Liten men mäktig – exosomer, nya intercellulära budbärare i neurodegeneration del 1

Enkel sammanfattning:

Exosomer är biologiska nanopartiklar som nyligen erkänts som intercellulära budbärare. De innehåller en mängd lipider, proteiner och RNA. De kan överföra sitt innehåll till inte bara celler i närheten utan även till celler på avstånd.

Exosomer är ett nyupptäckt intercellulärt kommunikationsverktyg som kan frigöra små och ömtåliga vesiklar till omgivande celler, leverera vissa proteiner, signalsubstanser och andra ämnen till omgivande celler. Dessa ämnen kan hjälpa celler att ändra sitt tillstånd och till och med påverka tillväxten, utvecklingen, ämnesomsättningen och andra aspekter av andra celler. Under de senaste åren har studier visat att exosomer spelar en viktig roll för människans hjärnfunktion, särskilt för att upprätthålla och förbättra minnet.

För det första kan exosomer främja signalöverföring mellan neuroner. Informationsöverföring mellan neuroner är en av de nödvändiga förutsättningarna för normal drift av nervsystemet, och exosomer spelar rollen som budbärare, vilket kan göra informationsöverföringen mellan neuroner smidigare och därigenom förbättra hjärnans kognition och minne.

För det andra kan exosomer också reglera metabolismen av neuroner. I processen med att neuroner producerar och frigör exosomer är ett stort antal metaboliska processer involverade, vilket främjar balansen och regleringen av cellmetabolismen. Dessa processer kan inte bara förbättra neuronernas förmåga utan också hjälpa till att ta bort metabolt avfall och skadliga molekyler och hålla hjärncellerna friska.

Slutligen kan exosomer också hjälpa neuroner att reparera skador. Många proteiner och nukleinsyror som bärs av exosomer är fördelaktiga för celltillväxt, reparation och regenerering, och kan främja reparation och regenerering av neuroner, och därigenom förbättra överlevnadsförmågan hos hjärnceller och stärka minnescentra och kognitiva förmågor.

Sammanfattningsvis finns det ett nära samband mellan exosomer och minne. Vi kan förändra barns minne genom att börja med kosten. Att aktivt vägleda barns koststruktur och äta mer mat som är rik på nyttiga ingredienser som fettsyror, proteiner och vitaminer kan främja produktionen och frisättningen av exosomer och därigenom hjälpa barn att förbättra sin inlärnings- och minnesförmåga. Barn kan också få några spel och övningar för hjärnträning för att utmana och träna sitt tänkande, stimulera exosomes potential och spela en bättre roll. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av Cistanche kommer från de olika aktiva ingredienserna den innehåller, inklusive garvsyra, polysackarider, flavonoidglykosider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa på många sätt.

Klicka på Vet för att förbättra korttidsminnet

Denna unika förmåga ger dem möjlighet att modulera mottagarcellernas fysiologi. I hjärnan spelar exosomer en roll vid neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros.

Abstrakt:

Exosomer av endosomalt ursprung är en klass av extracellulära vesiklar som är viktiga i intercellulär kommunikation. Exosomer frisätts av alla celler i vår kropp och deras last som består av lipider, proteiner och nukleinsyror har ett fotavtryck som reflekterar deras ursprung.

Den exosomala lasten har kraften att modulera fysiologin hos mottagarceller i närheten av de frigörande cellerna eller cellerna på avstånd. Utnyttjande av exosomers potential beror på renheten hos exosomberedningen.

Därför har många metoder för isolering utvecklats och vi ger en kortfattad sammanfattning av flera metoder. Trots den avskildhet som påtvingas av blod-hjärnbarriären, är celler i CNS inte immuna mot exosomal påträngande påverkan. Både neuroner och gliareleaser exosomer, ofta på ett aktivitetsberoende sätt.

En kort beskrivning av exosomer som frisätts av olika celler i hjärnan och deras roll för att upprätthålla CNS-homeostas ges. Kännetecknet för flera neurodegenerativa sjukdomar är ackumuleringen av proteinaggregat. Nyligen genomförda studier implicerar exosomes intercellulära kommunikatörsroll i spridningen av felveckade proteiner och säger att patologi sprids.

I denna recension diskuterar vi de potentiella bidragen från exosomer i utvecklingen av Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros.

Att förstå bidrag från exosomer i patogenesen av neurodegeneration öppnar fältet för att använda exosomer som terapeutiska medel för läkemedelstillförsel till hjärnan eftersom exosomer passerar blod-hjärnbarriären.

Nyckelord: exosomer; neuroner; gliaceller; centrala nervsystemet (CNS); neurodegenerativa sjukdomar;Alzheimers sjukdom; Parkinsons sjukdom; amyotrofisk lateralskleros.

1. Inledning och historiskt perspektiv

Intercellulär kommunikation är av stort intresse för embryonal utveckling, regenerering/ersättning av epitel, gametogenes och underhåll av homeostas.

Flera mekanismer för cell-cellkommunikation såsom endocytos/exocytos och uppslukande utskjutande cytoplasmatiska blåsor identifierades med hjälp av ultrastrukturella och biokemiska studier [1-3]. En annan spelare, extracellulära vesiklar, identifierades men deras roll i intercellulär kommunikation uppskattades inte omedelbart [4].

Extracellulära vesiklar upptäcktes serendipitalt under en undersökning av frisättningen av plasmamembranassocierade enzymer, ekto-ATPas och ekto-50-nukleotidas i ett cellodlingsmedium. 1981 odlade Tramsands medarbetare normala och neoplastiska cellinjer av mus- och mänskligt ursprung i ett serumfritt medium eftersom serum var känt för att ha katalytisk aktivitet av ATPas och 50-nukleotidas.

Efter avlägsnande av flytande celler och skräp centrifugerades det konditionerade mediet med en hastighet av 310,000× g under 90 minuter i en Spinco Ti-70-rotor och pelletsen undersöktes under elektronmikroskop. Två populationer av extracellulära membranhöljda vesiklar upptäcktes, en med en medeldiameter mellan 500 och 1000 nm och en andra, mindre population med en diameter på ~40 nm.

Dessa vesiklar, som ursprungligen beskrevs som "exfolierade vesiklar" av författare, innehöll både 50-50-nukleotidas- och ATPas-enzymatisk aktivitet. Dessutom innehöll de exfolierade vesiklarna RNA och fosfolipider som skilde sig från modercellerna respektive moderplasmamembranet.

Inkubation av exfolierade vesiklar från C6-gliomceller med 32P-förmärkta neuroblastomceller stimulerade defosforylering av neuroblastomproteiner med samtidig frisättning av fri radiomärkt fosfor (32P).

Dessa data fastställde att de exfolierade vesiklerna inte bara var bärare av cellulärt avfall (enzymer) utan hade en fysiologisk funktion. Tram och kollegor myntade termen exosomer för att beskriva de "exfolierade vesiklerna" [5] (se artikel av [6] för extracellulär vesikelhistoria före 1981). Några år senare studerade två forskningsgrupper oberoende transferrinreceptorns öde i retikulocyter genom elektronmikroskopi [7–9].

Mognande retikulocyter kräver inte transferrin så de förlorar transferrinreceptorer. Båda grupperna observerade att odlade retikulocyter släppte små vesiklar med ~50 nm i diameter i det extracellulära utrymmet.

Dessa små vesiklar innehöll onedbrutna transferrinreceptorer. 1987 använde Johnston och hans medarbetare termen exosomer för att beskriva små vesiklar som innehåller transferrinreceptorer [10]. Efter dessa första år realiserades potentialen för exosomer som nya intercellulära budbärare som kan modulera målcellers fysiologi.

Intressant nog initieras uppkomsten av exosomer med endocytos (en process som identifierades 1883; granskad av [3]) i celler och exosomfrisättning till intracellulärt utrymme använder processen för exocytos. Sedan deras första upptäckt vet vi nu att exosomer är en subtyp av extracellulära vesiklar av endocytiskt ursprung med ett storleksintervall på 40–160 nm i diameter [11].

Spårstudier visade att makromolekyler endocytoseras i borstbelagda (dvs. klatrinbelagda) invaginationer eller gropar på cellytan. Dessa invaginationer separerar så småningom från plasmamembranet och detekteras i cytoplasman.

Efter att ha förlorat borst (dvs. klatrin), blir endocytoserade belagda vesiklar släta och smälter samman med tidiga endosomer för antingen återvinning snabbt tillbaka till cellytan (återvinning av endosomer i figur 1) [12] eller genomgå maturering för att bilda sena endosomer.

Tidiga och sena endosomer fungerar som "sorteringsnav" för att på lämpligt sätt styra deras innehåll: (i) för retrograd transport till trans-Golgi-nätverket (dvs endosom-till-TGN-hämtning) [13,14]; (ii) till lysosomer för nedbrytning av makromolekyler till enkla produkter för återanvändning inom cellen [15,16]; och/eller (iii) för återvinning till cellytan genom multivesikulära kroppar [17].

Under mognaden av tidiga endosomer som gör intlat endosomer, genomgår det inre endosommembranet invagination, vilket resulterar i bildandet av intraluminala vesiklar (nu betecknade som exosomer). Specifika makromolekyler såsom cytosoliska proteiner, nukleinsyror och lipider sorteras i utvecklande exosomer.

Sena endosomer packade med exosomer identifieras som multivesikulära kroppar som migrerar mot plasmamembranet. Vid fusion med plasmamembranet frigör multivesikulära kroppar exosomer i det extracellulära utrymmet genom exocytosprocessen (Figur 1) [18,19]. En stor delmängd av proteiner som rekryteras sekventiellt spelar en avgörande roll i processen för endocytos till tidiga endosomer, endosommognad till lateendosomer och deras efterföljande intracellulära öde (granskas av [17,18,20]).

Vikten av dessa proteiner framhävs av deras förlust och/eller mutation(er) som orsakar olika sjukdomar. Till exempel är Strumpellin- och SWIP-proteiner en del av WASH-komplexet som deltar i aktinpolymerisation, såväl som endosomklyvning och sortering. Mutationer i Strumpellin-genen orsakar ärftlig spastisk paraplegi, kännetecknad av degeneration av motorneuroner [21].

En enda punktmutation (Pro1019Arg) i SWIP-proteinet destabiliserar WASH-komplexet. Det destabiliserade WASH-komplexet hämmar endolysosomal trafficking, vilket orsakar klumpar av endosomer. Defekt endosomal trafik påverkar kognition och motorneuronfunktion, med symtom som beskrivs som icke-syndromisk mental retardation [22,23].

I cytoplasman härstammar exosomer från endosomer med hjälp av de endosomala sorteringskomplexen som krävs för transport (ESCRT), även känd som den ESCRT-beroende mekanismen för exosombiogenes (reviderad av [18,20]).

Två grupper rapporterade oberoende av varandra lipidmedierad biogenes av exosomer, en ESCRT-oberoende mekanism. Två lipider som identifierades i dessa studier var bis(monoacylglycero)fosfat/lysobisfosfatidinsyra (BMP/LBPA) och ceramid [29,30].

Rab31 är en annan ESCRT-oberoende mekanism för exosom biogenes i cytoplasman. Aktivering av Rab31 stimulerar bildandet av intraluminala vesiklar [31]. Det finns en annan mekanism som för närvarande är underdiskuterad och underutforskad.

Denna mekanism är baserad på ultrastrukturella observationer som gjordes i slutet av 1950-talet till 1970-talet som visade att cellkärnor kan vara en plats för ursprunget till multivesikulära kroppar packade med små vesiklar. Små vesiklar som beskrivs i dessa studier var kanske exosomer men termen exosom myntades inte vid den tiden. Kilarski och Jasinski observerade en process som kallas nukleär blebbing eller nukleär extrudering i celler i simblåsan hos abborrfisken Perca fluviatilis L. (Figur 2a) [24] med innehåll som liknar nukleolarkaryoplasm [32].

Dessa författare noterade att nukleär blåsbildning kan stimuleras genom att gas avlägsnas från abborrfiskens simblåsa [24]. Processen med nukleär blebbing verkar ha merit som ursprungsplatsen för exosomer berikade med nukleinsyror och/orribonukleoprotein.

Kärnblåsor fylldes med små vesiklar som uppstod från enkelveckningar av det inre membranet i kärnblåsorna (Figur 2b), en process som liknar bildandet av intraluminala vesiklar i endosomer. Nukleära blåsor fyllda med "små vesiklar" separerade så småningom från kärnor för att bli en del av cytoplasman (Figur 2c).

Kilarski och Jasinski hänvisade till nukleära blebs som multivesikulära kroppar i sitt manuskript på grund av bristen på bättre terminologi. Oavsiktligt kan dessa författare ha haft rätt eftersom efterföljande studier rapporterade närvaron av multivesikulära kroppar i cellkärnor [33]. Kärnbubblorna fyllda med små vesiklar har en morfologi som liknar multivesikulära kroppar som härrör från endosomer i cytoplasman (figur 1 och 2).

På grund av likheten mellan nukleära multivesikulära kroppar med viral nukleokapsid, fokuserade forskare sin uppmärksamhet på virologi och fenomenet nukleär blebbing och dess cellulära funktion förblev underutforskade [34].

Oavsett sätt för biogenes, är exosomer sammansatta av alipiddubbelskikt och innehåller makromolekylärt innehåll bestående av lipider, proteiner och nukleicasyror.

Några av makromolekylerna är gemensamma för exosomer som kommer från alla celler och klassificeras därför som exosommarkörer och används som ett bekräftande verktyg för att skilja exosomer från andra extracellulära vesiklar. Unika makromolekyler som finns i exosomesoften återspeglar deras föräldraursprung och kommer därför sannolikt att betecknas som biomarkör(er).

Alla celler släpper exosomer till det extracellulära utrymmet. Från det extracellulära utrymmet hittar exosomer in i olika biologiska vätskor och når celler lokalt och på avstånd. Celler odlade in vitro frisätter sina exosomer till odlingsmedier. Kontinuerlig frisättning av exosomer i det extracellulära utrymmet gör odlingsmedium och biologiska vätskor till en rik källa för isolering av exosomer.

Exosomer innehåller en betydande mängd kodande och icke-kodande RNA, dubbelsträngade genomiska DNA-fragment och mitokondrie-DNA. Spårvagnar och kollegor var de första som beskrev närvaron av RNA i "exfolierade vesiklar", en blandning av exosomer och mikrovesiklar.

De fastställde att "exfolierade vesiklar eller exosomer" innehåller 5% RNA [5]. Valadi och kollegor var de första som systematiskt analyserade RNA-paketerade inexosomer. De exosomala RNA:n inkluderade translaterbara mRNA:n och mikroRNA:n (miRs) [35].

MikroRNA är en klass av icke-kodande RNA (ncRNA). De är ~22 nukleotider långa och reglerar genuttryck på post-transkriptionell nivå genom att binda till 30-otranslaterade regioner av deras målbudbärar-RNA [36]. Intressant är att vissa miRNA berikade med exosomer inte detekteras i modercellerna, vilket tyder på ett selektivt RNA-sortering/förpackningssystem under biogenes av exosomer [35,37].

Till skillnad från celler innehåller exosomer lite eller inget ribosomalt RNA men innehåller tRNA-fragment [38]. Sortering av RNA i exosomer beror på (1) RNA-inducerat tystande komplex (RISC)-associerat protein, (2) RNA-sekvensmotiv och guideproteiner, (3) nukleotidtillägg i den 30:e änden av miRNA, (4) cellulär tillgänglighet av miRNA, och (5) ceramid [39,40].

Vi tror att nukleär blebbing är en annan cellulär process som tillåter differentiell sortering av RNA, RNA-proteinkomplex och genomiskt DNA till exosomer. Det finns flera skäl till denna synpunkt: (1) innehållet i "intraluminala vesiklar" liknade nukleolär karyoplasma [32]. "vesiklar" i nukleära multitivsikulära kroppar (MVB II) berikades med RNA, sura och basiska proteiner, och därför ansåg författaren " intraluminala vesiklar som platsen för RNA-syntes utöver tonukleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin exosomer [43–47].

För övrigt upptäcktes genomiskt DNA endast i exosomer som härrör från cancercellinjer och inte normala celler [47]. Cancerceller har onormalt kromatin på grund av kromatinomläggning/translokation och kanske ploidi [48] som kan orsaka genomisk DNA-fragmentering i cancercellskärnor. Dessa DNA-fragment kan lätt inkorporeras i MVB typ II (och exosomer) som utvecklas i kärnorna. (3) Metoden för "små vesikel"-biogenes i nukleära blåsor som beskrivs av Kilarski och Jasinski [24] liknar bildandet av intraluminala vesiklar i sena endosomer i cytoplasman.

Vi tror starkt på att närvaron av genomiskt DNA i exosomer är patologisk och därför kan dess närvaro i exosomer användas som ett diagnostiskt verktyg för utveckling av onormala (eller cancer) celler i kroppen. (4) Den aktivitetsberoende ökningen av antalet exosomer som frigörs av celler [49] är jämförbar med gasceller som visade ökad nukleär blåsbildning vid avlägsnande av gas från simblåsan hos abborrefiskar [24].

På senare tid upptäcktes mitokondriella proteiner och DNA i plasmaexosomer hos vissa cancerpatienter, och deras närvaro är associerad med cancerns aggressivitet [50,51].

Mitokondriell nedbrytning observeras ofta i degenererande celler [52,53]. Mitokondriella kristaller som frigörs från de degenererande mitokondrierna kan internaliseras av multivesikulära kroppar och förpackas så småningom inexosomer.

Denna uppfattning stöds av ultrastrukturella bilder av mänskliga lymfoblastoidceller och lumen av acini i babianprostatan som hade "mikrovesiklar" (eller exosomer) som härrörde från nedbrytningen av mitokondriernas kristae [54].

Baserat på ovanstående diskussion och stödjande experimentella bevis, föreslår vi att exosomers heterogena natur härrör från biogenes av multivesikulära kroppar och associerade exosomer på olika subcellulära platser och inte helt i cytoplasman enligt vår nuvarande övertygelse. Vårt förslag kan förklara heterogeniteten hos exosomer såväl som en missmatchning mellan teoretiska beräkningar och experimentella data om antalet små RNA eller proteinmolekyler som finns i en exosom renad från serum [55].

Baserat på teoretiska beräkningar med hjälp av genomsnittlig exosomstorlek, förutspådde Li och kollegor att varje exosom skulle rymma cirka 70–25,000 små RNA- eller proteinmolekyler.

Men deras experimentella data visade närvaron av en RNA-molekyl per exosom renat från serum [55]. Vår hypotes kräver ytterligare utforskning av nukleär blebbing, nukleära multivesikulära kroppar och biogenesen av RNA/ribonukleoprotein-innehållande exosomer innukleära multivesikulära kroppar. Lipider är en viktig del av exosommembran och är fördelade asymmetriskt mellan de två exosombladens membran. Lipidsammansättningen skiljer sig mellan modercellmembranet och exosommembranet.

I allmänhet är lipider anrikade i exosomemembraner sfingomyelin, ceramid, kolesterol och kolesterolrika lipidflottemikrodomäner, gangliosid GM3, omättade lipider och fosfatidylserin [56–58]. Exosomala proteiner består av de som är gemensamma för de flesta exosomer och unika proteiner. till en viss föräldracell.

Proteininnehållet i alla exosomer är i allmänhet berikat för mål- och fusionsproteiner såsom tetraspaniner, integriner, chaperoneproteiner, t.ex. värmechockproteiner (Hsp60, Hsp70 och Hsp90), de små HSP-membranhandelsproteinerna, Rab-proteiner, ARF GTPaser, annexiner och proteiner involverade i bildandet av multivesikulära kroppar som ALIX och TSG101 [59].

Nyare studier tyder på närvaron av RNA-bindande proteiner som bildar RNA-proteinkomplex i exosomer [38]. Flera cellulära processer som säkerställer uppladdning av proteiner till exosomer är (1) ESCRT-mekanismer för proteiner med vissa post-translationella modifieringar såsom ubiquitination, Wnt-stimulerad argininmetylering, oxidation, fosforylering, glykosylering och citrullinering; (2) chaperone-medierad autophagy (CMA) som bygger på interaktionen mellan värmechock besläktad 71 kDa protein (HSC70) och proteiner med ett KFERQmotiv.

Efter bindning av HSC70 till proteiner med ett KFERQ-motiv riktas proteiner mot multivesikulära kroppar. Chaperone-medierad autofagi verkar normalt för nedbrytning av proteiner i lysosomer. Nyare data tyder på att CMA spelar en roll i exosomfrisättning och exosommedierad spridning av proteinaggregat i vissa neurodegenerativa sjukdomar [60-63].

Det har skett en exponentiell ökning av exosomforskning sedan 1990-talet och mycket data om exosomal last har genererats. Databaser har skapats för att tillhandahålla ett kompendium av exosomal last innan det blir för svårt att hantera stora datamängder.

Repeterbarheten av publicerade data om exosomer är en annan anledning eftersom de flesta laboratorier använder varianter av olika metoder utvecklade för att isolera exosomer. Till exempel är Vesiclepedia ett manuellt sammanställt kompendium av molekylär last (lipid, RNA och protein) identifierat i olika klasser av extracellulära vesiklar [64]. Vesiclepedia är en värdefull resurs för forskare.

Databasen Vesiclepedia är allmänt tillgänglig och tillåter användare att fråga och ladda ner exosom lastdata baserat på användarinmatade sökkriterier. EV pedia, Exocarta, ExoRbase och EV miRNA är ytterligare databaser som katalogiserar exosomalproteiner och RNA [64].

Databaserna drivs av community-kommentarer. Datakurerade i dessa databaser erhålls genom att isolera exosomer med användning av en mängd olika separationstekniker som inte ingår i databasen.

Exosomal lastinnehåll kan därför skilja sig beroende på vilken isoleringsmetod som används, vilket ger upphov till en viss grad av tvetydighet i rapporterade resultat. För att förbättra experimentell reproducerbarhet och transparens utvecklades en kunskapsbas EV-TRACK med öppen källkod. EV-TRACK omfattar data om exosomberedning och exosomkarakterisering [65].

En nyckelfunktion hos EV-TRACK är EV-METRIC som presenterar rapporteringen av experimentella parametrar som en procentandel av uppfyllda komponenter i en lista med nio [66]. Dessa komponenter beslutades av EVTRACK-konsortiet och ansågs nödvändiga för entydig datatolkning och produktion av experimentella data. Således var EV-METRIC utformad för att hjälpa forskare och granskare att ge en heltäckande översikt över data.

2. Aktuella metoder för exosomisolering

Exosomer utgör en rik resurs för upptäckt av biomarkörer och för nya terapeutiska strategier inklusive regenerativ medicin. Avgörande för framgången för dessa mål är isoleringen av rena exosomer via en reproducerbar metod.

Isolering av funktionellt kompetenta exosomer är särskilt kritisk för potentiella terapeutiska tillämpningar. Exosomer har renats från olika biologiska vätskor såsom blod, plasma, cerebrospinalvätska, saliv, urin och mjölk. Varje biologisk vätska har olika fysikaliska och kemiska egenskaper som måste beaktas innan exosomisolering.

I vissa fall kan särskilda försiktighetsåtgärder vara nödvändiga för exosomisolering. Slutappliceringen av renade exosomer är en annan bestämningsfaktor som påverkar metoden för exosomisolering.

Hittills har flera exosomisoleringsmetoder utvecklats och några av dem är baserade på exosomegenskaper som deras storlek, densitet, ytladdning och proteiner associerade med exosomens yta (Figur 3) [67].

Några av de för närvarande använda exosomisoleringsmetoderna listas i tabell 1. De flesta av dem är inte fristående metoder och kräver tidigare bearbetningssteg efter provet. Framträdande metoder diskuteras kort nedan.

Figur 3. Vanligt använda metoder för exosomisolering och deras nedströmsapplikationer. Flera metoder som hittills utvecklats för exosomisolering är baserade på deras flyttäthet, Schema 1, 13 och 1,19 g/ml, ultracentrifugeringsmetoden (UC) förfinades ytterligare för att isolera rena preparat av exosomer baserat på deras flyttäthet genom isopyknisk ultracentrifugering översackaros eller jodixanol densitetsgradient (DG).

För att ta bort högt proteininnehåll i proteinuri kombinerades ultracentrifugeringsmetoden med storleksexklusionskromatografi (SEC). Tidsbegränsningar förknippade med ultracentrifugeringsmetoden ledde till utvecklingen av filtreringsmetoden (UF).

Att passera utspädda prover såsom odlingsmedium och urin genom en nano- eller mikromembrankoncentrator möjliggjorde exosomrening. Membrantäppning och dålig exosomal proteinåtervinning gjorde den här metoden impopulär för nedströmsapplikationer som RNA-isolering och applikationer med hög genomströmning.

En annan metod utvecklad för att isolera exosomer från mycket utspädd biologisk fluidis hydrostatisk filtreringsdialys (HFD *) i kombination med centrifugering. I HFD-metoden dialyseras provet genom ett dialysmembran med en cutoff på 1000 kDa molekylvikt under hydrostatiskt tryck, vilket gör att oönskade makromolekyler kan avlägsnas från provet och exosomer återvinns genom centrifugering.

Exosomutfällningsmetoden baserad på löslighet eller dispergerbarhet och aggregering utvecklades för att behandla flera prover samtidigt. Kommersiella kit för exosomrening är baserade på denna strategi.

I denna metod blandas urinorascites med polyetylenglykol (PEG) 6000 eller i kombination med protamin (plus PEG35 000) och inkuberas antingen över natten eller 1 timme på is.

Den resulterande grumliga blandningen centrifugeras för att återvinna exosomer som används för nedströms RNA- och proteinanalyser. Andra reagenser som används för exosomerfällning är (1) 0.1M natriumacetat pH 4.75 (utsaltning) (NaAc), (2) en 4-faldig volym kall aceton (−20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation och förkortas PROSPR), (3) och en blandning av PEG och dextranlösning (upp till 1,5%) (en tvåfasmetod som tillåter separation av proteiner från exosomer).

Identifiering av exosomala ytproteiner ledde till utvecklingen av immunoaffinitetsfångningsbaserade metoder med användning av antikroppar mot exosoma ytproteiner såsom Tim4, annexin, EpCAM, vanligt exosom ytprotein, CD63 och värmechockproteiner (affinitetsinteraktion). Affinitet för lektin (som binder till glykoproteiner på ytan av exosomer) och heparin (som binder till heparansulfatproteoglykaner på exosomytan) utnyttjades för att utveckla exosomisoleringsmetoder.

Flera plattformar såsom magnetiska pärlor, mycket porösa monolitiska kiseldioxid-mikrotoppar, yta på plastplattor, cellulosafilter, membranaffinitetsfilter, en agarosesorbent och mikrofluidiska enheter användes för affinitetsbaserade exosomreningsmetoder och de har olika fördelar för deras användning i diagnostiska, prognostiska, som läkemedelstillförselsystem och forexosomal lastdetektering och analyser.

Anpassad med tillstånd från Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Isolering av extracellulära vesiklar: Allmänna metoder och senaste trender. Biomed Res Int. 2018 30 januari; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Copyright © 2022 Maria Yu. Konosjenko et al.

Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och produktion i vilket medium som helst, förutsatt att originalverket är korrekt citerat [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com