Selektiv cytotoxicitet av örtsubstansen akteosid mot tumörceller och dess mekanistiska insikter

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Christina Cheimonidi et al

ABSTRAKT

Naturliga produkter kännetecknas av extrem strukturell mångfald och erbjuder därför en unik källa för identifiering av nya antitumörmedel. Häri rapporterar vi att det växtbaserade ämnetakteosidatt isoleras med avancerade fytokemiska metoder från Lippia citriodora-blad visade ökad cytotoxicitet mot metastaserande tumörceller; verkade i synergi med olika cellgifter och sensibiliserade kemoresistenta cancerceller.Akteosidvar inte giftigt i fysiologiska cellulära sammanhang, medan det ökade oxidativ belastning, påverkade aktiviteten hos proteostatiska moduler och undertryckte matrismetalloproteinaser i tumörcellinjer. Intraperitoneal eller oral (via dricksvatten) administrering av akteosid i en melanommusmodell uppreglerade antioxidantsvar i tumörerna; ändå undertryckte endast intraperitoneal leverans tumörtillväxt och inducerade antitumörreaktiva immunsvar. Masspektrometri identifiering/kvantifieringsanalyser visade att intraperitoneal leverans avakteosidresulterade i signifikant högre, jämfört med oral administrering, koncentrationen av föreningen i plasma och tumörer hos behandlade möss, vilket tyder på att dess antitumöreffekt in vivo beror på administreringsvägen och den uppnådda koncentrationen i tumören. Slutligen visade molekylära modelleringsstudier och enzymatiska aktivitetsanalyser detakteosidhämmar proteinkinas C. Sammanfattningsvis är akteosid lovande som en kemisk ställning för utvecklingen av nya antitumörmedel.

Nyckelord:Akteosid, Cancer, Naturlig förening, Oxidativ stress, Proteostas, Immunmodulering

cistanche akteosid

1. Introduktion

Karcinogenes kännetecknas av avregleringen av flera cellsignaleringsvägar och är associerad med ökad cellulär oxidativ, replikativ, metabolisk, genotoxisk och proteotoxisk stress [1]. För att anpassa och övervinna dessa stressfenotyper uppreglerar maligna celler (bortsett från onkogener) flera icke-onkogena vägar som syftar till att antingen undertrycka eller (åtminstone) lindra pågående stress. Bland de olika icke-onkogena vägarna som ofta uppregleras under tumörbildning är modulerna i proteostasnätverket (PN) tillsammans med cellulära antioxidantsvar [2,3].

Nyckelkomponenter i PN är de två huvudsakliga nedbrytningsmaskineriet, nämligen Autophagy-Lysosome pathway (ALP) och Ubiquitin-Proteasom Pathway (UPP), tillsammans med nätverket av cellulära molekylära chaperoner. ALP är huvudsakligen involverat i nedbrytningen av proteinaggregat och skadade organeller [4], medan UPP bryter ned normala kortlivade proteiner och icke-reparerbara felveckade eller oveckade proteiner [5-8]. Den 26seukaryota proteasomen består av 19S regulatoriska partiklar (RP) och 20 Score-partiklarna (CP); den senare består av fyra staplade heptameriska ringar (två av -typ som omger två av -typ) som bildar en tunnliknande struktur. De kymotrypsinliknande (CT-L), trypsinliknande (TL) och kaspasliknande (CL) proteasompeptidasaktiviteterna är belägna vid de 5, 2 respektive 1 proteasomala subenheterna [6]. Den påvisade kliniska effekten av proteasomhämmarna Bortezomib (Velcade®; även kallad PS-341) och Carfifilzomib mot olika hematologiska maligniteter [9] har gett "proof-of-concept" för att rikta in UPP som en lovande strategi för behandling av cancer. Det komplexa nätverket av cellulära antioxidantförsvarsvägar som ofta uppregleras under karcinogenes [3,10] inkluderar antioxidantenzymer, såväl som flera transkriptionsfaktorer som mobiliserar cytoprotektiva genomiska svar; dessa inkluderar gaffellåda O (Foxo) och den nukleära faktorn erytroid 2-relaterade faktorn (Nrf-2). Nrf-2 är central i skyddet av celler mot oxidativ och/eller främlingsfientlig skada eftersom den stimulerar uttrycket av antioxidant- och fas II-gener [11-13].

Vi och andra har nyligen föreslagit att inriktning på dessa tumörberoenden (dvs. proteostatiska moduler och/eller antioxidantsvarsvägar) eller ökande cellulära nivåer av ROS i samband med en transformerad genotyp erbjuder ett potentiellt terapeutiskt fönster för selektiv dödande av tumörceller [3 ,14]; som stöd har selektiv dödande av cancerceller av en liten molekyl som uppreglerade cellulära ROS-nivåer rapporterats [2]. Det förväntas att kombinatoriska tillvägagångssätt inklusive aktivering av antitumörreaktiva immunsvar [15] sannolikt kommer att maximera det terapeutiska fönstret som erbjuds genom att hämma PN- och antioxidantsvar och/eller genom att höja cellulära ROS-nivåer.

Naturliga produkter (extrakt eller rena föreningar) (NP) från olika källor (växter, marina organismer, mikroorganismer, etc.) screenas för deras förmåga att fungera som antitumörmedel på grund av deras extrema strukturella mångfald och kemiska komplexitet, samt pga. de verkar pleiotropiskt modulerande flera cellulära signalvägar [16]. Enligt rapporter aktiverar NP antiinflammatoriska, anti-tumör- och/eller antimetastatiska svar [16,17] och undviker också multidrogresistens [18,19]. Bland dessa har fenolföreningar (inklusive fenyletanoidglykosider) väckt betydande intresse på grund av deras rapporterade roll i förebyggandet och/eller behandlingen av olika mänskliga sjukdomar.

Akteosid, även kallad användning eller verbascoside [20], är en fenyletanoid glykosid isolerad från många tvåhjärtbladiga. Enligt uppgift utövar akteosid några intressanta biologiska aktiviteter, inklusive antioxidanter, antiinflammatoriska och cellapoptosreglerande egenskaper [21,22]. Ändå har dess potentiella antitumöraktivitet inte behandlats. Vi rapporterar här att akteosid visade ökad cytotoxicitet mot cancerceller från däggdjur utan uppenbara toxiska effekter i fysiologiska cellulära sammanhang. Dessutom undertryckte akteosid melanomtumörtillväxt i Vivo-musmodellen, genom att (bland andra) aktivera antitumörreaktiva immunsvar.

effekterna avcistanche akteosid

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial och utvinning

torkade Lippia citriodora (Lamiaceae) blad (4,5 kg) köptes från den lokala marknaden i Aten, Grekland. Bladen pulveriserades och extraherades genom mekanisk omrörning i 12 timmar med metanol (2 x 20 L). Metanolextraktet indunstades till torrhet och tvättades med en blandning av CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L). Den olösliga återstoden separerades och torkades, vilket gav ett gröngult pulver (450 g).

2.2. Rening av akteosid och UPLC-HRMS-analys

En del (10 g) av den tidigare nämnda återstoden utsattes för motströmskromatografi med användning av en snabb centrifugalfördelningskromatografi (FCPC) apparat (Kromaton, Frankrike); en blandning av EtOAc/EtOH/H2O i förhållandet 5/0,5/4,5 användes som ett tvåfasiskt lösningsmedelssystem. Uppsamlade fraktioner utsattes för tunnskiktskromatografi; sedan observerades kromatogrammen under en UV-lampa (254 och 365 nm) och visualiserades genom sprayning med metanolvanillinsulfat följt av upphettning i två minuter. Totalt 2,1 g akteosid (renhet större än eller lika med 90 procent) isolerades genom det förutnämnda förfarandet. Identifieringen av akteosid utfördes genom kärnmagnetisk resonans (NMR) och masspektrometri (MS)-spektra, medan dess renhet fastställdes genom UPLC-MS och NMR-analys; för detaljer se Suppl. Material och metoder.

2.3. Cellinjer

Humana lungembryonala fibroblaster (IMR90-celler) tillsammans med B16.F1-, B16.F10-, YAC-1- och WEHI-164-muscellinjerna erhölls från American Tissue Culture Collection (ATCC). U2 OS och Sa OS humana osteosarkomcellinjer donerades vänligt av prof. V. Gorgoulis (School of Medicine, National and Kapodistrian University of Athens, Grekland), medan KH OS osteosarkomcellerna och de kemoresistenta osteosarkomcellinjerna [23] var en donation av Dr. E. Gonos (National Hellenic Research Foundation, Grekland). Muscancercellinjerna C5N och A5 tillhör en flerstegs mushudkarcinogenesmodell [24,25] och donerades av Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Odlingsbetingelser för de använda cellinjerna rapporteras i Suppl. Material och metoder.

nytta avcistanche akteosid

2.4. Melanom mus modell hane

C57BL/6-möss (25–30 g i vikt, 6–8 veckor gamla) erhölls från Hellenic Pasteur Institute och hölls under kontrollerad temperatur (22 grader) och fotoperiod (12 timmar ljus:12 timmar mörker) ) med fri tillgång till vatten och mat. Möss inokulerades subkutant med 105 B16.F1-melanomceller (i 100 μL PBS) och tilldelades slumpmässigt 3 grupper (n=5/grupp). När tumörer blev påtagliga (dag 11) fick möss akteosid via två vägar; antingen intraperitonealt (IP) (1 mg/mus utspädd i 200 μL PBS; totalt 6 doser administrerade varannan dag) eller oralt med dricksvatten (OR) (2,5 mg/mus; totalt 13 doser under 13 på varandra följande dagar). Kontrollmöss administrerades PBS. Tumörtillväxt registrerades varannan dag genom att de bildade tumörernas stora och mindre axlar mättes med en digital skjutmått. Mätningar transformerades till tumörvolym med hjälp av formeln: tumörvolym (cm3)=huvudaxel × mindre axel2 × 0,5. På dag 28 avlivades djuren genom cervikal dislokation och mjältar avlägsnades aseptiskt. Experimentet upprepades tre gånger med liknande fynd.

Splenocyter isolerades från individuellt homogeniserade mjältar och testades omedelbart för deras cytotoxicitet jämfört med B16.F1-, YAC-1- och WEHI-164-cellmål. Cytotoxicitet utvärderades baserat på detektering av CD107-exponering på cellytan, som ett resultat av effektorcellsdegranulering. Splenocyter (105 celler/brunn) samodlades med mål i 96-brunns U-bottenmikroplattor vid ett förhållande mellan effektor och mål (E:T) på 100:1, vid 37 grader i 5 procent CO2. FITC-konjugerade anti-CD107a och anti-CD107b monoklonala antikroppar (25 μL/mL) och monensin (6 μL/mL; alla från BD Biosciences) tillsattes i varje brunn. Celler skördades 6 timmar senare och analyserades med en FACSCanto II flödescytometer. Parallellt skars tumörer ut och bearbetades för nedströmsanalyser såsom beskrivs i Suppl. Material och metoder.

cistanche akteosid