joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IL-22-medierad njurmetabolisk omprogrammering via PFKFB3 för att behandla njurskada

Wei Chen, et al

Grafiskt abstrakt

IL-22 dämpasnjureskadavia metabolisk omprogrammering av njur-TEC, reglerar mitokondriell funktion och glykolys i skadade TEC, och lindrar ackumulering av mitokondriell ROS och dysfunktionella mitokondrier via induktion av AMPK/AKT- och PFBFK3-aktiviteter. FörbättrandenjureskadaofIL-22 via reglering av metabolism relevant signalering är certifierad i cisplatin-inducerade njurskador och diabetisk nefropati djurmodeller.

Abstrakt

Njurskador initierar de försämrade metabola tillstånden i tubuliceller som leder till utvecklingen av njursjukdom i slutstadiet (ESTD). Interleukin-22 (IL- 22) är ett effektivt terapeutiskt motgift motnjureskadagenom att främja njuråterhämtning, men lite är känt om de underliggande molekylära mekanismerna. Här ger vi först bevis på att IL-22 dämparnjureskadavia metabolisk omprogrammering av tubulära njurepitelceller (TEC). Specifikt tyder våra data på att IL-22 reglerar mitokondriell funktion och glykolys i skadade TEC. Ytterligare observationer indikerar att IL-22 lindrar ackumuleringen av mitokondriella reaktiva syrearter (ROS) och dysfunktionella mitokondrier via induktion av AMPK/AKT-signalering och PFBFK3-aktiviteter. Hos möss, förbättring avnjureskadaoch nekros och förbättring av njurfunktioner via reglering av dessa metabolismrelevanta signaler och mitokondriell kondition av rekombinant IL-22 är certifierade i cisplatininducerade njurskador och diabetisk nefropati (DN) djurmodeller. Sammantaget avslöjar våra resultat nya mekanistiska insikter om de skyddande effekterna av IL-22 på njurarna och belyser de terapeutiska möjligheterna för IL-22 och de inblandade metaboliska regulatorerna i olika njursjukdomar.

NYCKELORDinterleukin-22,njureskada, metabolisk omprogrammering, mitokondriell dysfunktion

Cistanchetubulosaförebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

1. INTRODUKTION

Akutnjureskada(AKI), ett vanligt folkhälsoproblem förknippat med hög mortalitet och sjuklighet, påverkar miljontals sjukhuspatienter över hela världen och uppvisar en snabbt ökande incidens.1–3 Den underliggande patofysiologin för AKI är inte helt klarlagd men involverar skador och apoptos av njurarna. tubulära epitelceller (TEC), särskilt i den proximala tubuli.4–7 Flera typer av litteratur stödjer att deras allvarliga och ihållande skada ofta orsakar ofullständig och felaktig vävnadsreparation, vilket leder till inflammatoriskt svar, tubulär degeneration, njurfibros och eventuell progression till njursjukdom i slutstadiet (ESTD).8–10 Tyvärr, förutom dialysbaserad stödjande vård, finns inga väletablerade terapier förnjureskadaär tillgängliga. Därför är proaktiv behandling välbehövlig för att minska det lidande det orsakar patienterna och de betydande ekonomiska bördorna förnjureskadatill individer och samhälle.

Interleukin-22 (IL-22), en viktig medlem av IL-10-familjens cytokiner, har nyligen tilldragit sig enorm uppmärksamhet som ett överlevnadsmedel vid många sjukdomar som orsakas av epitelskada.11–13 IL -22 framkallar vävnadsskydd och homeostas främst via aktivering av STAT3-signalvägen och främjande av epitelial proliferation.14,15 Viktigt är att studier har visat att uttrycket av IL-22R1 är begränsat till njurproximala TEC:er , och behandling med IL-22 kan skydda mot njurepitelskada och påskynda tubulär regenerering.16,17 Men även om ackumulerande bevis tyder på att IL- 22 är ett effektivt terapeutiskt motgift motnjureskada, lite är känt om de underliggande mekanismerna för IL- 22-inducerad TEC-återställning. Att förstå den molekylära grunden för IL-22 är viktig både för att utforska hur IL-22 verkar för att hämma AKI eller ESTD och för att upptäcka molekylära modifierare samt avgörande processer som är involverade i att förebygga njurskador.

Njurreparation efter skadan är en metaboliskt beroende och komplicerad process.18 Nya bevis tyder på att cellmetaboliska signaturer kan reglera njurcellers överlevnad och plasticitet och därmed ge användbara mekanistiska insikter om hur de metaboliska processerna styr vävnadsreparation.19,20 Specifikt dessa fynd visa att metabolisk omprogrammering av PGC1 eller S-nitroso-CoA-reduktassystemet skyddar motnjureskada. Mekanistiskt kan ökad glykolys och oxidativ fosforylering (OXPHOS) främja tillväxt och defensiva signalvägar eller kan tillgodose de högre energikraven av mitos och anabol biosyntes under organreparation.19,21 Nyligen har våra studier visat att IL-22 lindrar mitokondriell dysfunktion i levern, som involverar cellulära metaboliska processer.22,24 Vi frågar alltså om IL-22 skyddar mot njurskador och apoptos genom att reglera deras metabola tillstånd. För att bestämma mekanismerna för IL-22-medierad njurreparation behandlar vi mänskliga proximala tubulära epitelceller (PTEC) med stressstimulering. Vi föreslår att IL-22 driver metabolisk omprogrammering för att förbättra glykolysen och OXPHOS, som förhindrar TEC-dysfunktion. Vi visar vidare att IL-22 inducerade detta program via aktivering av AMPK/AKT-signalering och dess molekylära modifierare för att lindra mitokondriell dysfunktion. Våra observationer belyser reglering av metabola tillstånd för att behandla och förebygga njursjukdomar och ger nya insikter för att utveckla effektiva nya interventioner för organskador i allmänhet.

Cistanche kan behandlanjureskada

2. MATERIAL OCH METODER

2.1 Reagens

Oligomycin, rotenon och cyanid p-trifluorometoxifenylhydrazon (FCCP) erhölls från Sea horse Biosciences; rekombinant IL-22 tillhandahölls av Novoprotein (Kina); cisplatin (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5',6,6'-tetrakloro-1,1',3,3'-tetraetylbensimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) och förening C erhölls från Beyotime Biotechnology (Kina); antikroppar riktade mot Glutl, -Actin, p-AMPK, AMPK och GAPDH köptes från Abcam; antikroppar för STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 och Caspase-3 köptes från Cell SignalingTechnology; rapamycin, palmitinsyra (Palm.), Z-VAD-FMK och glukos erhölls från Sigma-Aldrich; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red och PKH26 erhölls från Invitrogen.

2.2 Cellkultur

Den humana proximala tubuli-epitelcellen (HK{{0}}) erhölls från Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, och upprätthölls enligt standardprotokoll. HK-2 såddes i plattor med sex brunnar (1 × 106 celler/brunn) eller 96-brunnsplattor (1 × 105 celler/brunn) och odlade i 90 procent RPMI1640-medium (Gibco) kompletterat med 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin och 10 procent fetalt bovint serum (FBS) (Gibco). Vi inkuberade först HK-2 med IL-22 (0,5 µg/ml) i 0,5 h, sedan 50 mM d-glukos eller 5 µg/ml cisplatin eller 0,2 mM palmitinsyra eller eller 4 µM doxorubicin (DOX) ) i 24 timmar. I vissa fall odlades celler i närvaro av Z-VAD-FMK (10 µM), förening C (5 µM), LY294002 (20 µM) eller rapamycin (50 nM) under angivna tider.

2.3 Sjöhästexperiment

Vi analyserade TECs med hjälp av en Seahorse XF96 Extracellular Flux-Analyzer för förändringarna i den extracellulära syrahastigheten (ECAR) och syreförbrukningshastigheten (OCR). Kortfattat, HK-2 (1 × 105) odlades på 96-brunn Seahorse-plattor över natten. Sedan tvättade vi cellerna med ett sjöhästanalysmedium innehållande 1 mM pyruvat, 10 mM glukos och 2 mM glutamin (eller glukosfritt för att testa ECAR) i en atmosfär utan CO2 vid 37◦C för {{18 }}.5 timmar. Experimentella data registrerades efter att de nedan nämnda inhibitorerna injicerades i en optimal koncentration av FCCP (1.0 µM), oligomycin (1.0 µM), rotenon/antimycin A (0.5 µM), 2-DG (50) mM) eller glukos (10 mM).

Cistanche kan behandlanjurskada

2.4 Möss och djurmodeller

BALB/c hanmöss (6–8 veckor) köptes från Slaccas Experimental Animal Co. (Shanghai, Kina). Db/db och Db/m möss tillhandahölls av Model Animal Research Center vid Nanjing University (Nanjing, Kina). Alla möss hölls i specifika patogenfria (SPF) anläggningar och odlades enligt standardprotokoll. För AKI-modellen fick BALB/c-möss cisplatin (20 mg/kg) eller saltlösningskontroll genom intraperitoneal injektion. Db/db-möss matades med en diet med hög fetthalt (HFD) vid de angivna tidpunkterna för att inducera diabetisk nefropati (DN). Db/m möss matades med chow-dieter som kontrollgrupp. I AKI-djurförsök injicerades IL-22 intraperitonealt i dosen 0,5 mg/kg/dag eller 1,5 mg/kg/dag under 4 dagar i följd. I DN-djurförsök injicerades IL-22 intraperitonealt med dosen 2,5 mg/kg två gånger i veckan under åtta på varandra följande veckor. Kontrollmössen fick lämplig mängd PBS. Våra djurexperimentella förfaranden utfördes enligt de protokoll som utvärderats och godkänts av Animal Care and Use Ethics Committee vid School of Pharmacy, Fudan University. Immunhistokemisk färgning, mätning av mitokondriell membranpotential, histologisk och reaktiv syrearter (ROS) färgning av njursektioner utfördes som tidigare beskrivits.22–24

2.5 PCR i realtid

Vi erhöll total-RNA av TRNzol-reagens (Beyotime Biotechnology, Kina) från cell- eller vävnadsprover och transkriberade dem sedan till cDNA med användning av ett MMLV-omvänt transkriptas-testkit (Beyotime Biotechnology). Expressionsnivån av mRNA analyserades av realtids-PCR-instrumenten (BioRad) med användning av SYBR green qPCR-mix-analyskit (Beyotime Biotechnology) och standardiserades till GAPDH.

2.6 Flödescytometri

Njurceller odlades och behandlades såsom beskrivits ovan. MitoSOX (mitokondriell ROS), MitoTracker Green (total mitokondriell massa) och MitoTracker Red (mitokondriell membranpotential) färgning utfördes enligt tillverkarens instruktioner och tidigare forskning.22–24 Vi fick resultaten av Beckman Coulter Flow Cytometer och CytExpert programvara (BD Biosciences).

2.7 Glukosupptag

Vi mätte glukoskoncentrationerna i cellkultursupernatanten med ett test för glukosupptagsanalys enligt tillverkarens protokoll och tidigare forskning (GAHK20; Sigma). Resultatnormalisering utfördes enligt antalet celler.

2.8 Gen knockdown

Vi använde det lilla störande RNA:t (siRNA; RiboBio, Kina) för att slå ner de specifika generna. Först blandades Lipofectamine RNAiMAX och siRNA (100 pmol) försiktigt via pipettering och inkuberades vid 37◦C i 0,5 timmar. Sedan bytte vi standardcellodlingsmediet till en transfektionscocktail och inkuberade cellerna i 6 timmar för siRNA-gentransfektion. Därefter ändrade vi transfektionscocktailen till ett färskt cellodlingsmedium. Efter 48 timmar inkuberades njurceller med IL-22 för ytterligare studier.

Cistanche kan behandlanjurskada

2.9 Western blot

Vi extraherade totala proteiner från celler eller vävnad med RIPA-lysbuffert (Beyotime Biotechnology, Kina). Sedan samlade vi upp lysaten genom centrifugering vid 4◦C vid 12 000 rpm i 10 min. Därefter upphettades lysaten med provbuffertarna vid 100◦C i 15 minuter, utsattes för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och överfördes elektrolytiskt till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Tyskland). Membranen blockerades sedan med 5 procent bovint serumalbumin (BSA) under 2 timmar och saminkuberades med primära antikroppar vid 4◦C över natten. Efter tvättning tre gånger inkuberades membranen med pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar (CST, USA). Proteinblotterna visualiserades av det förbättrade kemiluminescensavbildningssystemet.

2.10 Immunfluorescens

Njurcellerna fixerades med 3 procent –4 procent paraformaldehyd och permeabiliserades med 0,1 procent Triton X-100. Sedan blockerade vi cellerna med 5 procent BSA i 2 timmar. Celler inkuberades över natten med anti-GLUT1-antikroppen vid 4◦C, tvättades fyra gånger och färgades sedan med PKH26. Därefter färgades njurceller med Hoechst 33342 och monterades på objektglas. Data erhölls genom konfokalmikroskopi.

2.11 RNA-seq och bioinformatik

TEC:s prover (2 × 107) lyserades och totalt RNA extraherades med användning av RNeasy mini-kit, enligt tillverkarens protokoll (Beyotime, Shanghai, Kina). Eukaryot RNA-seq utfördes med hjälp av tekniken för nästa generations sekvensering (NGS) på Illumina HiSeq-sekvenseringssystemet, vilket gav en 50-basläslängd. Justering av sekvensläsningar gjordes med hjälp av TopHat v2.0.12 mot UCSC mm10 Assembly. Differentialexpressionsanalys beräknades med hjälp av DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) paket och de statistiska signifikansanalyserna utfördes i R (v3.1.1; http://www .r-project.org/). Överrepresentation av vägen utfördes med användning av R-paketet ReactomePA.

2.12 Statistik

Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (SD) och visades med GraphPad Prism 5.0. För resultat som jämförde två eller flera grupper beräknades skillnaderna med hjälp av studentens t-test eller envägsvariansanalysen (ANOVA): ***p < 0.00="" 1,="" **p="">< 0,01="" och="" *p=""><>

Cistanche kan behandlanjurskada

3. RESULTAT

3.1 IL-22 bevarar cellulär metabolism i TEC

Eftersom mitokondrier hade föreslagits vara viktiga organeller som integrerade cellulär metabolism och apoptotiska processer, bedömde vi mitokondriernas funktion i TECs som stimulerades mednjureskadafaktorer och behandlas med IL-22.25 Som visas i figur 1A–D blockerades mitokondriell basal syreförbrukning (OCR), maximal andningskapacitet (MRC) och andning väsentligt i TEC:erna under stresssituationer. Dessa avvikelser förhindrades till stor del av IL- 22-behandling. Glykolys i skadade TECs, bevisat av extracellulär försurningshastighet (ECAR), var också markant begränsad, jämfört med IL-22 plus stimuli-utmanade TEC (Figur 1B och E). Vi visade vidare att komprometterad oxidativ fosforylering (OXPHOS) och glykolys i skadade TEC inte var de sekundära effekterna av apoptos via sambehandling av en pan-caspase-hämmare (Figur S1). Och IL-22-förmedlade reparativa effekter på metabola defekter var specifika för njur-TEC (Figur S2). Dessutom främjade IL-22 HK2-celler OXPHOS och glykolys i frånvaro av stimuli, vilket indikerar att IL-22s effekter på metabola vägar inte var specifika för skadade TEC (Figur S3). Dessutom visade våra resultat också att IL-22 främjade uttrycket och translokationen av IL-22R1. Samtidigt avväpnades fosforyleringen av STAT3 och metaboliska omprogrammeringseffekter av IL-22 helt av IL-22R1-knockdown (Figur S4). Dessa fynd tydde på att IL-22 återställde TECs metaboliska tillstånd genom att aktivera IL-22R1 direkt. Eftersom flera bevis hade föreslagit att Glut1 spelade en huvudroll i glykolys och glukoshomeostas26, frågade vi därför om IL-22 påverkade Glut1-translokation eller uttryck. Som förväntat visade vi att IL-22 inte bara främjade den translokerade Glut1 till cellmembranytan (PKH26) och Glut1-uttryck, utan också ökade glukosupptaget (Figur 1F och G). Sammantaget indikerade dessa observationer att IL-22 kunde förbättra OXPHOS och glykolys i de skadade TEC.

FIGUR 1 IL-22 bevarar mitokondriell kondition och glykolys i TEC. (A och B) Vi använder Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer för att testa förändringarna i den extracellulära syrahastigheten (ECAR) och syreförbrukningshastigheten (OCR) för TEC. OCR och ECAR i TEC inkuberade med 50 mM glukos, eller 5 µg/ml cisplatin, eller 0.2 mM palmitinsyra, eller 4 µM DOX i närvaro eller frånvaro av IL{{8} }. (C) Maximal andningskapacitet (MRC) av TECs bedömd av realtidsförändringar i OCR. (D och E) Kurvor i OCR och ECAR för TEC efter inkubation med oligomycin, FCCP, glukos, rotenon och {{10}}DG. (F) Lokalisering och uttryck av nukleär (blå), Glut1 (grön) och plasmamembran (röd) i TEC. (G) Glukoskonsumtion i TEC efter IL-22-behandling i 24 timmar. n=3; skalstaplar, 20 µm; Elevens t-test (oparad); ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.2 IL-22 förbättrar ackumuleringen av dysfunktionella mitokondrier i TEC via aktivering av mitofagi

bildning av LC3 puncta i TEC efter exponering för stimuli (Figur 2F). Vi utarmade sedan mitofagi för att bedöma dess funktion på tubulicellmetabolismen via siRNA-ATG5 (Figur S6). Våra data antydde att utarmningen av mitofagi i TEC signifikant hämmade de skyddande effekterna av IL-22 för att bevara mitokondriell kondition (Figur 2E), vilket indikerar att IL-22 förhindrar mitokondriell dysfunktion via aktivering av mitofagi.

FIGUR 2 IL-22 hämmar mitokondriell dysfunktion och mitokondriell ROS-ackumulering via induktion av mitofagi. (A) Mitokondriell massa färgades och bedömdes med MitoTracker Green och flödescytometri. Mitokondriell ROS utvärderades i TEC färgade med MitoSOX (B). Mitokondriell membranpotential utvärderades i TEC färgade med MitoTracker Green och MitoTracker Red (C); mitokondriell ROS-ackumulering utvärderades av MitoTracker Green och MitoSOX (D). (E) Konfokala bildresultat föreslog mitokondriell ROS-produktion märkt med MitoSOX. (F) Representativa mikroskopiska bilder indikerade LC3-GFP-punktformbildning i närvaro eller frånvaro av IL-22 TEC stimulerade som (A) i 24 timmar. (E) OCR bedömdes i närvaro eller frånvaro av IL-22 och siRNA-ATG5 under 24 timmar. n=3; Elevens t-test (oparad); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 upprätthåller mitokondriell integritet hos TEC via aktivering av AMPK/AKT-signalering

AMPK-signaleringen, som en nyckelsignalnav som länkar cellöverlevnad och metabolism, kontrollerad glukosmetabolism, lipidsyntes och mitokondriell funktion.28 Enligt den njurskyddande effekten av interleukin-22 medierad av metabolisk omprogrammering av TEC, bedömde vi om IL-22 reglerad mitokondriell integritet via aktivering av AMPK-signaltransduktion. Vi fann att IL -22 ökade aktiviteten av STAT3/AMPK/AKT-signaltransduktion i de skadade TEC:erna, vilket framgår av fosforyleringen av STAT3, AMPK och AKT (Figur 3A). Dessutom blockerades dessa processer i tubulära celler som saknade STAT3, vilket visade att IL-22 reglerade AMPK/AKT-signalering genom STAT3 (Figur 3B och C; Figur S7). Vi inkuberade ytterligare TEC med förening C och LY294002 för att direkt hämma AMPK/AKT-signaltransduktioner och utvärdera sedan deras mitokondriella funktioner och metabolismtillstånd. Resultaten avslöjade att samtidig behandling med dessa signalhämmare signifikant förhindrade det förbättrade OXPHOS och glykolytiska flödet som inducerades av IL-22-behandling (Figur 3D–I), vilket antydde att IL-22 främjade TECs metabolism genom att aktivera AMPK /AKT-signalväg.

FIGUR 3 Induktion av AMPK/AKT-signalering av IL-22 upprätthåller mitokondriell kondition. TEC stimulerades 50 mM glukos, eller 5 µg/ml cisplatin, eller 0.2 mM palmitinsyra, eller 4 µM DOX i närvaro eller frånvaro av IL-22, förening C , eller LY294002 för angivna tider. (A och B) AMPK/AKT-signalvägaktivering i TECs eller STAT3-WT och STAT3–KD TECs utvärderades med western blot-analys. (C och D) Förändringar i OCR och ECAR för TEC analyserades. (E) AMPK/AKT-signalvägaktivering i TEC:er utvärderades med western blot-analys. (F–I) Förändringar i OCR och ECAR för TEC mättes i TEC jämfört med förening C och LY294002 behandlade TEC. Elevens t-test (oparad); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.4 IL-22 bevarar cellulär metabolism och mitokondriell integritet hos TEC via induktion av PFKFB3

Dessutom, för att utforska hur TECs mitokondriella kondition och metabolism förbättrades, använde vi RNA-sekvenseringsanalys (RNA-seq) för att bedöma genuttryck efter stimuliskada och IL-22-behandling. Vi visade att flera gener förändrades signifikant i TEC efter IL -22 inkubation (Figur 4A). Med hjälp av de tillgängliga databaserna utfördes genuppsättningsanrikningsanalysen av de uppreglerade generna, vilket antydde en anmärkningsvärd anrikning av gener i AMPK-signalvägen och MYC-målsignalvägen (Figur S8). Noterbart inducerades PFKFB3 signifikant av IL-22 bland generna undernjureskadafaktorer stimulering (Figur 4A). Dessa observationer indikerades också av konfokala bilder, Q-PCR och western blot. Det höga uttrycket av PFKFB3 var AMPK/AKT-signalberoende (Figur 4B och C; Figur S9).

Tidigare studier hade föreslagit att PFKFB3 skulle kunna regleras av ett flertal signaltransduktioner för att påskynda epitelregenerering och reparation efter skada.29,30 Vi spekulerade således att IL-22 inducerade PFKFB3 för att bevara den cellulära metabolismen av TEC och bibehålla deras mitokondriella kondition. . Vi observerade att hämningen av AMPK/AKT-signalering minskade PFKFB3-uttryck (Figur 4D). Så vi tystade PFKFB3 för att ytterligare studera dess funktioner i TEC efter IL-22-inkubation. Våra resultat indikerade att tystad PFKFB3 lindrade de metaboliska omprogrammeringseffekterna av IL-22 på att återställa ECAR och OCR (Figur 4E och F), och förhindrade glukosupptag såväl som dysfunktionella mitokondrier (Figur 4G och H). Dessutom visade vi vidare att de metaboliska omprogrammeringseffekterna av IL-22 helt avväpnades av STAT3-nedbrytning medan överuttrycket av PFKFB3 kunde rädda dessa fenotyper, vilket tyder på att IL-22 återställde metaboliskt tillstånd för skadade njurepitelceller via inriktning på STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3-signalering direkt (Figur S10). Sammantaget indikerade dessa fynd att aktiveringen av PFKFB3 spelade en viktig roll i mitokondriell kondition och dysfunktionell mitokondriereliminering efternjureskada.

FIGUR 4 IL-22 upprätthåller mitokondriell integritet och cellulär metabolism av TEC via induktion av PFKFB3. (A) Vulkanplot för genuttryck i TEC stimulerade med glukos, eller cisplatin, eller palmitinsyra, eller CCl4 i närvaro eller frånvaro av IL-22 i 24 timmar. (B) Konfokala mikroskopiska data visade PFKFB3-överuttryck i TEC efter IL-22-behandling, vilket krävde AMPK/AKT-signalaktivering. (C) Realtids-PCR-resultat indikerar att IL-22 inducerade PFKFB3-överuttryck i TEC, vilket kan hämmas av AMPK/AKT-signalblock. (D) AMPK/AKT/PFKFB3-signalvägsaktiveringen i TEC efter behandling med förening C och LY294002. (E och F) ECAR och OCR i TEC vid närvaro eller frånvaro av IL-22, eller si-PFKFB3 under 24 timmar. (G) Glukoskonsumtion i TEC efter IL-22- eller si-PFKFB3-behandling i 24 timmar. (H) Mitokondriell dysfunktion utvärderades i TECs färgade med MitoTracker Red och MitoTracker Green. Elevens t-test (oparad); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0.01,="" *p=""><>

3,5 IL-22 lindrar njurskada vid cisplatin-inducerad AKI via suppression av njur-ROS-ackumulering och mitokondriell dysfunktion

För att testa vår hypotes att IL-22 reglerade njurens metaboliska profiler för att undertrycka njurtubuliskada in vivo, utvärderade vi initialt njurfunktioner hos IL-22-behandlade möss som hade administrerats med cisplatin (Figur 5A). Fyra dagar efter cisplatininjektion minskade IL-22 inte bara avsevärt tubulär cellulär skada och blödning; deras njurdysfunktion hade också försvagats avsevärt, vilket bedömdes av serumnivåerna av blodkarbamidkväve (BUN) och kreatinin (Cr) (Figur 5B–D). Vi föreslog vidare att IL-22 förhindradesnjureskadavia att förbättra njurregenerering och aktivera AMPK/AKT-signalering och PFKFB3 (Figur 5E och F; Figur S11). Därefter använde vi MitoSOX (mitokondrispecifikt ROS-färgämne) och JC-1 (mitokondriemembranpotentialberoende färgämne) för att bedöma den mitokondriella dysfunktionen som är involverad i cellulär metabolism och apoptos. I njursektionerna hos möss som hade behandlats med cisplatin fanns jämförbara ansamlingar av ROS. Notera att fyra dagar efter IL-22-behandling var nivåerna av ROS markant reducerade i de skadade njurarna i jämförelse med ROS från möss efter PBS-behandling (Figur 5G). Sammantaget gav dessa observationer bevis på att IL-22 spelade en skyddande roll i cisplatininducerad AKI genom att kontrollera mitokondriell kondition.

FIGUR 5 IL-22 lindrar njurskador i cisplatininducerad AKI via hämning av njur-ROS-ackumulering och dysfunktionella mitokondrier. (A) Schematiskt diagram över de experimentella protokollen för att utvärdera de skyddande effekterna av IL-22 i cisplatin (20 mg/kg) inducerad njurskada. PBS som en vehikelkontrollgrupp och N-acetyl-l-cystein (NAC, 150 mg/kg) som en positiv kontrollgrupp. (B och C) Serum BUN-nivåer, serum-Cr-nivåer, njurvikter och kroppsvikter bedömdes. Representativa HE (D), Ki-67-färgning (E), MitoSOX (G) och JC{{10}} (G) bilder av njursektionerna presenterades. (F) Jämförelse av STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3-aktivering i njurextrakt från de IL-22-behandlade mössen utvärderades med western blöt. Elevens t-test (oparad); n=3; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.6 IL-22 förbättrar diabetes-inducerad njurskada via hämning av mitokondriell dysfunktion genom aktivering av AMPK/AKT-signalering och PFKFB3

Vi och andra hade visat att IL-22 kunde utöva skyddande styrka vid diabetisk nefropati (DN), vilket var huvudorsaken till ESTD.31–33 För att ytterligare studera de underliggande mekanismerna matade vi db/db-möss med hög- fettdieter (HFD) och behandlade dem sedan med IL-22 (2,5 mg/kg, IP) i 8 veckor (Figur 6A). När möss endast matades med HFD fann vi tubulär fibros och dilatation i njurarna, förutom atrofi. Däremot, när möss behandlades med IL-22, förbättrades njurfibros och histopatologi signifikant, såväl som njurfunktionerna. Förbättrade njurfunktioner visades också genom minskade serum-Cr, BUN-nivåer och totala urinalbumin/24 timmar (UAE) nivåer (Figur 6B–E). För att studera om dessa aktiviteter var associerade med mitokondrier bedömde vi den mitokondriella funktionen involverad i cellulär metabolism och apoptos. Resultaten visade att de ökade mitokondriella ROS-nivåerna och ackumulerade dysfunktionella mitokondrier lindrades avsevärt genom IL-22-behandling (Figur 6F och G). För att ytterligare studera om de skyddande funktionerna hos IL-22 i njuren medierades genom PFKFB3, injicerade vi möss med PFKFB3 shRNA-adenovirus för att slå ner PFKFB3. Våra data indikerade att de fördelaktiga effekterna av IL-22 på HFD-inducerad njurskada, nekros, steatos, mitokondriell dysfunktion och ROS-ackumulering och aktiveringen av relaterade signalvägar blockerades signifikant av PFKFB3-nedbrytning (Figur 6B–G) . Det ökade uttrycket av AMPK/AKT-signalering observerades också efter behandling med IL-22 (Figur 6H). Tillsammans med lindring av njurdysfunktion förbättrades uttrycken av PFKFB3 och viktiga enzymer i cellulär metabolism också i njurarna hos IL-22-behandlade möss (Figur 6H och I). Dessutom indikerade histologisk analys av större organ inga morfologiska skador efter IL-22-injektion, vilket tyder på att IL-22 kan vara ett säkert motgift utan signifikanta biverkningar eller toxiska reaktioner förnjureskadastörningar (Figur 12S). Sammantaget antydde våra data att IL- 22 lindrade njurskador genom aktivering av AMPK/AKT-signaltransduktion, hämning av ROS-ackumulering och mitokondriell funktionsreglering genom PFKFB3.

FIGUR 6 IL-22 lindrar diabetes-inducerad njurskada genom AMPK/AKT-signalering och hämning av dysfunktionella mitokondrier via aktivering av PFKFB3. (A) Schematiskt diagram över de experimentella protokollen för att utvärdera de skyddande effekterna av IL -22 vid diabetes-inducerad njurskada. Db/m som vehikelkontrollgrupp. (B–D) Serum BUN-nivåer, serum-Cr-nivåer och UAE utvärderades. Representativa HE (E), MitoSOX (F) och JC-1 (G) bilder av njursektionerna presenterades. (H och I) Jämförelse av STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3-aktivering i njurextrakt från IL-22-behandlade möss utvärderades med western blöt. Elevens t-test (oparad); n=3; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4. DISKUSSION

IL-22 utsöndras av immunceller, såsom NK-celler, neutrofiler, medfödda lymfoida celler (ILC) och T-celler, men påverkar inte dessa celler direkt. Det reglerar övervägande epitelcellers funktioner på grund av det begränsade uttrycket av IL-22R1 på epitelceller inklusive TEC.15,34 Tidigare studier har föreslagit att IL-22 kan skydda mot njurepitelskada och påskynda tubulär regenerering genom hämning av NLRP3-inflammasom och aktiverande STAT3- och AKT-signalering.16,31 De bakomliggande mekanismerna för detta skydd är dock ännu inte klarlagda. För att ytterligare bestämma den molekylära basen för IL- 22s funktion injureskada, undersöker vi först om IL-22 kan lindra njurcellsdysfunktion och efterföljande apoptos genom att reglera deras metaboliska tillstånd. Dessutom studerar vi två modeller avnjureskadasjukdomar (AKI och DN) med IL-22-administrering och jämför observationerna med kontrollgrupperna. Vi indikerar att IL-22 korrigerar metabolisk omprogrammering för att bibehålla mitokondriell integritet, minskar mitokondriell ROS-ackumulering i skadade TEC och lindrar progressiv njurskada och nekros. Dessutom tyder våra fynd på att IL- 22 kan aktivera AMPK/AKT-associerade signalvägar i TEC och njurar, viktiga mediatorer för epitelial sårläkning och cellöverlevnad, för att förbättra mitokondriell dysfunktion och de försämrade metabola profilerna och öppna upp en ny fält för IL-22-medierad njurskyddsmekanism. Sammantaget indikerar våra resultat att de njurskyddande effekterna av IL-22 förmedlas via metaboliska omprogrammeringsprocesser.

Den kritiska rollen för OXPHOS och glykolys i njurskydd har avslöjats i tidigare studier, där balansering av bränsleutnyttjande genom hämmande S-nitrosylering av pyruvatkinas M2 (PKM2) skyddar motnjureskada.19 Våra resultat, som antyder främjande av OXPHOS och glykolys av IL-22 via ökat uttryck av metabola regulatorer och glukosupptag, visar att IL-22 reverserar de försämrade metabola tillstånden som är förknippade mednjureskada. Dessa observationer överensstämmer med de njurskyddande funktionerna hos rekombinant irisin och även i linje med fynd från hepatocyter, där både OXPHOS och glykolys behövs för cellulära funktioner, men om dessa hämmas blir de primära tubulicellerna och hepatocyterna dysfunktionella.35, 36

Mitokondriell dysfunktion har dykt upp som den viktigaste molekylära basen som integrerar metaboliska profiler och celldöd. Här illustrerar vi att vid stimulering av skadefaktorer hade TECs behandling med IL-22 förbättrat ackumuleringen av mitokondriell ROS och dysfunktionella mitokondrier jämfört med den minskade mitokondriella integriteten och funktionen i kontrollgrupper. Viktigt är att AMPK-signalvägar, kritiska energisensorer, modulerar metaboliska processer för att upprätthålla cellulär homeostas och förhindra cell- eller vävnadsskada.37–39 I den aktuella studien indikerar våra observationer att IL-22 bevarar mitokondriell integritet och funktion genom att aktivera AMPK/AKT-signalering för att visa att IL-22 förhindrar mitokondriell dysfunktion i en direkt metod, vilket är avgörande för att bibehålla TEC:s andningskapacitet. Dessutom visar vi att IL-22-signalering genom STAT3 har direkta effekter på att bevara mitokondriell kondition, eftersom de har undersökts tidigare att inducerad STAT3-fosforylering är avgörande för att bevara mitokondriell integritet.40,41

Flera typer av litteratur har tidigare visat att PFKFB3 spelar rollen som en central modulator i cellmetabolism.29–30,42 Här visar vi först att IL-22 främjar PFKFB3-aktivering genom AMPK/AKT-signalering i TEC, vilket tyder på IL{ {6}} reglerar metabola tillstånd genom att involvera kontroll av PFKFB3. Dessutom indikerar tidigare studier att PFKFB3 är viktigt för att kontrollera den överdrivna OXPHOS och glykolysen i många celler eller vävnader.42,43 I enlighet med dessa studier indikerar våra observationer också främjandet av OXPHOS och glykolys i IL-22- behandlade TEC via aktivering av PFKFB3. Bland många nedströmsmodulatorer av IL-22 som har undersökts illustrerar våra data att PFKFB3 är signifikant uppreglerad efter IL-22-behandling under TEC-skada och att STAT3–AMPK/AKT PFKFB3-axeln är avgörande för bevarandet av mitokondriell integritet undernjureskada(Figur 7). De återstår att undersöka om IL-22 även reglerar andra metaboliska regulatorer och processer relaterade till njurskada genom att aktivera STAT3–AMPK/AKT-PFKFB3-signalvägen.

FIGUR 7 Våra resultat illustrerar en viktig roll för IL-22 för att kontrollera njurcellsmetabolism för att behandla njurskador genom att aktivera STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3-axeln. Dessa resultat tyder på att de terapeutiska möjligheterna för IL-22 och inriktning på associerad metabol signalering kan vara direkt gynnsamma för många behandlingar eller förebyggande av njurskador

5. SLUTSATSER

Sammanfattningsvis visade vi den terapeutiska potentialen och underliggande mekanismerna för IL-22 vid njurskador. IL-22 reglerade njurcellsmetabolism via metabolisk omprogrammering för att bevara mitokondriell integritet. Hämning av deras regulatorer (dvs AMPK, Akt och PFKFB3) kan leda till onormala metaboliska profiler och förlust av mitokondriell kondition, vilket indikeras i TECs med spontan-22 behandling, vilket hade ökat dysfunktionella mitokondrier och mitokondriell ROS-ackumulering. Det viktigaste är att njurskadorna genom mitokondriell dysfunktion och ROS-ackumulering i mössmodeller lindrades avsevärt genom IL-22-behandling genom aktivering av STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3-signalering. Således indikerade vår studie att inriktning på associerad metabol signalering kan vara direkt fördelaktig för många njurskador och IL-22 är ett potentiellt terapeutiskt medel för att förebygga och behandla dessa sjukdomar.

Cistanche produkter kan behandlanjurskada

Från: 'IL-22-medierad njurmetabolisk omprogrammering via PFKFB3 för att behandlanjureskada' förbiWei Chen, et al

---Clin. Transl. Med. 2021;11:e324.

REFERENSER

1. Mehta RL, Burdmann EA, Cerdá J, et al. Erkännande och hantering av akutnjureskadai International Society of Nephrology 0av25 Global Snapshot: en multinationell tvärsnittsstudie. Lansett. 2016;387:2017-2025.

2. Lameire NH, Bagga A, Cruz D, et al. Akutnjureskada: en ökande global oro. Lansett. 2013;382:170-179.

3. Mehta RL, Cerdá J, Burdmann EA, et al. International Society Nephrologys 0by25-initiativ för akutnjureskada(noll dödsfall som kan förebyggas till 2025): ett fall för mänskliga rättigheter för nefrologi. Lancet. 2015;385:2616-2643.

4. Levey AS, James MT. Akutnjureskada. Ann Intern Med.2017;167:ITC66-ITC80.

5. Jansen MPB, Florquin S, Roelofs JJTH. Trombocyternas roll vid akutnjureskada. Nat Rev Nephrol. 2018;14:457-471.

6. Agarwal A, Dong Z, Harris R, et al. Cellulära och molekylära mekanismer för AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27:1288-1299.

7. Linkermann A, Chen GC, Dong G, Kunzendorf U, KrautwaldS, Dong Z. Reglerad celldöd i AKI. J Am Soc Nephrol.2014;25:2689-2701.

8. Ferenbach DA, Bonventre JV. Mekanismer för maladaptiv reparation efter AKI som leder till accelererat njuråldring och CKD.Nat Rev Nephrol. 2015;11:264-276.

9. Chawla LS, Eggers PW, Star RA, Kimmel PL. Akutnjureskadaoch kronisk njursjukdom som sammankopplade syndrom. N Engl J Med. 2014;371:58-66.

10. He L, Wei QQ, Liu J, et al. AKI på CKD: ökad skada, undertryckt reparation och de underliggande mekanismerna. Kidney Int.2017;92:1071-1083.

11. Forbester JL, Lees EA, Goulding D, et al. Interleukin-22 främjar fagolysosomal fusion för att inducera skydd mot salmonella enterica Typhimurium i mänskliga epitelceller. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:10118-10123.

12. Geng H, Bu HF, Liu F, et al. I inflammerade tarmvävnader och epitelceller ökar interleukin 22-signalering uttrycket av H19 långt icke-kodande RNA, vilket främjar slemhinneregenerering. Gastroenterologi. 2018;155:144-155.

13. Aden K, Tran F, Ito G, et al. ATG16L1 orkestrerar interleukin-22-signalering i tarmepitelet via cGAS-STING. J ExpMed. 2018;215:2868-2886.

14. Huber SN, Gagliani LA, Zenewicz FJ, et al. IL-22BP regleras av inflammasomen och modulerar tumörbildning i tarmen. Natur. 2012;491:259-263.

15. Lindemans CA, Calafiore M, Mertelsmann AM, et al. Interleukin-22 främjar intestinal-stamcell-medierad epitelregenerering. Natur. 2015;528:560-564.

16. Xu MJ, Feng D, Wang H, Guan Y, Yan X, Gao B. IL-22 förbättrar njurischemi-reperfusionsskada genom att rikta in sig på proximalt tubuliepitel. J Am Soc Nephrol. 2014;25:967-977.

17. Kulkarni OP, Hartter I, Mulay SR, et al. Toll-liknande receptor 4-inducerad IL-22 påskyndar njurregenerering. J Am Soc Nephrol. 2014;25:978-989.

18. Kang HM, Ahn SH, Choi P, et al. Defekt fettsyraoxidation i tubulära njurepitelceller har en nyckelroll i utvecklingen av njurfibros. Nat Med. 2015;21:37-46.

19. Zhou HL, Zhang R, Anand P, et al. Metabolisk omprogrammering av S-nitroso-CoA-reduktassystemet skyddar motnjureskada. Natur. 2019;565:96-100.

20. Dumesic PA, Egan DF, Gut P, ​​et al. En evolutionärt konserverad uORF reglerar PGC1 och oxidativ metabolism hos möss, flugor och blåfenad tonfisk. Cell Metab. 2019;30:190-200.

21. Shyh-Chang N, Zhu H, Yvanka de Soysa T, et al. Lin28 förbättrar vävnadsreparation genom att omprogrammera cellulär metabolism. Cell. 2013;155:778-792.

22. Chen W, Luan J, Wei G, et al. In vivo hepatocellulärt uttryck av interleukin-22 med penetrationsbaserade hybridnanopartiklar som potentiella läkemedel mot hepatit. Biomaterial. 2018;187:66- 80.

23. Chen W, Zhang X, Fan J, et al. Att koppla interleukin-22 till apolipoprotein AI lindrar möss från acetaminofen-inducerad leverskada. Teranostik. 2017;7:4135-4148.

24. Zai W, Chen W, Wu Z, et al. Riktad interleukin-22-genleverans i levern av polymetformin och penetrationsbaserade hybridnanopartiklar för att behandla icke-alkoholisk fettleversjukdom. ACS Appl Mater-gränssnitt. 2019;11:4842-4857.

25. Khacho M, Harris R, Slack RS. Mitokondrier som centrala regulatorer av neurala stamcellers öde och kognitiv funktion. Nat Rev Neurosci. 2019;20:34-48.

26. Ip WKE, Hoshi N, Shouval DS, Snapper S, Medzhitov R. Antiinflammatorisk effekt av IL-10 medierad av metabolisk omprogrammering av makrofager. Vetenskap. 2017;356:513-519.

27. Saito Y, Chapple RH, Lin A, Kitano A, Nakada D. AMPK skyddar leukemiinitierande celler i myeloid leukemi från metabolisk stress i benmärgen. Cellstamcell. 2015;17:585- 596.

28. Mihaylova MM, Shaw RJ. AMPK-signalvägen koordinerar celltillväxt, autofagi och metabolism. Nat Cell Biol. 2011;13:1016-1023.

29. Li FL, Liu JP, Bao RX, et al. Acetylering ackumulerar PFKFB3 i cytoplasman för att främja glykolys och skyddar celler från cisplatin-inducerad apoptos. Nat Commun. 2018;9:508.

30. De Bock K, Georgiadou M, Schoors S, et al. Roll av PFKFB3--driven glykolys i kärlgroning. Cell. 2013;154:651-663.

31. Dudakov JA, Hanash AM, van den Brink MR. Interleukin-22: immunbiologi och patologi. Annu Rev Immunol. 2015;33:747- 785.

32. Wang S, Li Y, Fan J, et al. Interleukin-22 förbättrade njurskada och fibros vid diabetisk nefropati genom hämning av NLRP3-inflammasomaktivering. Celldöd Dis. 2017;8:e2937.

33. Shen YL, Chen W, Han L, et al. VEGF-B-antikropp och interleukin-22-fusionsprotein förbättrar diabetisk nefropati genom att hämma lipidackumulering och inflammatoriska svar. Acta Pharm Sin B. 2020. https://doi.org/10.1016/j. apsb.2020.07.002.

34. Ouyang W, O'Garra A. IL-10 familjens cytokiner IL-10 och IL-22: från grundläggande vetenskap till klinisk översättning. Immunitet. 2019;50:871- 891.

35. Xiang X, Feng D, Hwang S, et al. Interleukin-22 lindrar akut-på-kronisk leversvikt genom att omprogrammera försämrade regenereringsvägar hos möss. J Hepatol. 2020;72:736-745.

36. Chen W, Zai W, Fan J, et al. Interleukin-22 driver en metabolisk adaptiv omprogrammering för att bibehålla mitokondriell kondition och behandla leverskador. Teranostik. 2020;10:5879-5894.

37. Peng H, Wang Q, Lou T, et al. Myokinmedierad muskel-njure-överhörning undertrycker metabolisk omprogrammering och fibros i skadade njurar. Nat Commun. 2017;8:1493.

38. Saberi B, Ybanez MD, Johnson HS, Gaarde WA, Han D, Kaplowitz N. Proteinkinas c (PKC) deltar i acetaminophen hepatotoxicitet genom c-jun-n-terminal kinas (jnk)-beroende och -oberoende signalvägar. Hepatologi. 2014;59:1543-1554.

39. Mo R, Lai R, Lu J, et al. Förbättrad autofagi bidrar till skyddande effekter av IL-22 mot acetaminofen-inducerad leverskada. Teranostik. 2018;8:4170-4180.

40. Wegrzyn J, Potla R, Chwae YJ, et al. Funktion av mitokondriell Stat3 i cellandning. Vetenskap. 2009;323:793-797.

41. Chen W, Hu Y, Ju D. Genterapi för neurodegenerativa störningar: framsteg, insikter och framtidsutsikter. Acta Pharm Sin B. 2020;10:1347-1359.

42. Cao Y, Zhang X, Wang L, et al. PFKFB3-medierad endotelglykolys främjar pulmonell hypertoni. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116:13394-13403.

43. Doménech E, Maestre C, Esteban-Martínez L, et al. AMPK och PFKFB3 förmedlar glykolys och överlevnad som svar på mitofagi under mitotiskt arrest. Nat Cell Biol. 2015;17:1304- 1316.