SLC37A2, en fosforrelaterad molekyl ökar i släta muskelceller i den förkalkade aorma

Vaskulär förkalkningär en viktig källa tillhjärt-kärlsjukdomhos patienter med kronisk njursjukdom.Hyperfosfatemileder till ökat intracellulärt fosforinflöde, vilket leder till en ökning av osteoblastliknande celler i de vaskulära glatta muskelcellerna. PiT-1 transporterar fosfat i vaskulära glatta muskelceller. Mekanismen för vaskulär förkalkning är dock inte helt klarlagd. Denna studie undersökte andra kandidatfosforrelaterade molekyler än PiT-1. Vi antog att fosforrelaterade molekyler som tillhörlöst ämne(SLC) superfamilj skulle vara involverad i vaskulär förkalkning. Som ett resultat av DNA-mikroarrayanalys fokuserade vi på SLC37A2 och visade att mRNA-uttryck av dessa celler ökade på förkalkade glatta muskelceller i aorta (AoSMC). SLC37A2 har rapporterats transportera både glukos-6-fosfat/fosfat och fosfat/fosfatutbyte. In vitro-analys visade att SLC37A2-uttryck inte påverkades av inflammation på AoSMC. Expressionen av SLC37A2 mRNA och protein ökade i förkalkat AoSMC. In vivo visade analys att SLC37A2 mRNA uttryck i aorta avkronisk njursjukdområttor var korrelerade med osteogena markörgener. Vidare uttrycktes SLC37A2 i det vaskulära förkalkningsområdet iråttor med kronisk njursjukdom. Som ett resultat visade vi att SLC37A2 är en av molekylerna som ökar medvaskulär förkalkningin vitro och in vivo.

Nyckelord: SLC37A2,vaskulär förkalkning, glatta muskelceller i aorta,kronisk njursjukdom, hyperfosfatemi

KLICKA HÄR FÖR ATT FÅ NATURLIGT EKOLOGISKT CISTANCHE-EXTRAKT MED 25% ECHINACOSIDE OCH 9% ACTEOSIDE FÖR NJURFUNKTION

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Som antalet patienter medkronisk njursjukdom(CKD) ökar, antalet patientersom kräver dialyskommer att öka också. De flesta dödsfall hos patienter som genomgårdialysberor påhjärt-kärlsjukdomarTill exempelhjärtfel, cerebrovaskulära störningareller hjärtinfarkt. (,2) En stor källa tillhjärt-kärlsjukdomär ektopisk förkalkning,() en abnormitet som orsakas av bildning och avsättning av kalciumfosfatkristaller i mjuka vävnader. (4 6) Olika faktorer som inflammation. oxidativ stress, och ökningar av plasmakalcium (Ca) och fosfor (P) nivåer är involverade i progressionen av vaskulär förkalkning. Bland dessa faktorer är hyperfosfatemi starkast förknippad med vaskulär förkalkning. (7.8) Hyperfosfatemi orsakas av för högt intag av P i närvaro av nedsatt njurfunktion. Därför måste patienter som genomgår dialys begränsa intaget av P. (79-12). Det har dock rapporterats attvaskulär förkalkningpågår redan när dialys påbörjas; det har också setts hos patienter med CKD i tidigt stadium när hyperfosfatemi inte är uppenbar. (3) Följaktligen är det viktigt att förhindra vaskulär förkalkning hos patienter med CKD i tidigt stadium för att förbättra livsprognosen.

vilket leder till ett ökat inflöde av P till vaskulära glatta muskelceller (VSMC). P-inflöde utförs via PiT-1, en transportör på cellmembranytan av VSMC. PiT- är en medlem av superfamiljen solute-carrier (SLC), som inkluderar en natriumfosfattransportör kodad av SLC20A1.04 PiT- transporterar fosfat över Na-beroende cellmembran och därefter matrismineralisering på grund av förhöjda p-nivåer.s) Som intracellulärt P-nivåer ökar, VSMC börjar uttrycka osteogena transkriptionsfaktorer, såsom runt-relaterad transkriptionsfaktor 2(Runx2)(16) Denna effekt följs av ökat uttryck av osteoblastspecifika gener, såsom osteopontin och osteokalcin. Dessutom minskade uttrycket av glattmuskelspecifika proteiner. såsom glatt muskelprotein 22-0 (SM22-0), förekommer. Som ett resultat omvandlas VSMC till osteoblastliknande celler. (1718) Nyligen genomförda kliniska studier har visat att blodnivåer av kalcium. proteinpartiklar (CPP), som representerar kolloidala kalciumfosfatpartiklar, ökar med minskande njurfunktion. (19-21)Dessutom har korrelationer med CPP- och P-nivåer i blodet rapporterats.2o2i) Det är möjligt att CpP kan utlösa progressionen av vaskulär förkalkning.22-24)

Vaskulär förkalkning har dock observerats hos patienter med CKD i tidigt stadium med normala plasma P-nivåer. (13) Dessutom uttrycks PiT-1 mRNA överallt i alla vävnader. En annan molekyl kan således verka primärt inom området för vaskulär förkalkning. Det finns rapporter om detinflammationfrämjar vaskulär förkalkning. Inflammatoriska faktorer som interleukin (IL)-1B, IL-6 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-a) inducerade differentiering av VSMC till osteoblastliknande celler(2s26) TNF-a inducerar vaskulär förkalkning genom cAMP-vägen, som spelar en roll vid osteoblastdifferentiering.2728) IL-6 reglerar olika vägar som leder till vaskulär förkalkning av VSMC2-31) Dessutom. IllB, IL-6 och TNF-a är också faktorer associerade med ökad vaskulär förkalkning inducerad av höga p-nivåer.3233) Emellertid. aktuella data förklarar inte helt mekanismen för vaskulär

förkalkning inducerad av dessa faktorer. Vi antog att det kan finnas andra P-relaterade molekyler som de i SLC-superfamiljen, involverade i vaskulär förkalkning. Vi fokuserade på membranproteiner i SLC-superfamiljen och undersökte potentiella kandidat-P-relaterade molekyler andra än PiT-1 för inblandning i vaskulär förkalkning. Vidare undersökte vi förhållandet mellan kandidatmolekyler och vaskulär förkalkning i video och in vivo.

Material och metoder

Cell kultur. Normala humanaortamuskelceller (AoSMC) erhölls från Lonza (Basel, Schweiz). AoSMC odlades enligt tillverkarens instruktioner. AoSMC bibehölls i ett tillväxtmedium (slätmuskelcellbasalt medium kompletterat med 5 % fetalt bovint serum (FBS), epidermal tillväxtfaktor, insulin, fibroblasttillväxtfaktor-B och gentamicin/amfotericin-B). Media byttes varannan dag. AoSMC odlades i en fuktad 5% CO-inkubator vid 37 grader och hölls tills sammanflöde nåddes och användes sedan i experiment.

Kalcifierad AoSMC. Förkalkning av AoSMC inducerades såsom beskrivits tidigare.435) AOSMC odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 15 % FBS och penicillin-streptomycin och odlades med 2,6 mM P under 3, 6, 9, 12 och 14 dagar. P-koncentrationen justerades med P-bufferten NaH, PO/Na och HPO. pH 7,2). Andra AoSMCs odlades inte med 2,6 mM P.

DNA mikroarray. Totalt RNA från AoSMC-prover odlade och inte odlade med 2,6 mM P användes. Totalt RNA 5.0 ug analyserades med användning av en DNA-mikroarray (Agilent Technologies, Tokyo, Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray användes för att undersöka cirka 26,000 gener. Förhållandet beräknades genom att dividera expressionsnivån för AoSMC odlad med 2,6 mM under 12 dagar med expressionsnivån för AoSMC icke-odlad med 2,6 mM P

DNA mikroarray

Totalt RNA från AoSMC-prover odlade och inte odlade med 2,6 mM P användes. Totalt RNA 5.0 ug analyserades med användning av en DNA-mikroarray (Agilent Technologies, Tokyo, Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray användes för att undersöka cirka 26,000 gener. Förhållandet beräknades genom att dividera expressionsnivån på AoSMC odlad med 2,6 mM under 12 dagar med expressionsnivån på AoSMC icke-odlad med 2,6 mM P.Expression av SLC37A2 vid vaskulär inflammation. För att inducera ett inflammatoriskt svar i AoSMC odlades celler med tillväxtmedium tills de nådde sammanflöde och behandlades sedan med 1 ugmL lipopolysackarider (LPS) (LPS från escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) i 24 och 72 utan 2,6 mM P. Andra AoSMC odlades inte med realtidsanalys av polymeraskedjereaktion (PCR). Totalt RNA extraherades från AoSMC behandlad med LPS under 24 och 72 timmar och celler som inte behandlades med LPS. SYBR grönbaserad kvantitativ realtids-PCR utfördes med hjälp av syntetiserat cDNA och en lämplig primeruppsättning för varje målgen med aStepOnePlus realtids-PCR-system (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Primersekvenserna var följande: human IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' och 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; human SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' och 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- och 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 och SLC37A2 mRNA-expressionsnivåer beräknades efter normalisering av SLC-califierat med SLC2cAuttryck med GAPLC37. AoSMC. Totalt extraherades från AoSMC som inte odlats med 2,6 mM P och AoSMC-celler odlade med 2,6 mM P under 3, 6, 9, 12 och 14 dagar. Realtids-PCR utfördes med användning av det syntetiserade cDNA:t. Primersekvenserna var som följer: human Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' och 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3 Runx2- och SLC37A2-mRNA-uttrycksnivåerna beräknades efter normalisering med APPH.

Western blotting-analys.

Totalt protein samlades in från AoSMC-prover odlade under samma förhållanden som användes för realtids-PCR-analys. Dessa prover lyserades med användning av Tris-buffrad saltlösning (pH 75) kompletterad med 5 % NP-40 och en 1 % proteashämmarecocktail. Proteinkoncentrationsproven mättes med användning av BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific. Waltham, MA). och koncentrationen justerades genom western blotting, separerades 10 ug protein i en 10% polyakrylamidgel med användning av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Membranet behandlades med SLC37A2-antikropp (Novus Biologicals, Centennial, CO) eller GAPDH-antikropp (GeneTex, Irvine, CA) som de primära antikropparna, inkuberade med Rabbit lgG Pepparrotsperoxidas-konjugerad antikropp (R&D Systems, Minneapolis, MN) som sekundär antikropp. och visualiseras med Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, England) och självlysande bildanalysator (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Japan). Bandet kvantifierades med användning av lmagel.

Experimentell

Alla studieprotokoll godkändes av den etiska kommittén vid University of Hyogo, School of Human Science and Environment. Tolv veckor gamla Sprague-Dawley-råttor av hankön köptes från Japan SLC (Shizuoka, Japan). Råttorna hölls på en 12-ljus, 12-h mörk cykel (09:00-21:00) och gav fri tillgång till mat och extra rent vatten.

Experimentdieterna inkluderar en kontroll-P-diet (1,0% P, 0.6Ca, 20% protein), en adenin-diet (0,75% adenin , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% protein), en låg-P (LP) diet (0.2% P,0 ,6 % Ca, 10%protein) och en kost med högt P (HP) (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % protein) baserad på AIN93-G-dieten (orientalisk Jäst, Tokyo, Japan) med kasein som proteinkälla.3637) En lågproteindiet har rapporterats främja vaskulär förkalkning hos råttor med adenin-inducerad njursvikt, så proteinrestriktion utfördes.3738)Innan gruppering, alla råttor (n)=23) matades med en vanlig MF-diet (orientalisk jäst) i en vecka för att acklimatisera sig. Vid 13 veckors ålder delades råttor in i 2 grupper: kontrollgruppen (n=5) och den adenininducerade CKD-gruppen (n=18). Kontrollgruppen fick kontroll P-dieten i 6 veckor . Den adenin-inducerade CKD-gruppen fick adenin-dieten i cirka 3 veckor och delades sedan upp ytterligare i 2 undergrupper: CKD-LP-gruppen (n=8) eller CKDHP-gruppen (n=10). Råttor i CKD-LP-gruppen och CKD-HP-gruppen fick LP-dieten och HP-dieten under 3 veckor, respektive under experimentperioden, födointaget registrerades dagligen. Under adenin-dieten togs blodprover från svansvenen mellan kl. 10:00 och kl. 11:00 en gång i veckan fram till den andra veckan, och därefter en gång varannan dag för att övervaka plasmanivåerna. Under LP-dieten eller HP-dieten togs blodprov en gång i veckan. Urinprover togs och urinvolymen registrerades en gång i veckan. Råttor avlivades med bedövningsmedel med användning av isofluran (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) och laparotomier. Blodprov tagna från vena cava inferior och thoracoabdominal aorta samlades in för analys.

SLC37A2 uttryck på aorta.

Ungefär en tredjedel av den uppsamlade thoracoabdominala aortan användes för att visualisera förkalkning och utföra immunfärgning. Aortan bäddades in i paraffin och 4-um-sektioner skars. Sektioner färgades med användning av en Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences. Warrington, PA) enligt tillverkarens instruktioner. immunfärgningsanalys utfördes med seriesnitt. Sektionerna inkuberades med SLC37A2-antikropp över natten vid 4 grader och behandlades sedan med Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter behandlades sektioner med ett DAB-substratkit (Nichirei).

Totalt RNA extraherades från resten av den frusna thoracoabdominala aortan. Realtids-PCR utfördes med användning av det syntetiserade cDNA:t. Primersekvenserna var följande: osteo-pontin från råtta, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' och 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' och; råtta SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' och 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Uttrycksnivåerna för osteopontin mRNA och SLC37A2 mRNA beräknades efter normalisering med GAPDH

Statistisk analys.

Data presenteras som medelvärde + SE. Skillnader mellan grupper analyserades med hjälp av t-testet. I fosfatinducerade förkalkade AoSMC-experiment analyserades skillnader med en enkelriktad variansanalys följt av Dunnetts metod. I CKD-modellexperimenten analyserades skillnader med användning av K ruskal-Wallis-testet följt av Steel-Dwass-metoden. Korrelationskoefficienter (rs) bestämdes med användning av Spearmans korrelationskoefficient rank test. För alla tester. tvåsidiga p-värden<0.05 were considered statistically significant.