Simulerad mikrogravitation påverkar immunitetsrelaterade biomarkörer vid lungcancer

Abstrakt: Mikrogravitation är en ny strategi som kan fungera som ett kompletterande verktyg för att utveckla framtida cancerterapier. Vid lungcancer är påverkan av mikrogravitation på cellulära processer och cellers migrationskapacitet väl behandlad. Dess effekt på mekanismerna som driver utvecklingen av lungcancer är dock fortfarande i sin linda. I denna studie visades 13 differentiellt uttryckta gener vara associerade med prognosen för lungcancer under simulerad mikrogravitation (SMG). Genom att använda genuppsättningsanrikningsanalys anrikas dessa gener i humorala immunitetsvägar. I stället exponerades alveolära basala-epitelceller (A549) för SMG via ett 2D-klinostatsystem in vitro. Förutom morfologiförändring och minskning av proliferationshastighet, återställde SMG fenotypen epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) av A549, en nyckelmekanism i cancerprogression. Detta bevisades av ökat epitelialt E-cadherin-uttryck och minskat mesenkymalt N-cadherin-uttryck, vilket uppvisade ett mindre metastatiskt tillstånd. Intressant nog observerade vi ökat uttryck av FCGBP, BPIFB, F5, CST1 och CFB och deras korrelation till EMT under SMG, vilket gjorde dem till potentiella tumörsuppressorbiomarkörer. Tillsammans avslöjar dessa fynd nya möjligheter att etablera nya terapeutiska strategier för behandling av lungcancer.

Nyckelord: simulerad mikrogravitation; EMT; lungcancer; metastas; tumörsuppressor; biomarkör

Effekter av Cistanche ört-Antitumor

1. Introduktion

Rymd är känt för att sakna gravitationsvektorn, som påverkar kroppen på organ-, vävnads- och cellnivå. Mikrogravitation, ett tillstånd av uppenbar viktlöshet, är en betydande rymdstressfaktor som är känd för att signifikant påverka människors hälsa, såsom benförlust, muskelatrofi och hjärtdekonditionering [1,2]. Effekten av mikrogravitation på cancerceller har också varit en växande fokuspunkt för rymd- och cancerforskning. Mikrogravitation har visat sig undertrycka immuncellers aktivitet och störa multikroppssystem, vilket kan öka risken för att utveckla cancer [2-4]. På grund av dessa uppenbara hälsoproblem har mikrogravitationsmiljön gjort det möjligt för forskare att studera de biofysiska mekanismer som påverkas av mikrogravitation och hjälpt till att upptäcka terapier för neurodegenerativa störningar, immunterapier och potentiellt bättre och mer riktade anti-cancerterapier [4–6]. Många studier har väl dokumenterat och granskat den stora implikationen som mikrogravitation har på cellulär progression, proliferation och apoptos i otaliga tumörcellinjer, inklusive lungcancer [7–12]. Men många andra studier som involverar mikrogravitation har visat sig inducera förändringar i genuttryck som är involverade i cancercellsproliferation, metastasering och överlevnad, vilket förskjuter cellerna mot en mindre aggressiv fenotyp [13,14]. Detta kan kasta ljus över nya förståelser av tumörbiologi och diagnos, och därav lyfta fram mikrogravitation som ett innovativt verktyg för att upptäcka nya mål i hopp om att utveckla nya forskningsmetoder och förbättra terapeutiska strategier. Lungcancer, med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) som den mest framträdande typen, är en ledande dödsorsak, står för 12 % av alla cancerfall och är den vanligaste diagnostiserade cancern [15]. I studier som involverar mikrogravitation, som kan vägleda oss att bättre förstå den cancerframkallande processen, visades lungcancerceller förlora sin stam efter exponering för mikrogravitation, vilket påverkar cancercellernas tillväxt och funktion [11]. En studie av Ahn et al. visade att exponering av lungcancerceller (A549) för mikrogravitation inducerade snabb migration och spridning. Detta förklarades av de uppreglerade nivåerna av matrismetalloproteaser (MMP-2 och MMP-9) under mikrogravitation, vilket spelar en avgörande roll i cancerinvasion och migration [10]. I en annan studie, Chung et al. fann att simulerad mikrogravitation inte signifikant påverkade lungcancercellproliferation utan snarare ökad migration jämfört med kontrollgruppen under normal gravitation [16]. Tvärtom, Chang et al. visade en minskning av migration i A549 lungcancercellinjen efter 24 timmars exponering för mikrogravitationsförhållanden [17]. Trots de betydande effekterna av mikrogravitation på cellulärt beteende, som innefattar apoptos, migration och invasivitet, är dess effekt på lungcancer ännu inte helt klarlagd. Det är väl etablerat att epitelceller genomgår flera biokemiska förändringar för att etablera en mesenkymal fenotyp som förbättrar apoptosresistens, invasivitet och migrationsförmåga. En sådan biologisk process är känd som epitel-till-mesenkymal övergång (EMT), ett kännetecken för cancerprogression [18]. Förhållandet mellan EMT och cancerprogression har diskuterats väl. Tumörer är kända för att aktivera EMT genom att uppreglera transkriptionsfaktorer, uttrycka cellyteproteiner och producera ECM-nedbrytande enzymer. När EMT är aktiverat förlorar tumörcellerna sin cell-celladhesion och förvärvar migrerande och invasiva egenskaper [19]. Endast två studier har visat att simulerad mikrogravitation inducerar transient epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) i keratinocyter [9]. Dessutom framhävdes sådana fenomen i MCF-7-celler och HUVEC [20]; dock har inga studier fokuserat på effekten av mikrogravitation på EMT vid lungcancer. Trots de många avgörande upptäckterna som gjorts om förmågan hos mikrogravitation att modulera tumörframkallande och metastaserande processer av cancer, förblir de exakta mekanismerna som drivs av mikrogravitationsstaden relativt okända, vilket gör öppna frågor angående de adaptiva förändringar som sker på molekylär nivå. I denna studie har vi identifierat en signatur av immunrelaterade gener (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB och CST1) som signifikant uppvisade ökat mRNA-uttryck i A549-celler under effekten av simulerad mikrogravitation (SMG). Dessutom har vi utvärderat bidraget från SMG i A549 cancerprogression via EMT-reglering. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB och CST1 och deras korrelation till EMT-nyckelmarkörer visade en potentiellt mindre metastaserande fenotyp av lungcancer under SMG. Resultaten av denna studie ger en grund för framtida undersökningar som krävs för att identifiera underliggande mekanismer, som kommer att utveckla vår förståelse och stöd i utvecklingen av nya terapeutiska strategier för behandling av lungcancer.

Fördelarna med cistanche tubulosa-Antitumor

2. Resultat

2.1. Bästa vanliga differentiellt uttryckta gener identifierade i lungcancerceller under simulerad mikrogravitation (SMG) jämfört med markgravitation (GG)

För att identifiera gener involverade i lungcancer under simulerad mikrogravitation (SMG), undersökte vi initialt gener som är differentiellt uttryckta under SMG jämfört med markgravitation (GG) för human lungcancer med hjälp av den allmänt tillgängliga Gene Expression Omnibus (GEO) databasen. Två datauppsättningar valdes, GSE78210 och GSE36931, som inkluderar genuttryck för två olika humana lungcancercellinjer, A549 och Colo699, odlade i 2D- och 3D-cellodlingsförhållanden. Skillnader i genetiska uttrycksprofiler mellan SMG- och GG-prover presenterades i vulkanplottar (Figur 1). De identifierade differentiellt uttryckta generna (DEGs; figur 2) för varje datauppsättning delades upp i de som är uppreglerade i lungcancer (21 gener i A549 och 29 gener i Colo699 i GSE78210-datauppsättningen och 47 gener i A549 i GSE36931-datauppsättningen) och de som är nedreglerad lungcancer I (40 gener i A549 och 27 gener Colo699 i GSE78210-datauppsättningen och 87 gener i A549 i GSE36931-datauppsättningen), som representeras i Tabell 1. Tretton DEG uttrycktes signifikant i A549-celler i GSE78290- och GSE73690-datauppsättningarna SMG jämfört med GG-tillståndet. De vanligaste generna identifierades med hjälp av webbverktyget InteractiVienn (Figur 2A). Kandidatgenerna inkluderar AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP och BPIFA1. För att fastställa om de identifierade DEG:erna är inblandade i vanliga vägar, laddades kandidatgenerna upp till Metascape (http://metascape.org; åtkoms den 11 november 2021). Intressant nog är dessa gener berikade i vägar som involverar humoralt immunsvar och reglerad exocytos (Figur 2B).

Figur 1. Vulkanplot som visar differentiellt uttryckta gener (DEG) med GEO Omnibus. (A) Vulkanplot som visar DEGs under SMG- och GG-effekter i A549-celler med hjälp av (A) GSE78210 och (B) GSE36931 dataset. (C) Vulkanplot som visar DEG under SMG- och GG-effekter i Colo699-cellinje med hjälp av GSE78210-datauppsättning. Den röda färgen indikerar uppreglerade gener, medan den blå färgen indikerar nedreglerade gener.

Tabell 1. Totala gener som uttrycks differentiellt vid SMG jämfört med GG i lungcancercellinjerna A549 och Colo699. Varje datauppsättning hade veckändringar justerade för att extrahera de översta 5 % av DEG. För GSE36931 justerades fold change (FC) för att endast inkludera gener med en FC större än eller lika med 4 eller mindre än eller lika med -4. För GSE78210 justerades FC för att endast inkludera gener med en FC större än eller lika med 3 eller mindre än eller lika med -3.

Figur 2. Tretton vanligen delade DEG mellan GSE78210 och GSE36931 dataset i lungcancer. (A) Venn-diagram som visar 134° i GSE36931 (A549-cellinje), 61° i GSE78210 (A549-cellinje) och 56° i GSE78210 (Colo699-cellinje) under SMG-betingelser jämfört med GG. Av de totalt identifierade 251 generna befanns 13 DEG vara gemensamma mellan de två datamängderna, GSE78210 och GSE36931, i A549-cellinjen. Venn-diagram genererades med InteractiVinn.

2.2. De differentiellt uttryckta generna korrelerade med lungadenokarcinompatienters kliniska prognos

De differentiellt uttryckta generna korrelerade med lungadenokarcinompatienters kliniska prognos För att utvärdera det kliniska prognostiska värdet av kandidatgener på patienter med lungadenokarcinom, Kaplan–Meier plotter (http://www.kmplot.com/; tillgänglig den 11 november 2{ {44}}21) användes för att jämföra den totala överlevnaden (OS) för patienter med lungadenokarcinom (LUAD) med hög/mellanliggande kontra låg expression av kandidatgener (Figur 3). Höga mRNA-expressionsnivåer av NOX1 (hazard ratio (HR), 1,45; 95 % konfidensintervall (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR) , 1,74; 95 % KI, 1,33–2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95 % KI, 1,26–2,08; p=0.00014), och BPIFA1 (HR, 1,44; 95 % CI, 1,12–1,84; p=0.0026) observerades vara signifikant associerade med dålig prognos (Figur 3A–D). Å andra sidan var höga mRNA-expressionsnivåer av FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46–0,85; p=0.0026) associerade med bättre prognos och högre total överlevnad hos LUAD-patienter (Figur 3E). Det fanns ingen signifikant korrelation mellan mRNA

Figur 3. FCGBP, CST1, F5, CFB och BPIFB1 korrelerade till lungadenokarcinompatienters kliniska prognos. Kaplan–Meier överlevnadskurvor för mRNA-expressionsnivåerna för kandidatgener: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; och (M) CST1 i lungadenokarcinompatienter. HR: riskkvot.

cistanche tillägg fördelar-Antitumor

Klicka här för att se produkter från Cistanche

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.3. Uttryck av FCGBP, BPIFB1, F5, CFB och CST1 i A549-celler eftersimulerad mikrogravitation

För att validera uttrycket av de in silico identifierade generna (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP och BPIFA1) utfördes in vitro-applikation med qRT-PCR. Intressant nog, med användning av qRT-PCR, visade våra data en signifikant uppreglering av FCGBP mRNA-uttryck, specifikt vid 48 och 72 timmar i A549-celler, efter SMG jämfört med GG (Figur 4A). Dessutom uppreglerades mRNA-uttrycken av CFB, F5 och BPIFB1 signifikant 72 timmar efter SMG, och jämfört med GG, i A549-celler (Figur 4B, C, E). En liten ökning, men inte signifikant, i mRNA-uttryck detekterades för CTS1 under SMG-förhållanden jämfört med GG (Figur 4D). Uttrycken av AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 och TCN1 var obestämda för både SMG och GG (data visas inte).

Figur 4. Uppreglering av FCGBP, CST1, F5, CFB och BPIFB1 under SMG-förhållanden in vitro. mRNA-expressionsnivåer av (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 och (E) BPIFB1, kvantifierade med qRT-PCR och normaliserade till GAPDH i A549-celler utsatta för GG- och SMG-betingelser för 24 , 48 och 72 h. Stapeldiagram visar resultaten av tre oberoende experiment (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 och **** p < 0,0001.

Sammantaget innebär dessa data att de differentiellt uttryckta FCGBP, F5, CFB och BPIFB1 i lungcancer kan spela en viktig roll i lungcancerprogression.

2.4. Simulerad mikrogravitation minskar cellviabilitet och vänder epitel-till-mesenkymal övergång i A549 lungcancercellinje

För att undersöka om SMG påverkar proliferationspotentialen för A549-celler, utfördes en cellviabilitetsanalys med användning av en trypanblått uteslutningsanalys. Våra data visade att SMG signifikant inducerade en tidsberoende minskning av cellproliferation (Figur 5B). Minskningen av cellproliferation var signifikant främst efter 48 och 72 timmar efter SMG jämfört med GG, som visade en ökning i cellproliferation av A549-celler. Parallellt detekterades en förändring i cellulär morfologi i A549-celler under SMG. För att bedöma dessa förändringar togs celler bort från SMG-tillståndet, såddes på 24-brunnsplattor och observerades under ljusmikroskopi efter 1 timmes SMG-applicering. Intressant nog avslöjade celler exponerade för SMG en granulär, klumpad morfologi post-SMG. (Figur 5A).

Figur 5. Simulerad mikrogravitation minskar cellviabiliteten och inducerar morfologiska förändringar i A549-celler på ett tidsberoende sätt. (A) Representativa mikrofotografier av parentala A549-celler (GG) och A549-celler utsatta för SMG i 24, 48 och 72 timmar innan de såddes tillbaka i 1 timme under GG. Bilderna togs med 10X förstoring. (B) Cellviabiliteten för A549-celler bedömdes med användning av trypanblått färgexklusionsanalys. Den genomsnittliga cellviabiliteten för 3 oberoende experiment visas som en procentuell kontroll. **** p < 0.0001. Figur 5. Simulerad mikrogravitation minskar cellviabiliteten och inducerar morfologiska förändringar i A549-celler på ett tidsberoende sätt. (A) Representativa mikrofotografier av parentala A549-celler (GG) och A549-celler utsatta för SMG i 24, 48 och 72 timmar innan de såddes tillbaka i 1 timme under GG. Bilderna togs med 10X förstoring. (B) Cellviabiliteten för A549-celler bedömdes med användning av trypanblått färgexklusionsanalys. Den genomsnittliga cellviabiliteten för 3 oberoende experiment visas som en procentuell kontroll. **** p < 0,0001.

Kinesisk ört cistanche växt-Antitumor

För att förstå de erhållna data om minskad cellulär proliferation i A549 utvärderade vi bidraget från SMG till mekanismen för epitel-till-mesenkymal övergång (EMT). EMT är ett kännetecken och en viktig mekanism som driver cancerprogression och metastasering, vilket förbättrar dess cellmotilitet och invasiva egenskaper [19]. Nyckel-EMT-markörer (E-cadherin, N-cadherin, ZO-1 och snigel) och metalloproteinaser MMP-2 och MMP-9 mRNA-expressionsnivåer mättes med qRT-PCR i A549, under både GG och SMG (Figur 6). Vid SMG-applikation observerades en signifikant ökning av E-cadherin-mRNA-uttryck, parallellt med en signifikant minskning av N-cadherin-mRNA-uttryck, 48 och 72 timmar efter SMG (Figur 6A, B). En icke-signifikant ökning av ZO-1 och MMP-9 och en minskning av snigeltranskriptionsfaktor upptäcktes vid SMG (Figur 6C–E). MMP-2 minskade signifikant i A549 48 timmar efter SMG (Figur 6F), vilket indikerar en mindre invasiv form. Tillsammans stöder dessa data en mesenkymal-epitelial övergång (MET) fenotyp inducerad av SMG i A549.

Bild 6

2.5. Epitel-till-mesenkymal övergångsväg korrelerar med uttrycket av FCGBP, BPIFB1, F5, CFB och CST1

För att få ytterligare mekanistisk insikt i den potentiella rollen för de identifierade generna i A549 och deras möjliga korrelation till EMT under SMG-förhållanden, genomfördes en geninteraktionsanalys med GeneMANIA mot EMT-genmarkörer. Figur 7 visar geninteraktionerna plottade mellan EMT-generna E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Snigel), ZO-1 respektive -catenin. Eftersom metalloproteinaserna MMP-2 och MMP-9 känner till deras betydelsefulla roll i cancerinvasion och migration inkluderades också i analysen. Noderna identifierar samuttrycksmönster mellan generna av varierande styrka baserat på nodens tjocklek. Kandidatgenerna visar en grad av samuttryck mellan varandra; BPIFB1 samuttrycks med CFB och CST1; FCGBP samuttrycks med F5, CST1 och CFB; CST1 samuttrycks med CFB och F5 samuttrycks med CFB, CST1 och BPIFB1. Samuttrycksnoder identifierades också mellan EMT-gener och kandidatgenerna; CDH1 samuttrycks med FCGBP och F5; CDH2 samuttrycks med F5, CST1, BPIFB1 och FCGBP; CTNNB1 samuttrycks med CST1 och FCGBP; SNAI1 samuttrycks med CST1, F5 och BPIFB1; TPJ1 samuttrycks med CST1, FCGBP och F5; CTNNB1 samuttrycks med CST1 och FCGBP; MMP2 samuttrycks med BPIFB1 och CST1; och MMP9 samuttrycks med F5, CST1, FCGBP och CFB. Dessa fynd tyder på en signifikant korrelation mellan de nya identifierade generna och EMT-markörer under SMG-förhållanden, möjligen relaterade till EMT-vägar.

Figur 7. FCGBP, CST1, F5, CFB och BPIFB1 korrelerar med EMT-vägen. Gen-geninteraktionsnätverk av utvalda kandidatgener; FCGBP, CST1, F5, CFB och BPIFB1 med EMT-gener; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 och SNAI1, såväl som cellmigrationsrelaterade gener MMP2 och MMP9 genererade av GeneMANIA (http://genemania.org/; tillgänglig den 11 november 2021) för att identifiera interaktioner mellan kandidatgener med EMT och cellmigreringsmarkörer. Nätverkskantens olika färger indikerar de bioinformatikmetoder som tillämpas: webbplatsförutsägelse (orange), fysiska interaktioner (röd), samuttryck (lila), delade proteindomäner (brun), väg (ljusblå), samlokalisering (mörkt). blå), och genetiska interaktioner (grön)

3. Diskussion

Cistanche te

Diskussion Lungcancer, en av de betydande och globalt hotande sjukdomarna, har nyligen fått mycket uppmärksamhet inom "Rymdforskning". Men trots framstegen inom detta område förblir lungcancerprogression och dess svar på behandling kontroversiella på grund av bristen på definitiva bedömningsstrategier som hjälper till att förebygga eller behandla cancer [21]. Såvitt vi vet är detta den första rapporten som identifierar en uppsättning gener som en signatur för lungcancerprogression under en mekanisk miljö inducerad av simulerad mikrogravitation (SMG). Vi lyfter fram det ökade uttrycket av immunsvarsrelaterade gener FCGBP, BPIFB, F5, CST1 och CFB, och deras korrelation till epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) under SMG, vilket gör dem till potentiella biomarkörer för lungcancerprogression. Häri lyfter vi också fram effekten av inducerad SMG på EMT-reglering, ett kännetecken för cancerprogression [18,22], för att stödja en mesenkymal-till-epitelial övergång (MET) fenotyp. Sammantaget erbjuder denna studie grunden för associeringen av de identifierade generna med EMT; Det krävs dock ytterligare undersökningar för att reda ut de exakta mekanismerna som hjälper till att utveckla ny riktad terapi för lungcancer. I denna studie visade vi tretton gener (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP och BPIFA1) som signifikant uttrycks i lungcancer under simulerad mikrogravitation (SMG) som jämfört med markgravitationen i silico. Våra data visade att dessa differentiellt uttryckta gener är berikade i vägar relaterade huvudsakligen till humoral immunitet och reglerad exocytos. Intresse parallellt med våra fynd, även om huvudfunktionen hos FCGBP fortfarande är oklar [23]. Detta kan delvis bero på de motsägelsefulla rollerna den uppvisar i olika tumörer [25]. Till exempel har det visat sig att FCGBP är signifikant associerat med en bättre övergripande prognos och sjukdomsspecifik överlevnad hos patienter med huvud- och halscancer, tjocktarmscancer och osteosarkom [25–27], medan det i äggstockscancer och prostatacancer, det höga uttrycket av FCGBP var associerat med sämre total överlevnad [28]. Att notera har rollen som FCGBP-rollen tillskrivits immunförsvarsmekanismer, antiinflammatoriska svar, såväl som cellskydd [29,30], vilket gör det till en viktig prognostisk markör [31]. Med hjälp av in vitro-applikationer har vi utvärderat uttrycket av de identifierade generna i lungcancer och under SMG-förhållanden via en 2D-klinostat. Det finns ett brett urval av klinostattyper och andra mikrogravitationsplattformar som har utvecklats. Dessa inkluderar 1/2/3 D klinostatsystem, slumpmässiga positioneringsmaskiner utrustade med glidkolvar (främst för sköldkörtelcancerceller) och NASA-utvecklade roterande väggkärl. Var och en är designad för att tjäna ett visst forskningsmål, där vissa är utformade för att odla vidhäftande eller suspensionsceller, och andra används för onlinemätning av kinetiska svar. Observera att klinostaten är en av de enklaste och mest anpassningsbara plattformarna som används av olika experimentella applikationer. I princip kännetecknas 2D-klinostaten av en rotationsaxel som roterar kontinuerligt med en justerad konstant hastighet och i en riktning som är vinkelrät mot riktningen för jordens gravitationsvektor, vilket skapar centrifugalkrafter som efterliknar verklig mikrogravitation [14,32,33 ]. Intressant nog av de tretton generna, FCGBP-, BPIFB-, F5-, CST1- och CFB-uttrycken ökade signifikant som svar på 2D-klinostatinducerad SMG i A549-celler. Uttrycken av FCGBP och BPIFB var de mest påverkade, och visade en signifikant ökning vid alla bedömda tidpunkter: 24, 48 och 72 timmar efter SMG. I likhet med FCGBP är BPIFB1 känt för att bidra till medfödda immunitetssvar [34]. BPI-vecket innehållande familj B-medlem 1-protein (BPIFB1), som främst produceras av luftvägsepitel, har visat sig delta i värdförsvarsmekanismer, tillsammans med bakteriedödande och antiinflammatoriska effekter [35]. Vid luftvägssjukdomar har BPIFB1 visat sig uppvisa antitumöreffekter och antimetastaserande effekter; dock är de exakta mekanismerna fortfarande oklara, vilket motiverar ytterligare undersökning [34,36]. En studie av Wei et al. fann att BPIFB1 hämmar migration och invasion av nasofarynxkarcinom [37]. Med tanke på det fann man att mutationer som förekommer i BPIFB1 främjar risken för lungcancer, och dess nedreglering leder till dålig prognos hos lungcancerpatienter [38,39]. Förutom rollen för FCGBP och BPIFB, har komplementfaktorn B (CFB) och den chimära tumörsuppressorn 1 (CST1) visat sig ha skyddande roller i cancer. Till exempel rapporterades det att högt uttryck av CFB var associerat med ökad patientövergripande och sjukdomsfri överlevnad hos lungcancerpatienter [40]. Dessutom fungerar komplementsystemet som den första försvarslinjen mot patogener, och fungerar som en viktig komponent i både det medfödda och förvärvade immunsystemet [41]. När det gäller CST1, framhävde olika studier dess intressanta egenskaper, såsom dess förmåga att undertrycka celltillväxt, inducera apoptos och dess motståndskraft mot inaktivering av onkogena former av p53, vilket gör det till ett attraktivt men alternativt terapeutiskt mål för vildtyp p{ {74}}resistenta mänskliga tumörer [42]. Förutom det ökade uttrycket av FCGBP, BPIFB1, F5, CFB och CST1 visade våra data intressant nog två cellrelaterade fenotyper av A549-celler under SMG - en morfologiförändring till aggregat och klumpformade celler och en signifikant minskning av proliferationen betyg efter SMG. Detta är parallellt med vissa andra studier, där celler som exponerades för SMG uppvisade små klumpar eller flerskiktiga cellaggregat [43,44]. Dessa morfologiska skillnader speglas av de åtföljande dramatiska funktionella förändringarna i cellulära processer, varav en del är EMT. EMT är ett kännetecken för den metastatiska processen, associerad med flykten från immunövervakningen och invasionen av kärlsystemet, vilket gör det möjligt för cellerna att spridas till sekundära organ [19,22]. I princip genomgår maligna epitelceller en EMT-mekanism i de primära stadierna av tumörutvecklingen, där dessa celler tenderar att uttrycka mesenkymala egenskaper, uppvisar ökad motilitet som underlättar deras flykt från den primära nischen, medan de metastatiska celler som bildas vid den sekundära sidan visar mindre dedifferentierade egenskaper jämfört med deras motsvarande primära tumörer. Häri är en MET-process (mesenkymal-till-epitelial) en del av en sådan progression av metastaserande tumörbildning. Men det försummar inte deltagandet av EMTs i olika stadier av cancerprogressionen eftersom cancerceller på sekundära platser antingen kommer att fortsätta att växa och föröka sig eller genomgå vila [45,46]. Sådan multipel genkoordination och uppkomsten av specifika migrerande markörer som reglerar den metastatiska progressionen av cancerceller kan resultera i olika resultat vid SMG-exponering [47]. Till exempel, under mikrogravitationsförhållanden, uppvisade olika bröstcancerceller olika morfologier, cellvidhäftning och migrerande egenskaper vid exponering för mikrogravitation [5]. Att notera är det huvudsakliga kännetecknet för EMT förlusten av celladhesionsmolekylen, E-cadherin, vilket påverkar cellernas integritets vila. Å andra sidan leder ökningen av neuralt cadherin, N-cadherin, till celladhesionsförändringar. Detta induceras huvudsakligen av transformerande tillväxtfaktor (TGF-), som aktiverar pleiotropiskt uttryckta transkriptionsfaktorer, såsom Snail, Twist och Zeb-proteiner och andra signalvägar implementerade i metastatiska vägar [18,48,49]. Häri rapporterar vi förbättringen av epitelmarkören E-cadherin (CDH1) och nedregleringen av de mesenkymala N-cadherin (CDH2) mRNA-nivåerna, nyckelmarkörer för EMT [49]. Detta innebär att i kombination med våra data om den minskade proliferationshastigheten av A549, uppvisar cellerna ett mindre metastaserande tillstånd. Intressant nog åtföljdes det förändrade uttrycket av viktiga EMT-markörer också av en signifikant nedreglering av matrismetalloproteinaset MMP-2, som är en huvudkomponent i basalmembranet som normalt separerar epitelskiktet från det omgivande mesenkymet, vilket leder till förlusten av basalmembranet [50]. Detta är parallellt med en studie av Chang et al., där de rapporterade sina fynd om att minska den metastatiska potentialen hos humana lungadenokarcinomceller genom förändring av MMP2-uttryck [17]. I allmänhet har MMP:s roll varit väl inblandad i malignitetsprogression, inklusive metastaser, där ett minskat uttryck av MMP (MMP-2 och MMP-9) och enzymatisk aktivitet är ett kännetecken för en mindre metastaserande fenotyp [ 50–52]. Med den betydande rollen av EMT i metastasering, belyser våra data en signifikant korrelation mellan FCGBP, BPIFB, F5, CST1 och CFB med EMT-genmarkörer såväl som cellmigreringsrelaterade gener MMP2 och MMP9. Intressant nog, Xiong et al. har visat att FCGBP är en huvudregulator av EMT i gallblåsan [53]. Detta betyder att de identifierade generna kan fungera som potentiella biomarkörer för framtida studier som kan förutsäga och ytterligare förstå utvecklingen av lungcancer. Tillsammans klassificerar våra fynd de identifierade generna som nyckelregulatorer för EMT, vilket främjar en potentiell förbättring av en mindre metastaserande fenotyp via en mesenkymal-till-epitelial övergång (MET) av lungcancerceller.

4. Material och metoder

4.1. Datauppsättningar för att identifiera vanliga differentiellt uttryckta gener (DEG) i lungcancercellinjer exponerade för simulerad mikrogravitation

Relevanta datamängder från den allmänt tillgängliga Gene Expression Omnibus-databasen (GEO) extraherades för initial analys. Denna databas används som en allmänt tillgänglig funktionell genomikanalys av genuttrycksdata och mikroarrayer med hög genomströmning. De valda datauppsättningarna uppfyllde följande kriterier: datauppsättningar som endast använde humana lungcancercellinjer, studier som inkluderar matchande kontroller av gravitationsförhållanden (GG), datauppsättningar med definierad klassificering av lungcancercellinjer och datauppsättningar med humana lungcancercellgenuttryck med hjälp av microarray. Två datauppsättningar passar detta kriterium, GSE78210 och GSE36931. Totalt inkluderades 25 prover i studierna och 14 lungcancercellinjeprover i simulerad mikrogravitation (SMG) jämfördes med 11 GG-kontroller, som visas i tabell 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/; åtkoms den 11 november 2021).

Tabell 2. Detaljer om datauppsättningar extraherade från Gene Expression Omnibus (GEO) som används för initial identifiering av DEG mellan simulerad mikrogravitation (SMG) och Ground Gravity (GG) lungcancerceller.

4.2. GEO2R-genuppsättningsanrikningsanalys för att generera DEG i varje datas

GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; åtkoms den 11 november 2021), ett interaktivt onlineverktyg som används för att jämföra GEO-serier, användes i varje datamängd för att gruppera och identifiera uppreglerade och nedreglerade gener i SMG-tillstånd jämfört med GG-tillstånd. Generna med p-värden mindre än 0,05 och flerfaldig förändring större än 2 valdes ut som differentiellt uttryckta gener DEG i SMG-förhållanden. Följaktligen korsade DEG:erna för varje dataset med varandra, och vanliga gener identifierades

4.3. Kvantifiering av klinisk patologisk inblandning av de identifierade generna

Därefter validerades de resulterande kortlistade generna med hjälp av Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com/; tillgänglig den 11 november 2021), en offentlig onlinedatabas som utvärderar effekten av utvalda gener på patientens kliniska resultat. Total överlevnad (OS) definierades som varaktigheten från tidpunkten för diagnos (i månader) till döden. Genuttrycksdata och överlevnadsinformation härrör från Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) och European Genome-phenome Atlas (EGA). Patienterna kategoriserades i två grupper: (1) högt uttryck (med TPM-värden över den övre kvartilen) och (2) lågt/medelhögt uttryck (med TPM-värden under den övre kvartilen). Kaplan-Meier plotter användes för att jämföra OS av lungadenokarcinom (LUAD) patienter med hög/mellanliggande kontra lågt uttryck av kandidatgener.

4.4. Berikad ontologiklustring för de identifierade generna

För att undersöka om de identifierade generna delar gemensamma vägar, utfördes Gene Ontology (GO) pathway anriching-analys för de identifierade generna med hjälp av webbverktyget Metascape (https://metascape.org/; tillgängligt den 11 november 2021) för omfattande genlistkommentarer och analysresurs vid sidan av GEO2R

4.5. Cellinje och cellkultur

Den humana adenokarcinom alveolära basala epitelial (A549) cellinjen, allmänt använd som en modell för lungadenokarcinom, odlades i Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)-1640 medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS; Sigma, St. Louis, MO, USA) och 100 enheter/ml penicillin/streptomycin (P/S; Sigma, St. Louis, MO, USA). Cellinjen odlades i en 37 ◦C fuktad inkubator i en atmosfär av 5 % CO2. När cellerna nådde sammanflöde skördades de med användning av 0,5 % trypsin, centrifugerades vid 100 x g under 5 minuter och användes vid behov.

4.6. Mikrogravitation

Lungcancerceller (A549) odlades i ett 2D-klinostatsystem som efterliknar gravitationsmiljön nära noll (mikrogravitation). Denna Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Houston, TX, USA) är en bioreaktor utrustad med ett cellodlingskärl som innehåller en mikroporös perfusionskärna och ett in-line oxygenatorsystem, som ger näringsämnen och extern gasning av media, därmed säkerställa korrekt gasutbyte och en cellodlingsmiljö med låg skjuvning. Kammaren packades med odlingsmediet innehållande cellerna. Denna kammare roterade horisontellt runt en axel vinkelrät mot tyngdkraften med en hastighet av 10 rpm. 2D-klinostaten placerades inuti den 37 ◦C fuktade inkubatorn i en atmosfär av 5 % CO2. A549-celler skördades postsimulerad mikrogravitation (SMG) vid 24, 48 och 72 timmar. För att skapa en jämförbar lungcancermiljö odlades A549-celler i odlingsplattor vid GG, i ett icke-roterat eller statiskt tillstånd, och hölls i närheten av enheten inuti den fuktade inkubatorn (37 ◦C). Dessa celler hänvisas till som kontrollgruppen och skördades också vid 24, 48 och 72 timmar.

4.7. Cellviabilitetsanalys

För GG-förhållandena såddes A549-celler i 24-brunnscellodlingsplattor med en densitet av 3.0 × 104 celler per 500 µL. Celler skördades genom trypsinisering vid 24, 48 och 72 timmar efter sådd och centrifugerades sedan vid 200 x g under 5 minuter. Erhållna cellpellets rekonstituerades i odlingsmedia. För SMG-förhållandena såddes A549-celler i det roterande 2D-klinostatsystemet vid en densitet av 6,0 × 104 celler per 1 ml. Celler skördades vid 24, 48 och 72 timmar efter SMG-exponering och centrifugerades sedan vid 200 x g under 5 minuter. Erhållna cellpellets rekonstituerades i odlingsmedia. Trypanblått (Sigma, USA) färgexklusionsanalys utfördes. Cellantal bestämdes med användning av CellDrop™ Automated Cell Counter.

4.8. Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR)

Genuttrycksnivåer (mRNA-nivåer) av de i silico identifierade generna (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP och BPIFA1) tillsammans med EMT-genmarkörer (tabell 3) bestämdes också i A549-celler med qRT-PCR. Kortfattat utfördes extraktion av totalt RNA från celler med användning av RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) vid 24, 48 och 72 timmar vid GG och efter exponering för SMG genom att följa tillverkarens protokoll. En µg totalt RNA omvänt transkriberades till ett enkelsträngat komplementärt DNA (cDNA) i en 20 µL reaktionsvolym med användning av ett iScript™ cDNA-synteskit (Thermo, Waltham, MA, USA). qRT-PCR utfördes med hjälp av PowerUp™ Sybr™ Green mastermix (Thermo, USA) i en Quant Studio 5 pcr-maskin (Thermo, USA). PCR-amplifieringssteg var som följer: ett initialt denatureringssteg vid 95 ◦C under 3 minuter, en hybridiseringstemperatur för målgenen i 30 s och sedan 72 ◦C i 30 s. Fluorescenströskelcykelvärdet erhölls för varje gen. ∆∆Cq-metoden användes för att beräkna den relativa förändringen i genuttryck efter normalisering till hushållsgenen, Glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH).

Tabell 3. Lista över humana primers. NOXl, NADPH Oxidas 1; GDA, guanindeaminas; TCN1, transkobalamin 1; FCGBP, Fc gammabindande protein; BPIFA1, BPI-vik som innehåller familj A-medlem 1; AZGP1, alfa-2-glykoprotein 1; CFB, komplementfaktor B; VTCN1, V-set-domän innehållande T-cellaktiveringsinhibitor 1; AGR3, främre gradient 3; CTS1, chimär tumörsuppressor 1; F5, koagulationsfaktor V; CEACAM6, CEA celladhesionsmolekyl 6; BPIFB1, BPI-veck innehållande familj B medlem 1; ZO-1, Zonula occludens protein 1; MMP-9, matrismetalloproteinas 9; MMP-2, matrismetalloproteinas 2; och GAPDH, Glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas

4.9. Analys av gen-geninteraktion

Data från in vitro qRT-PCR implementerades i gen-geninteraktionsanalys med hjälp av in silico webbverktyg GeneMANIA (http://genemania.org/; tillgänglig den 11 november 2021), en nätverksalgoritm för att förutsäga genfunktioner med hjälp av en stor uppsättning av funktionella associationsdata. Detta utfördes för att ytterligare utvärdera interaktioner mellan/bland de utvalda kandidatgenerna; FCGBP, CST1, F5, CFB och BPIFB1 med EMT-gener; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 och SNAI1, såväl som cellmigreringsrelaterade gener, MMP2 och MMP9.

4.10. Statistisk analys

GraphPad Prism programvara användes för att utföra statistisk analys. Resultaten uttrycks som individuella data eller som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Elevens t-test användes för att jämföra olika grupper. Skillnader mellan grupper bedömdes med envägs ANOVA av varians (ANOVA). p-värden bestämdes och värdena på p < 0.05, p < 0.01, p < 0,001 (*, ** respektive ***) var anses vara betydande. Alla experiment utfördes i tre exemplar (n=3).

Referenser

1. White, RJ; Averner, MJN Människor i rymden. Nature 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]

2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modellering av effekterna av mikrogravitation på cellulär nivå: Implikationer för mänskliga sjukdomar. Främre. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]

3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Integrativ analys av regulatorisk modul avslöjar associationer av mikrogravitation med dysfunktioner i multikroppssystem och tumörbildning. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]

4. Crucian, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; et al. Immunsystemets dysreglering under rymdfärd: Potentiella motåtgärder för djupa rymdutforskningsuppdrag. Främre. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]

5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Bröstcancerceller i mikrogravitation: Nya aspekter för cancerforskning. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]

6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Skydd mot neurodegenerativ sjukdom på jorden och i rymden. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]

7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Verklig mikrogravitation påverkar cytoskelettet och fokala vidhäftningar i mänskliga bröstcancerceller. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]

8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Apoptosinduktion och förändring av cellvidhäftning i mänskliga lungcancerceller under simulerad mikrogravitation. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]

9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Mikrogravitation inducerar övergående EMT i humana keratinocyter genom tidig nedreglering av E-cadherin och celladhesionsremodellering. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]

10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Son, KH; Lee, JW Simulerad mikrogravitation med flytande miljö främjar migration av icke-småcellig lungcancer. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]

11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Lungcancerstamceller förlorar sin stamness standardtillstånd efter exponering för mikrogravitation. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]

12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; et al. Simulerad viktlöshet förändrar cytoskelettet och extracellulära matrisproteiner i papillära sköldkörtelkarcinomceller. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, J.; Mikrogravitation, L. Tumörceller i mikrogravitation. In Into Space: A Journey of How Humans Adapt and Live in Microgravity; IntechOpen: London, Storbritannien, 2018; Volym 139, s. 259–268.

14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Kampen mot cancer genom mikrogravitation: Den flercelliga sfäroiden som en metastasmodell. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]

15. Schabath, MB; Cote, ML Cancerframsteg och prioriteringar: Lungcancer. Cancerepidemiol. Biomark. Föreg. 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]

16. Chung, JH; Ahn, CB; Son, KH; Yi, E.; Son, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Simulerade mikrogravitationseffekter på icke-småcellig lungcancercellproliferation och migration. Aerosp. Med. Brum. Prestera. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]

17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Li, T.; et al. Simulerad mikrogravitation förändrar den metastatiska potentialen hos en human lungadenokarcinomcellinje. Vitr. Cell. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]

18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Kännetecknande för cancer: nästa generation. Cell 2011, 144, 646–674. [CrossRef]

19. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Epitelial-mesenkymal övergång i cancer: En historisk översikt. Transl. Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]

20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT-transkriptionsfaktorer är involverade i den förändrade celladhesionen under simulerad mikrogravitationseffekt eller överbelastning genom reglering av E-cadherin. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]

21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrogravitation, stamceller och cancer: Ett nytt hopp för cancerbehandling. Stamceller Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]

22. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Epitel-mesenkymal övergång: Ett kännetecken i metastasbildning som länkar cirkulerande tumörceller och cancerstamceller. Patobiologi 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]

23. Yan, T.; Tian, ​​D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Ja, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP är en prognostisk biomarkör och associerad med immuninfiltration i gliom. Främre. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]