalt utrymme och interstitiell neutrofil infiltrat i njuren identifierades ibland i njuren. obehandlad grupp (Figur 2(a)). Däremot visade njurarna från de förbehandlade grupperna nästan normal cellmorfologi, och tubulär skada observerades mer sällan i högdosgruppen än i lågdosgruppen. När skadan uttrycktes i procent per ytenhet reducerades skadepoängen i de förbehandlade grupperna (lågt: 2:0±0:93; högt: 1:5± {{ 11}}:53) jämfört med den i den obehandlade gruppen (2:87 ± 1:25) (Figur 2(b)). När man undersökte KIM-1- och NGAL-sekretion (Figur 2(c)), visade ELISA-resultaten att KIM-1-innehållet minskade i de förbehandlade grupperna (lågt: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg; hög: 1 827:83 ± 278:26 pg/mg) jämfört med den i den obehandlade gruppen (1 977:83 ± 184:49 pg/mg). NGAL-uttryck reducerades signifikant i högdosgruppen (489:34 ± 19:95 pg/mg) jämfört med de i lågdosen (527:36 ± 15: 19 pg/ml) och obehandlade (537:05 ± 15: 70pg/mg) grupper (s<>

Huruvida tubulär epitelcellsskada orsakade apoptos analyserades sedan. Cellulär apoptos utvärderades genom att detektera fragmenterat kromosomalt DNA med hjälp av TUNEL-analysen (Figur 2(d)). TUNEL-positiva celler observerades sällan i de förbehandlade grupperna (låg: 5:00 ± 1:22; hög: 2:25 ± 1:09). Däremot visade den obehandlade gruppen ett relativt ökat antal TUNEL-positiva celler i den yttre medulla-regionen (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

tubulär epitelcellapoptos inducerad av I/R.

3.3. Effekter av Beluga-linsförbehandling på endotelcellskada.

Effekterna av förbehandling av beluga-linser på endotelceller verifierades av IHC med användning av en CD31-antikropp (Figur 3(a)). I den normala gruppen identifierades CD31-positiva blodkärl, men CD31-positiva celler identifierades inte i den obehandlade gruppen, vilket tyder på I/R-inducerad vaskulär störning. Förbehandlingsgruppen med hög dos visade CD31-positiva celler i de peritubulära kapillärerna, vilket indikerar en kärlskyddande effekt av förbehandling av högdos belugalinser. Endotelceller undersöktes genom att detektera ICAM- 1, en adhesionsmolekyl, och positiva celler identifierades oftare i den tubulära regionen i den obehandlade gruppen (46:4±41:7 celler/objektglas) jämfört med de förbehandlade grupperna ( låg: 5:77 ± 1:01 celler/objektglas; hög: 3:72 ± 1:05 celler/- objektglas) (Figur 3(b)). Dessa resultat indikerade att förbehandling av belugalinser bevarade kapillärer och hämmade adhesionsmolekylaktivering på endotelcellytan.

3.4. Effekter av Beluga-linsförbehandling på oxidativ stress.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), för SOD (låg: 360:21 ± 56:42U/mL; hög: 362:7{{ 36}} ± 70 :32 U/ml och obehandlad: 333:52 ± 41:58 U/ml), CAT (låg: 3:64 ± 1:09 nmol/g; hög: 3:21 ± 0:76 nmol/g; och obehandlad: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (låg: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; hög: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; och obehandlad: 3:59 ± 0 :53 nmol/mg) och GPx (låg: 198:89 ± 48:43 U/ug; hög: 219:61 ± 138:08 U/ug; och obehandlad: 165:14 ± 34:73 U/ug). Även om dessa skillnader inte var statistiskt signifikanta, antydde dessa resultat att förbehandling av belugalinser förhindrade I/R-inducerad oxidativ stress från njurarna genom att förbättra antioxidantstyrkan i njurarna.

3.5. Effekter av förbehandling av Beluga-linser på immuncellsinfiltration, cytokiner och inflammation. Makrofager (F4/80 plus) och T-cell (CD4 plus) infiltration och proinflammatorisk cytokin (IL-1, IL-6 och TNF-) frisättning analyserades för att utvärdera apoptosinducerad inflammation. Färre F4/80 plus och CD4 plus infiltrerande immunceller observerades i de förbehandlade grupperna än i den obehandlade gruppen, vilket bedömdes med IHC-analys (Figur 5(a)). Realtids-PCR-analysen visade att de renala mRNA-nivåerna av proinflammatoriska cytokiner (IL-1, TNF- och IL 6) minskade i den förbehandlade gruppen jämfört med de i den obehandlade gruppen (Figur 5(b) )). Emellertid ökade mRNA-nivåerna av antiinflammatoriska cytokiner (TGF- och IL-22) i de förbehandlade grupperna jämfört med den obehandlade gruppen, förutom IL-10 (Figur 5(c)). Dessa resultat indikerade att I/R-inducerad inflammatorisk skada i njurarna kan förebyggas genom förbehandling av belugalinser på grund av antiinflammatoriska effekter, även om IL-10 inte påverkades.

antocyanintillskott

4. Diskussion

Njurskada inducerad av I/R karakteriseras traditionellt av snabbt minskande njurfunktion [20]. Njurfunktionen kan uppskattas med hjälp av BUN- och serumkreatininvärden, som är kvävehaltiga metaboliska slutprodukter som indikerar glomerulär filterfunktion [21]. Den obehandlade gruppen visade signifikant ökade BUN-värden (89:92 ± 7:29mg/dL) och kreatinin (0:48 ± {{20}}:16mg/dL), vilket tyder på funktionell njursvikt inducerad av I/R. De förbehandlade belugalinsgrupperna visade dock signifikant reducerad BUN (låg: 22:6±3:67mg/dL; hög: 21:6±3:17mg/dL) och serumkreatinin (låg: 0: 25 ± 0:04mg/dL; höga: 0:23 ± 0:04mg/dL) värden (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

Den minskade njurfunktionen indikerar glomerulära filtreringsproblem orsakade av bakläckaget av glomerulära filtratet över det tubulära epitelet, vilket representerar den region som är allvarligast skadad av I/R [23]. I/R resulterade i exfolierad cellkärnförlust, luminala skräp på njurtubuli och kollapsade luminala utrymmen i tubulära epitelceller. De förbehandlade grupperna visade minskad histopatologisk tubulär skada på ett dosberoende sätt. Den observerade histopatologiska tubuliskadan bekräftades genom att utvärdera molekylära markörer, KIM-1 och NGAL [24]. KIM-1 är en fosfatidylserinreceptor som fungerar som en apoptotisk celligenkänningsmolekyl, som överför en skadad cell till lysosomen för apoptotisk/nekrotisk cellfagocytos, apoptotisk skräprensning och proinflammatorisk responsbegränsning [25]. NGAL är ett litet sideroforprotein som binder till gelatinaser som härrör från mänskliga neutrofiler. NGAL uttrycks sällan i normala njurar, men akuta, ischemiska eller toxiska njurskador resulterar i NGAL-utsöndring av epitelcellerna i de proximala/distala tubuli, vilket ökar NGAL-koncentrationerna i urin och blod; sålunda kan NGAL användas som en ny tidig biomarkör för I/R-inducerad akut njursvikt[26]. De förbehandlade grupperna visade minskad KIM-1- och NGAL-sekretion, och högdosgruppen för förbehandling visade en signifikant minskning av NGAL-sekretionen jämfört med den obehandlade gruppen. De observerade minskningarna av tubulär skada och KIM-1- och NGAL-proteinsekretion indikerade att förbehandling av belugalinser utövade skyddande effekter mot tubulär epitelcellskada inducerad av I/R.

När I/R-skadan är allvarlig rensas skadade celler genom den apoptotiska vägen, vilket är en patofysiologisk celldödsmekanism [27]. Apoptosspecifik DNA-skada kan detekteras genom TUNEL-analysen.

TUNEL-positiva celler observerades ofta i den obehandlade gruppen, medan de förbehandlade belugalinsgrupperna visade signifikant reducerade TUNEL-positiva cellantal, på ett dosberoende sätt. Detta histologiska bevis på apoptos bekräftades genom att undersöka Fas- och kaspas 3-uttryck. Fas är en ligand som binder till celldödsreceptorn och observeras initialt under programmerad celldöd [28]. Caspase 3 är ett intracellulärt exekveringsenzym av den apoptotiska celldödsvägen, vilket resulterar i apoptotisk kroppsbildning [29]. Fas- och kaspas 3-proteinsynteser minskade signifikant i den förbehandlade gruppen jämfört med de i den obehandlade gruppen, vilket bekräftar att förbehandling av belugalinser kan hämma apoptotisk signaltransduktion efter I/R-skada.

I/R-skada inducerar också förlust av renala mikrokärl [30], vilket resulterar i patohistologiska förändringar i endotelceller [20]. Njurskador på mikrokärl upptäcktes med hjälp av en antikropp mot CD31, en endotelcellsmarkör [30]. CD31-uttryck detekterades inte i den obehandlade gruppen, vilket indikerar förlust av njurmikrokärl. Den förbehandlade högdosgruppen visade emellertid positivt CD31-uttryck, med en liknande vaskulär densitet som observerades i den normala gruppen, vilket indikerade att förbehandling av beluga-linser, vid höga doser, utövade en skyddande effekt på bevarandet av endotelceller. Skadade endotelceller uttrycker endotel-leukocytadhesionsmolekyler, såsom ICAM-1 [31]. Ökade adhesionsmolekyler kan leda till leukocytaktivering, kapillärobstruktion, cytokinproduktion och pro-inflammatoriska svar [32]. Den obehandlade gruppen visade positivt ICAM-1-uttryck, vilket indikerar förbättrat uttryck av adhesionsmolekyler inducerat av skada på endotelceller. Den förbehandlade högdosgruppen visade dock negativt ICAM-1-uttryck, vilket indikerar de skyddande effekterna av förbehandling av belugalinser för underhåll av endotelceller, både funktionellt och fysiologiskt. De bibehållna kärlstrukturerna kan ge ett konsekvent blodflöde, leverera syre och näringsämnen till vävnader och celler som skadats av I/R, vilket hjälper till med funktionell och histologisk återhämtning av njuren.

Reperfusion återställer syretillförseln till skadade celler, vilket kan utlösa uttrycket av oxidativ stress-relaterade enzymer, som omvandlar syre till ROS [33]. ROS är instabila och mycket reaktiva produkter som genererar fria radikaler, som orsakar DNA-skador, apoptos och nekros, genom förändringar i cellulära proteiner, lipider och nukleinsyror. Fria radikaler skadar omättade fettsyror i cellmembranet, vilket resulterar i lipidperoxidation [34]. Lipidperoxid bryts sedan ned till MDA, vilket minskar antioxidantenzymaktiviteter, såsom SOD, GPx, GSH och CAT [35]. SOD katalyserar omvandlingen av superoxid till syre och väteperoxid, som ytterligare bryts ned av CAT. GPx är ett viktigt antioxidantenzym som eliminerar peroxid med hjälp av GSH. GSH kan avgifta olika oxidativa produkter, i kombination med GPx. MDA- och antioxidantenzymnivåer visade ett omvänt samband i ELISA-analysen. I de förbehandlade grupperna var MDA-uttrycket relativt lågt, men antioxidantenzymerna uttrycktes högt jämfört med deras respektive nivåer i den obehandlade gruppen.

Dessa resultat indikerade att förbehandling av belugalinser kan minska I/R-inducerad njurskada genom att blockera den oxidativa stressvägen, genom hämning av membranlipidperoxidation och aktivering av antioxidantenzymer.

Reperfusion utlöser även aktivering av vaskulär endotelcell, vilket resulterar i ICAM-1-uttryck på cellytan. Det uttryckta ICAM-1 ansluter till neutrofiler genom lymfocytfunktionsassocierat antigen-1 (LFA-1), vilket resulterar i bindning av neutrofiler till endotelceller, neutrofilinfiltration och utsöndring av inflammatoriska cytokiner av neutrofiler [36]. Efter att neutrofiler uppträder i en skadad region inträffar infiltration av F4/80 plus makrofager. Makrofager särskiljer sig i proinflammatoriska M1- och anti-inflammatoriska M2-fenotyper, beroende på tid och omgivning. M1-makrofager utsöndrar proinflammatoriska cytokiner (IL-1, TNF- och IL- 6) som är associerade med I/R-inducerad njurskada, medan M2-makrofager utsöndrar antiinflammatoriska cytokiner (TGF-, IL{ {19}} och IL-22) [37, 38]. Makrofager stimulerar också CD4 plus T-cellsaktivering. Aktiverade T-celler syntetiserar interferon- (IFN-), som förstärker immunsvaret genom M1 makrofagaktivering [39]. I denna studie visade de förbehandlade belugalinsgrupperna hämmande effekter mot F4/80 plus makrofager och CD4 plus T-cellsinfiltering i njurbarken, vilket resulterade i minskat uttryck av IL-1, IL-6, och TNF-mRNA och det förstärkta uttrycket av TGF-, IL-10 och IL-22 mRNA. Dessa resultat indikerade att förbehandling av beluga-linser kan minska det inflammatoriska svaret genom att hämma immuncellsinfiltration och minska inflammatoriskt cytokinuttryck.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis visade förbehandlingsgrupperna för belugalinser minskad proximal tubuliskada, minskad skaderelaterad molekylsekretion, minskad TUNEL-positiva celler, minskad apoptosrelaterad molekylsekretion, positivt mikrokärluttryck, negativt uttryck av adhesionsmarkörer, en antioxidanteffekt och inhiberad inflammatorisk effekt. svar. Därför utövade förbehandling av belugalinser skyddande effekter mot I/R-inducerad njurskada, via antiapoptotiska, antiinflammatoriska och antioxidativa aktiviteter. Baserat på resultaten från denna studie kan njurfunktionen bevaras genom att använda beluga-linsbehandlingar i kliniska situationer förknippade med I/R-skador, såsom partiell nefrektomi.

flavonoidtillskott i njurarna

Datatillgänglighet

Uppgifter finns tillgängliga på begäran.

Avslöjande

Manuskriptsammandraget rapporterades vid det 72:a årsmötet för Korean Urological Association.

Intressekonflikt

Det finns inga intressekonflikter.

Författarbidrag

Syng-ook Lee och So Young Chun bidrog lika mycket till detta arbete.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av ett anslag från Biomedical Research Institute från Kyungpook National University Hospital (2019).

1Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Republiken Korea

2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Republiken Korea

3Department of Laboratory Animal Research Support Team, Yeungnam University Hospital, Daegu 42415, Republiken Korea

4Department of Internal Medicine, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Republiken Korea

5 Department of Urology, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republiken Korea

6 Institutionen för patologi, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republiken Korea

7 Department of Urology, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Republiken Korea

Referenser

[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim, et al., "En ny dorsal slits närmade sig icke-ischemisk partiell nefrektomimetod för en njurvävnadsregenerering i en musmodell," Tissue engineering and regenerative medicine, vol. 15, nr. 4, s. 453–466,2018.

[2] M. Agrawal och R. Swartz, "Akut njursvikt," American Family Physician, vol. 61, nr. 7, s. 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "Ischemic nephropathy," Current Opinion in Nephrology and Hypertension, vol. 10, nr. 2, s. 167–173,2001.

[4] K. Singbartl och K. Ley, "Skydd från ischemi-reperfusion-inducerad allvarlig akut njursvikt genom att blockera E-selektin," Critical Care Medicine, vol. 28, nr. 7, s. 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette och NL Tilney, "The cytokine-adhesion molecule kaskaden i ischemi/reperfusionsskada av råttnjuren. Inhibering av en löslig P-selektinligand," The Journal of klinisk undersökning, vol. 99, nr. 11, s. 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li och F. Zhang, "Samband mellan endotelin-1/endotelinreceptor A och inflammation i musnjurar efter akut ischemi/reperfusion," Molecular Medicine Reports, vol. . 11, nr. 5, s. 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen et al., "Effekt av peroxid II på apoptos inducerad av njurischemi/reperfusionsskada hos råttor," Experimental and Therapeutic Medicine, vol. 9, nr. 3, s. 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han, et al., "Ischemi/reperfusion-inducerad chop expression främjar apoptos och försämrar njurfunktionsåtervinning: rollen av acidos och Gpr4," PLoS One, vol. 9, nr. 10, artikel e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson och LA MacMillan-Crow, "Mitokondriella mål för oxidativ stress under njurischemi/reperfusion," Archives of biochemistry and biophysics, vol. 412, nr. 1, s. 27–33, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk, et al., "Inflammation och kaspasaktivering vid långvarig njurischemi/reperfusionsskada och immunsuppression hos råttor," Kidney International, vol. 68, nr. 5, s. 2050–2067, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien och MK Lai, "Ischemisk konditionering genom korta perioder av reperfusion dämpar njurischemi/reperfusionsinducerad apoptos och autofagi hos råttan," Journal of biomedical science, vol. 16, nr. 1, 2009.

[12] EM El Morsy, MA Ahmed och AA Ahmed, "Attenuering av njurischemi/reperfusionsskada genom förkonditionering av açai-extrakt i en råttmodell," Life sciences, vol. 123, s. 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal, et al., "Hyperbar syreterapi lindrar oxidativ stress och vävnadsskada vid njurischemi/reperfusionsskada hos råttor," Renal Failure, vol. 34, nr. 10, s. 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu, et al., "Ozonoxidativ förkonditionering hämmar inflammation och apoptos i en råttmodell av njurischemi/reperfusionsskada," European Journal of pharmacology, vol. 581, nr. 3, s. 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan och SK Chang, "Jämförande analyser av fenolsammansättning, antioxidantkapacitet och färg på baljväxter under kallsäsong och andra utvalda matbaljväxter," Journal of Food Science, vol. 72, nr. 2, s. S167–S177, 2007.

[16] SO Lee och SH Lee, "Polyfenolinnehåll och antioxidantaktiviteter av linsextrakt från olika sorter," Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, vol. 45, nr. 7, s. 973–979, 2016.

[17] SO Lee och SH Lee, "Nrf2-förmedlad antiinflammatorisk effekt av metanolextrakt från beluga linser i LPS-behandlade RAW264.7-celler," i 2018 KFN International Symposium and Annual Meeting, s. {{ 7}}, Busan, Korea, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay, et al., "Njurischemi-reperfusionsskada: en musmodell för skada och regenerering," JoVE (Journal of Visualized Experiments), nr. 88, sid. 8, 2014.

[19] Q. Wei och Z. Dong, "Musmodell av ischemisk akut njurskada: tekniska anteckningar och knep," American Journal of Physiology-Renal Physiology, vol. 303, nr. 11, s. F1487– F1494, 2012.

[20] JV Bonventre och L. Yang, "Cellulär patofysiologi av ischemisk akut njurskada," The Journal of Clinical Investigation, vol. 121, nr. 11, s. 4210–4221, 2011.