Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Kontakt: joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakt

LC Technology är en erkänd metod som används över hela världen för att utvärdera kvaliteten på traditionell kinesisk medicin (TCM). Kvaliteten på TCM har en direkt inverkan på dess effektivitet. Därför, för att grundligt avslöja hur TCM utövar sin effektivitet, är det först och främst nödvändigt att förstå den materiella grunden för dess effektivitet och sedan kontrollera kvaliteten på aktiva föreningar. Tillämpningen av metoden för spektrum-effektsamband är avgörande för att bestämma den farmakologiska materialbasen. Målet med denna artikel var att undersöka de underliggande korrelationerna mellan de kemiska profilerna och östrogenaktiviteten hosCistancheför att avslöja de aktiva föreningarna. De kemiska profilerna förCistancheregistrerades med användning av HPLC/Q-TOF-MS/MS, och östrogen aktivitet bestämdes genom livmodertillväxttestet och MTT-analysen. Genom att sedan kombinera resultaten av bivariat analys, huvudkomponentanalys och grå korrelationsanalysmetod identifierades femton aktiva föreningar. De är 8-epilogansyra, salidrosid, syringalid A 3'- -l-rhamnopyranosid, cistanosid A,echinakosidcistanosid F, cistanosid B, cistanosid C, osmanthusid B, acteosid, isoacteosid, tubulosid B, 2'-acetylacteosid och två okända föreningar. Denna studie lägger en grund för in vivo studier avCistanche, och för utvecklingen av dess kliniska tillämpning.

Cistanche kan öka östrogenet, klicka här för att lära dig mer

Nyckelord:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; östrogen aktivitet; huvudkomponentanalys (PCA); Uterus tillväxt test.

Förkortningar

TCM: Traditionell kinesisk medicin

HPLC/Q-TOF-MS: Högpresterande vätskekromatografi/kvadrupol-time-of-flight-masspektrometri

BA: bivariat analys

PCA: huvudkomponentanalys

GCAM: grå korrelationsanalysmetod

MTT :Trypsin, 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid

DMSO: dimetylsulfoxid

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Introduktion

På senare tid har TCM blivit mer och mer populärt i asiatiska och västerländska länder på grund av dess stabila terapeutiska effekter och låga toxicitet i kliniken. Som ett resultat är det nödvändigt att utveckla nya typer av TCM och att förstå de effektiva kompositionerna som används under deras kliniska tillämpning [1-6].

För det första studeras förhållandet mellan spektrum och effekt för att urskilja korrelationen mellan kromatografiskt fingeravtryck och farmakodynamisk effektivitet. Använd sedan relationen för att leta efter effektiva komponenter i TCM och för att formulera kontrollstandarder för att återspegla deras interna kvalitet. Spektrum-effektsambandet har tillämpats inom många områden av TCM-forskning, såsom den materiella basen för enkel och sammansatt TCM, komponentkompatibilitet, bearbetningsmekanism, farmakologisk effektprognos och teknologioptimering [7-12]. Spektrum-effektrelationen används för att lägga fram nya idéer och metoder för att utforska aktiva substanser, optimera formler, förbättra beredningsprocesser, spåra och separera målingredienser och för utveckling av nya TCM-läkemedel [13-17].

Cistanchehar använts i stor utsträckning för behandling av sexuell dysfunktion, förstoppning, prostatit och njurbrist. Den har ett brett spektrum av bioaktiviteter inklusive östrogen effekt, anti-aging, antioxidation och immunverkan [18-19]. Generellt sett betraktades fenyletanoidglykosider (som cistanosid A, tubulosid A), lignaner och iridoidglykosider som farmakologiska beståndsdelar och kemiska markörer för kvalitetskontroll av Cistanche och dess produkter [20-21]. De kemiska spektra avCistanchefrån olika områden registrerades med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) [22-23]. I denna studie väljer vi livmodertillväxttest och MCF7-cellproliferationsanalysen för att bedöma deras östrogena aktiviteter. Principal komponentanalys, bivariat analys och grå korrelationsanalysmetoder användes för att korrelera östrogen aktivitet med de individuella komponenterna. Denna studie syftade till att identifiera bioaktiva föreningar av Cistanche som är ansvariga för in vivo östrogena effekter. Studien lägger en grund för fördjupade studier avCistanche.

Alla experimentella procedurer granskades och godkändes av den djuretiska kommittén vid Harbin University of Commerce.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) köptes från läkemedelsmarknaden och identifierades av prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Dietylstilbestrol köptes från HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 och RPMI1640 utan fenolrött köptes från HyClone Company (USA). MTT och DMSO köptes alla från Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, USA). Den mänskliga bröstcancercellinjen MCF7 tillhandahölls av Research Center of the Life Sciences and Environmental Sciences (Harbin University of Commerce). Standarderna som användes var följande: akteosid (111530- 200505), echinakosid (111670-200503) och salidrosid (110736-200628) erhölls från National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Peking) , Kina). Acetonitril, metanol och myrsyra var av MS-kvalitet, medan vatten var ultrarent. Andra reagens var av analytisk kvalitet och var kommersiellt tillgängliga.

EchinacosideiCistanchetubulosa har många effekter

2 Experimentell procedur

2.1 Material

Agilent 1290 HPLC-system, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF)-system och Chemical HPLC-3D-arbetsstationer användes för analytiska kemiexperiment och databearbetning. Milli-Q ultrarent vatten användes för beredning av prover och standarder. Ytterligare instrument inkluderade den elektroniska Analytical Balance AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) och 64R High-Speed ​​Centrifuge (Beckman Coulter Allegra).

Omogna Kunming-honmöss (cirka 21 dagar efter födseln, avvanda) som vägde (12 ± 2) g köptes från Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Kina). Mössen hölls i ett temperaturreglerat rum (22 ± 2 grader) med obegränsad tillgång till mat och vatten. Djurförsök initierades efter fem dagars acklimatisering. Mössen fastade över natten med fri tillgång till vatten innan testlösningarna administrerades. Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av försöksdjur från National Institutes of Health.

2.2 Beredning av provlösningen

Cistanche-prover samlades in från tio olika livsmiljöer, nämligen Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan och Hubei-provinsen.

Lösningen (1,0 g/ml) av Cistanche-provet bereddes i destillerat vatten för oral administrering. Koncentrationen av dietylstilboestrol var 20ug/ml och användes som positiv kontrolllösning. Lösningen (1,0 g/ml) av Cistanche-provet framställdes i 50 procent acetonitril. Akteosid, echinakosid och salidrosid (2,0 mg vardera) löstes i 10 ml 50-procentig acetonitrillösning. Både provet och standardlösningarna filtrerades med ett 0,45-μm filter före analys.

2.3 LC-MS-förhållanden

En Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA) användes för att analysera proverna. Den mobila fasen bestod av acetonitril (A) och 0,2 procent (v/v) myrsyravattenlösning (B) och pumpades med en flödeshastighet av 0,5 ml/min. Injektionsvolymen för varje prov var 10 μL. Gradientelueringsprogrammet var som följer: Mobil fas A initierades vid 5 procent och ökade linjärt till 23 procent vid 35 minuter. Lösning A ökades därefter till 25 procent (35 till 65 min). Den mobila fasen A minskades sedan till 5 procent under de sista 5 minuterna av körningen (65 till 70 minuter). Kolonntemperaturen hölls vid 30 grader. Kromatogrammen övervakades vid 254 nm. Finfördelningsgastrycket var 30 psi, och kapillärspänningen var 3,5 kV. Flödeshastigheten för den torra gasen sattes till 8 l/min med en temperatur på 30 grader. Masspektra registrerades inom skanningsområdet 100- 3,000 Da och var i negativ jonskanningsläge.

2.4 Fingeravtrycksutvärdering

LC-fingeravtryck av proverna som samlats in från 10 olika batcher upprättades och matchades automatiskt med hjälp av Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (version 2012; China Pharmacopoeia Committee, Beijing, Kina). Vidare genererades referenskromatogramkartan med hjälp av medianmetoden. Dessutom användes klusteranalys för att utvärdera kvaliteten på proverna från tio olika livsmiljöer.

2.5 Huvudkomponentanalys (PCA)

PCA är en multivariat statistisk metod. Den kan behålla tillräcklig information från datainsamlingen. I den föreliggande studien screenades karakteristiska toppar från LC-kromatogram ytterligare med PCA och syftade till att identifiera aktiva föreningar baserat på förhållandet mellan spektrum och effekt.

2.6 Uterus tillväxttest

Mössen delades in i 12 grupper (10 per grupp). Provlösningarna som framställdes från Cistanche samlades in från tio olika livsmiljöer och administrerades två gånger dagligen (morgon och kväll) genom sondmatning i en dos av 30 g/kg kroppsvikt under fyra dagar. De blanka och positiva kontrollgrupperna omfattade lika volymer destillerat vatten och dietylstilboestrollösning och administrerades två gånger dagligen under fyra dagar. På den femte dagen togs de läkemedelsinnehållande blodproverna från de sövda mössen. Proverna centrifugerades (5,000 rpm, 10 min), och supernatanterna (läkemedelsinnehållande serumprover) separerades. De läkemedelsinnehållande serumproverna inaktiverades genom uppvärmning till 56 grader i ett vattenbad i 30 minuter och filtrerades genom ett 0,22-μm filter före MTT-analysen. Samtidigt skars ut livmodern på mössen omedelbart ut och vägdes för att beräkna livmoderviktsindex. Djurförsöket initierades efter fem dagars acklimatisering. Mössen har fastat över natten med fri tillgång till vatten före administreringen av testlösningarna. Den föreliggande studien utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Alla experimentella procedurer granskades och godkändes av den djuretiska kommittén vid Harbin University of Commerce. Alla potentiellt stressande procedurer utfördes under natriumpentobarbitalbedövning.

2,7 MTT-analys

MCF7-celler samodlades med RPMI 1640 utan fenolrött (innehållande 5 procent CDT-FBS) under fyra dagar. Cellerna såddes i 96-brunnsplattor med en densitet av 2,000 celler/brunn. En adherent odling uppnåddes och efter 72 timmars odling samodlades cellerna i RPMI 1640-medium innehållande serumprover från Cistanche-behandlade möss. Experimenten utfördes i sex replikat. Därefter tillsattes 20 μL MTT-lösning (5 mg/ml i PBS) till varje brunn och cellerna inkuberades i 4 timmar. Efter avlägsnande av medium tillsattes 150 µL DMSO för att producera formazanprodukten, och plattorna skakades i mörker för att fullständigt lösas upp. Absorbansen mättes vid 570 nm med användning av en mikroplattläsare. Proliferationshastigheten beräknades som det genomsnittliga absorbansvärdet för den läkemedelsinnehållande serumgruppen dividerat med det genomsnittliga absorbansvärdet för den blanka kontrollgruppen (celler samodlade i RPMI 1640 utan serum).

2.8 Statistisk analys

T-testet med parvis prov (tvåsidigt) användes för att identifiera statistiskt signifikanta skillnader mellan värden i blankkontrollgruppen och experimentgruppen. Skillnaderna ansågs signifikanta vid en konfidensnivå på 95 procent (p <>

PCA användes för att utvärdera karakteristiska toppareor i kromatogrammen för proverna från tio olika livsmiljöer. Bivariat analys och Gray korrelationsanalys användes för att bedöma korrelationen mellan toppområden och deras östrogena aktivitet. Korrelationen beräknades av SPSS-statistik för programvaran (SPSS för Windows 21.0, SPSS Inc., USA). Skillnaderna ansågs signifikanta vid en 95-procentig konfidensnivå (tvåsidigt).

Etiskt godkännande: Den genomförda forskningen är inte relaterad till vare sig människor eller djur.

cistanche akteosid har många funktioner

3. Resultat och diskussion

3.1 Klusteranalys och likhetsbedömning

Den relativa standardavvikelsen för retentionstiden och topparean för karakteristiska toppar var {{0}}.58 och 0.34 procent för precision, 0.52 och {{8} },31 procent för reproducerbarhet och {{10}},19 respektive 0,13 procent för stabilitet. Dessa resultat indikerade att vår LC-metod för fingeravtrycksetablering var rimlig och tillförlitlig. Likheterna mellan kromatogrammen för tio prover var större än 0,9. De gemensamma topparna för alla prover kunde inte helt representera karaktäristiska beståndsdelar av Cistanche, eftersom toppen kunde ha gått förlorad. Därför justerades provets matchningsnummer från 26 till 20 för att erhålla en mer exakt kromatogramkarta. Totalt erhölls 26 toppar, och summan av deras ytor var större än 0,8 jämfört med den totala topparean i provet. Därför drog vi slutsatsen att dessa kromatografiska toppar effektivt kunde återspegla de viktigaste kemiska beståndsdelarna i Cistanche. Resultaten av klusteranalys visas i figur 1. Totalt tio olika livsmiljöer delades in i tre kategorier enligt följande: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang och 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia och 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Trenden med klusteranalys visade att de medicinska örternas livsmiljöer är likartade när de är under tröskeln. Men med höjningen av tröskeln är klimatet och tillväxtförhållandena för livsmiljöer nära. Den visar att klusteranalysen inte bara kan särskilja de olika livsmiljöerna väl utan också återspegla samhörigheten mellan dem.

3.2 Identifiering av kemiska beståndsdelar

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Ju högre det absoluta värdet av Eigen-belastningen är, desto högre påverkan har föreningarna på de östrogena indexen.

Kromatogrammen för Cistanche och standardproverna jämfördes för att identifiera individuella komponenter under samma LC-MS-förhållanden. Som visas i tabell 1 identifierades totalt 26 beståndsdelar baserat på retentionstiden och MS-data [24-26]. Aktiva ingredienser administreras oralt i form av blandningar snarare än monomerer eftersom traditionell kinesisk medicin är i form av en blandning för att spela en terapeutisk roll. En enda förening efter att ha separerats individuellt visade sig inte spela någon roll. Vårt mål är att avslöja föreningar som har östrogen aktivitet i de kända komponenterna i Cistanche [23-30], och som därför inte valde NMR och andra tekniska metoder för att validera sin identitet. Topp 1 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 373 (C16H22O10), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av geniposidinsyra. Detta stöddes av förlusten av en glukosdel som gav en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 211. Topp 2 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 461 (C20H30O12), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av koffeoylakteosid, och stöddes av förlusten av en rhamnosyldel, vilket bildade en fragmentering med ett m/z-förhållande på 315. Topp 4 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 375 (C16H24O10), vilket var identiskt med elementär sammansättning av 8-epilogansyra. Förlusten av en glukosdel, bildade en fragmentering med ett m/z-förhållande på 213, stödde ytterligare slutsatsen. Topp 6 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 607 (C29H36O14), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av syringalid A3'- - l-rhamnopyranosid.

Förlusten av en caff-del, bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 445, stödde ytterligare slutsatsen. Topp 8 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 799 (C36H48O20), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av cistanosid A. Förlusten av en caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 637, stödde slutsatsen ytterligare. Topp 11 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 487 (C21H28O13 ), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av cistanosid F. Detta stöddes av förlusten av en rhamnosyldel som gav en fragmentjon med en m/z förhållandet 341, och förlusten av en annan caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 179, vilket ytterligare stödde slutsatsen. Topp 12 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 813 (C37H50O20), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av cistanosid B. Förlusten av en glukosdel bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 651, stödde slutsatsen ytterligare. Topp 13 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 827 (C37H48O21), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av tubulosid A. Förlusten av en rhamnosyldel bildade en fragmentering med ett m/z-förhållande på 681, ytterligare stödde slutsatsen. Topp 14 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 637 (C30H38O15), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av cistanosid C. Förlusten av en ramnosyldel bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 491, stödde slutsatsen ytterligare.

Topp 15 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 591 (C29H36O13), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av osmanthusid B. Förlusten av en rhamnosyldel, bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 445, stödde slutsatsen ytterligare. Topp 16 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 623 (C29H36O15), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av akteosid. Förlusten av en caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 461,stödde slutsatsen ytterligare. Topp 18 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 623 (C29H36O15), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av isoakteosid. Förlusten av en caff-del, förpik15 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 591 (C29H36O13), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av osmanthusid B. Förlusten av en rhamnosyldel bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 445, ytterligare stödde slutsatsen. Topp 16 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 623 (C29H36O15), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av akteosid. Förlusten av en caff-del, bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 461, stödde ytterligare slutsatsen. Topp 17 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 623 (C29H36O15), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av cis-akteosid. Förlusten av en caff-del bildade ett fragment ioda-fragmentjon med ett m/z-förhållande på 461, stödde ytterligare slutsatsen. Topp 21 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 653 (C30H38O16), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av campneosid Ⅰ.

Förlusten av en caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 491, och förlusten av en annan rhamnosyl-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 345, vilket ytterligare stöder slutsatsen. Topp 22 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 665 (C31H38O16), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av tubulosid B. Förlusten av en CH3 CO-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 623, och förlusten av en annan caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 461, vilket ytterligare stöder slutsatsen. Topp 23 indikerade en dominerande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 639 (C29H36O16), vilket var identiskt med den elementära sammansättningen av campneosid. Förlusten av en rhamnosyldel, bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 493, stödde ytterligare slutsatsen. Topp 24 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 665 (C31H38O16), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av 2'-acetylakteosid. Förlusten av en Ac-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 623, och förlusten av en annan caff-del bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 461, vilket ytterligare stöder slutsatsen. Topp 25 indikerade en övervägande deprotonerad jon med ett m/z-förhållande på 445 (C20H30O11), vilket var identiskt med grundämnessammansättningen av cistanosid G. Förlusten av en rhamnosyldel, bildade en fragmentjon med ett m/z-förhållande på 299, stödde slutsatsen ytterligare. Strukturerna för föreningarna listas i figur 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Dessa toppar var följande: 9, 12, 14 och 15. Följaktligen valdes echinakosid, cistanosid B, osmanthusid B och acteosid, motsvarande totalt 4 toppar som representativa variabler för östrogen aktivitet (Figur 3).

.

3.4 Bestämning av östrogen aktivitet

Förhållandet mellan våtvikt i livmodern och kroppsvikten för varje mus beräknades (Figur 4). Djuren som exponerats för Cistanche från nio livsmiljöer uppvisade betydande östrogena aktiviteter genom att öka sin livmodervikt jämfört med möss i den tomma kontrollgruppen. Figur 4 visar vidare proliferationshastigheten för MCF7-celler behandlade med serum från Cistanche-behandlade möss. Cellerna som behandlats med sera från möss som administrerades Cistanche från tio livsmiljöer uppvisade signifikant högre tillväxt jämfört med celler som saknade behandling.

3.5 Bivariat analys

I den aktuella studien observerade vi att livmodervikten hos omogna Kunming-möss ökade och spridningen av MCF7 humana bröstcancerceller främjades. Dessa fynd verifierade den östrogena aktiviteten hos Cistanche. Figur 5 indikerade livmoderindex och MCF7-cellproliferationshastigheter för dessa beståndsdelar. Pearsons korrelationskoefficient användes för att beräkna de relativa toppareorna, vilket motsvarade den östrogena aktiviteten hos proverna. Korrelationskoefficienterna högre än 0.3 ansågs signifikanta (p < 0.05),="" medan="" korrelationskoefficienter="" högre="" än="" 0.5="" ansågs="" vara="" mycket="" signifikanta="" (p="">< 0,01).="" baserat="" på="" resultaten="" visade="" sig="" cistanche="" ha="" östrogen="">

Totalt nio föreningar korrelerade signifikant med ökningen av livmodervikten (p < {0}}.05),="" medan="" tio="" föreningar="" signifikant="" korrelerade="" med="" mcf7="" cellulär="" proliferation="" (p="">< 0,05).="" föreningar="" som="" signifikant="" korrelerade="" med="" livmodervikt="" och="" cellproliferation="" var="" 8-epilogansyra,="" salidrosid,="" syringalid="" a3'-="" -="" l-rhamnopyranosid,="" cistanosid="" a,="" cistanosid="" b,="" cistanosid="" c,="" osmanthusid="" b,="" acteosid,="" isoacteosid,="" tubulosid="" b,="" 2'-acetylakteosid="" och="" två="" okända="" föreningar="" (figur="" 5).="" dessa="" tretton="" föreningar="" utövade="" östrogena="">

3.6 Grå korrelationsanalysmetod

Figur 6 visar den relativa korrelationen mellan de karakteristiska topparna för 26 föreningar med livmoderindexen, och Figur 7 visar den relativa korrelationen mellan de karakteristiska topparna för de 26 föreningarna med deras cellproliferationshastigheter. Totalt tre föreningar uppvisade den högsta korrelationen med livmoderindexen, nämligen 8-epilogansyra, cistanosid F och acteosid (figur 6, i fallande ordning); medan de sex föreningarna som uppvisade den högsta korrelationen med MCF7-cellproliferationen var echinakosid, cistanosid F, cistanosid B, osmanthusid B, isoacteosid och tubulosid B (Figur 7, i fallande ordning). De relativa korrelationerna mellan echinakosid, osmanthusid B, acteosid och isoacteosid var högre än 0.5.

3.7 Optimering av LC-MS-förhållanden

För att få en bättre kromatogramkarta jämfördes metanol och acetonitril. Slutligen var kombinationen av vattenhaltig myrsyra (0,2 procent, v/v) - acetonitril den bästa mobila fasen för separation. Inom intervallet 200-400nm fullvåglängdsskanning valdes 254nm som det optimala. Dessutom förbättrades även MS-parametrarna. Det negativa jonskanningsläget valdes eftersom det förbättrade svarsvärdena för de flesta ingredienserna i Cistanche.

4. Slutsats

LC-Q-TOF-MS-teknologi användes för att identifiera östrogena aktiva beståndsdelar i Cistanche. Den aktuella studien illustrerade att 8-epilogansyra, salidrosid, syringalideA3'- -l-rhamnopyranosid, cistanosid A, echinakosid, cistanosid F, cistanosid B, cistanosid C, osmanthusid B, acteosid, isoacteosid, tubulosid, 2'-acetylakteosid och två okända föreningar var de huvudsakliga aktiva beståndsdelarna i Cistanche. Dessa fynd kräver dock ytterligare studier för att utforska in vivo-effekterna och verkningsmekanismen för beståndsdelarna.

cistancheakteosid har många funktioner, som att stärka immunförsvaret

Erkännanden:

Det här projektet stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81073015), Nature Scientific Foundation i Heilongjiang-provinsen (ZD2017014) och utbildningsplanen för unga innovativa talang från College i Heilongjiang-provinsen (UNPYSCT-2017209) . Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.

Referenser

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fytokemi, farmakologi , kvalitetskontroll och framtida forskning av Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Integrerad och global pseudotargeted metabolomics-strategi tillämpad till screening för kvalitetskontrollmarkörer för Citrus TCM, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM " Strategi tillämpad på kvalitetsanalys av traditionell kinesisk medicininjektioner: Användning av KuDieZi-injektion som fallstudie, Molecules., 2017, 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Screening av bioaktiva kvalitetskontrollmarkörer för QiShenYiQi droppande piller baserat på förhållandet mellan ultrahög prestanda vätskekromatografi fingeravtryck och vaskulär skyddande aktivitet, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Tillämpning av multivariat statistisk analys och tänkande i kvalitetskontroll av kinesisk medicin, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS orienterade karaktäristiska komponenter data uppsättning och kemometrisk analys för holistisk kvalitetskontroll av komplexa TCM-preparat: Niuhuang Shangqing-piller som ett exempel, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa av UHPLC-QTOF/MS Based on the Spectrum-Toxicity Relationship, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Screening och identifiering av hepatotoxiska komponenter i Evodia rutaecarpa baserat på spektrum-effektförhållande och UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestic Mild Cognitive Impairment: What Are the Clinical Implikations?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Spectrum-effect relations as a systematisk approach to traditional Chinese medicin research: current status and future perspectives, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Spektrumeffektsamband mellan UPLC-fingeravtryck och bioaktiviteter av råa sekundära rötter av Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) och dess tre bearbetade produkter på mitokondriell tillväxt i kombination med kanonisk korrelationsanalys, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints och antibakteriella effekter av Lonicerae Japonicae Flos och Lonicerae Flos Base på UPLC och mikrokalorimetri, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Spektrumeffekten i tester för riskprediktion, screening och diagnos, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Spårning av nya hemostatiska föreningar från uppvärmningsprodukter av totala flavonoider i Flos Sophorae genom spektrum -effektförhållanden och kolonnkromatografi, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Undersökning av spektrum-effektsambanden av Da-Huang-Fu- Zi-Tang hos råttor med UHPLC-ESI-Q-TOF-MS-metoden, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Studie om spektrumeffektförhållande mellan rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus och deras formel, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotisk aktivitet av echinacoside i ovarieektomerade råttor, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Antihyperglykemiska och hypolipidemiska effekter av Cistanche tubulosa i typ 2 diabetiska DB/DB-möss, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acylerade fenyletanoidglykosider echinakosid och acteosid från Cistanche tubulosa, förbättrar glukostolerans hos möss, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fenyletanoidglykosider med antiinflammatoriska aktiviteter från stjälkar av Cistanche deserticola odlade i Tarimöknen, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Kvantitativ analys av Cistanches Herba med hjälp av högpresterande vätskekromatografi i kombination med dioduppsättningsdetektion och hög- upplösningsmasspektrometri kombinerad med kemometriska metoder, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Strukturell karakterisering och identifiering av fenyletanoidglykosider från Cistanches deserticola YC Ma av UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferative Activity of Phenylpropanoids Isolated from Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Samtidig bestämning av komponenter med bred polaritet och innehållsintervall i Cistanche tubulosa med användning av seriekopplad omvänd fas-hydrofil interaktionskromatografi-tandem masspektrometri, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Tillämpning av 1H NMR-baserad metabolomik för diskriminering av olika delar och utveckling av ett nytt bearbetningsarbetsflöde för Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Synd. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Studies on the constituents and bioactivity of fresh Cistanche tubulosa, Ph.D. avhandling, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Den metaboliska profilen för akteosid som produceras av tarmbakterier från människa eller råtta eller tarmens enzym in vitro använde UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Systematisk karakterisering av metaboliter av echinakosid och acteosid från Cistanche tubulosa i råttplasma, galla, urin och avföring baserat på UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Ett metaboliskt sätt att undersöka relaterade hinder som orsakar dålig biotillgänglighet vid oral tillförsel av isoakteosid hos råttor som använder ultrahögpresterande vätskekromatografi/ quadrupol time-of-flight tandem masspektrometri, Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.