Spenat Metanolextrakt dämpar näthinnedegenerationen hos diabetesråttor
Jun 22, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Abstrakt:Det har föreslagits att spenat metanoliskt extrakt (SME) hämmar bildandet av avancerade glykeringsslutprodukter (AGEs), som ökar under diabetesprogression, så det är viktigt att veta om små och medelstora företag har gynnsamma effekter på den diabetiska näthinnan. I denna studie visade in vitro-analyser att SME hämmar glykering, karbonylgruppsbildning och reducerad tiolgruppsutarmning i bovint serumalbumin inkuberat antingen reducerande sockerarter eller metylglyoxal. SME-effekten i näthinnan hos streptozotocin-inducerade diabetiska råttor (STZ2) studerades också (n=10) i den normoglykemiska gruppen, STZ, STZ-råttor behandlade med SME och STZ-råttor behandlade med aminoguanidin (anti-AGEs referens grupp) under 12 veckor. Näthinnan sektionerades och immunfärgades för Ne-karboximetyllysin (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS), 3-nitrotyrosin (NT), nukleär NF-kB, vaskulär endoteltillväxtfaktor ( VEGF), gliafibrillärt surt protein (GFAP), S100B-protein och TUNEL-analys. Lipidperoxidation bestämdes i hela näthinnan genom malondialdehyd (MDA) nivåer. Resultaten visade att i den diabetiska näthinnan minskade SME CML-RAGE samlokalisering, oxidativ stress (NOX4,iNOS,NT,MDA), inflammation (NF-B,VEGF,S10B, GFAP) och apoptos (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">
Nyckelord:spenat; diabetisk retinopati; avancerade glykeringsslutprodukter; oxidativ stress; inflammation; RASA; karboximetyl L-lysin
1. Introduktion
Växtbaserad kost har associerats med en lägre risk att utveckla kroniska sjukdomar som fetma, typ 2-diabetes och kranskärlssjukdom. Spenat (Spinacia oleracea L.) är en ätbar bladgrönsak som konsumeras över hela världen på grund av att den tillhandahåller en avsevärd mängd fibrer, vitaminer och mineraler [1,2]. Flera av dess fytokemikalier har identifierats, inklusive klorofyller, karotenoider (lutein och zeaxantin) [3], och fenoliska föreningar (flavoner, flavonoider, kumariner) [4-8] (se tillägg 1). Det har rapporterats att spenat, när det intas som livsmedel, vattenlösligt extrakt eller i frystorkad form, och dess tylakoider har anti-cancer, anti-fetma och hypoglykemiska egenskaper [9]. Den antiinflammatoriska effekten av spenat har visats i endotoxemimodeller hos djur, överviktiga djur och friska människor [9]. Dess antioxidanteffekt studerades i humana prostatakarcinomceller, djurmodeller med fetma, UV-bestrålade möss och adenokarcinom i den transgena musprostatan [9,10]. De antiglykerings- och antiinflammatoriska effekterna av spenatmetanolextrakt (SME) har studerats i modellen för glukosinducerad diabetes hos zebrafisk respektive isoproterenol-inducerad myokardnekros hos råttor [11,12]. SME minskade nivåerna av glykosylerat hemoglobin och fruktosamin, inklusive nivåerna av glykosylerat protein, genom att minska aldosreduktasaktiviteten i linsens ögon [11]. Ovanstående resultat tyder på att små och medelstora företag kan ha en förebyggande effekt på utvecklingen av diabetes mellitus-komplikationer såsom diabetisk retinopati (DR).
DR leder progressivt till förlust av synskärpa eller blindhet som har varit relaterad till inflammation, oxidativ stress och ackumulering av avancerade glykeringsslutprodukter (AGE) [13,14]. AGEs inducerar proteintvärbindning, förändrar struktur/funktion och dess omsättning/clearning. AGEs kan produceras av en icke-enzymreaktion mellan glukos med en fri aminogrupp av proteiner, vilket bildar reversibla intermediärer som Schiffs baser och Amadori-produkter (fruktosamin)[15]. Andra mekanismer för AGE-bildning inkluderar "karbonylstress"-vägen, där oxidation av sockerarter och lipider skapar dikarbonylmellanprodukter såsom glyoxal och metylglyoxal (MGO), vilket leder till AGE-bildning som N:-karboximetyllysin (CML)[ 16]. Ökade CML-nivåer i serum och glaskropp kan vara en biokemisk markör för både utseende och progression av DR [17,18]. I näthinnan inducerar aktiveringen av receptor RAGE av AGEs (AGEs-RAGE) överuttrycket av gliafibrillärt surt protein (GFAP) och pro-inflammatoriska faktorer, reglerade av den nu-clear faktorn kappa-lättkedjeförstärkaren av aktiverat B celler (NF-kB)[19]. NF-kB reglerar RAGE-uttrycket positivt genom att fungera som en positiv återkopplingsmekanism [20].vad är cistancheÅ andra sidan kan höga koncentrationer av S100B, ett kalciumbindande protein, också aktivera NF-kB, vilket inducerar neuroinflammation och gliacellsaktivering [21]. Överuttrycket av S100B i astrocyter provocerar neurotoxiska effekter som manifesteras av retinal astroglios [22].
Cistanche kan anti-aging
Strategier har utvecklats experimentellt för att förhindra skador på näthinnan. Vissa fytokemikalier av spenat isolerade från andra växter har associerats med hämning av AGE och oxidativ stress [8,23-26]. Lutein, astaxantin och kaempferol har skyddat mänskligt härledda retinala pigmentepitelceller (ARPE-19) från skador genom deras anti-AGEs, antioxidant- och anti-apoptosegenskaper [26-28]. Dessa resultat tyder på att spenats fytokemikalier har en relevant roll i förebyggandet av retinal degeneration som DR. En annan strategi har varit att använda aminoguanidin (AG) som en potent hämmare av glykering och iNOS-aktivitet, vilket dämpar CML-ackumuleringen och bildandet av reaktiva dikarbonyliska prekursorer hos råttor [29]. Men i en multicentrisk och randomiserad klinisk prövning med 690 diabetespatienter fastställdes inte den gynnsamma effekten tydligt [30].
Förändringarna i retinal degeneration under hyperglykemiska tillstånd har knappast studerats. Därför är det intressant att veta om SME skyddar näthinnans lager från skador relaterade till dess anti-AGEs, antioxidanter och antiinflammatoriska egenskaper i näthinnan hos streptozotocin-inducerade diabetiska råttor.
2. Material och metoder
2.1. Beredning av metanolextraktet av spenat (SME)
De färska bladen av spenat (S.oleracea L.) skördades under höst-vintersäsongen i ett jordbruksfält i Puebla-provinsen, Mexiko, och identifierades av en botaniker i herbariet på The National Polytechnic Institute (IPN, Mexico City, Mexiko). Verifikationsexemplar nummer 4532 deponerades i herbariet vid National School of Biological Sciences of IPN.
Bladen var uttorkade och finmalda. De torkade bladen macererades med metanol vid rumstemperatur, filtrerades genom cellulosafilter (Whatman, Maidstone, Storbritannien) och torkades med en roterande vakuumindunstare (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Schweiz) vid 45 grader till ge ett grönt gummi (95,0 g/kg torra löv).Anti-aging cistancheSME förvarades mörkt vid 4 grader fram till användning. För alla analyser rekonstituerades extraktet i destillerat vatten[11].
2.2. In vitro-analyser av anti-glykeringsaktivitet för små och medelstora företag
2.2.1. Bildning av avancerade glykeringsslutprodukter härledda från bovint serumalbumin (BSA-AGEs)
BSA-AGEs-analysen utfördes, som beskrivits tidigare [31]. Kortfattat tillsattes 10 mg/mL BSA (fraktion V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) antingen i D-glukos 0.5 M, D-fruktos {{12 }},5 M, eller metylglyoxal 2,5 mM, och tillverkad i en lösning 0.1 M PBS (pH 7,4) och 0,02 procent natriumazid. SME-koncentrationer (5, 10, 25, 50, 100 och 200 mg/ml) sattes till varje blandning och inkuberades sedan vid 37 grader i 4 veckor. Efteråt avlägsnades de oreagerade sockerarterna genom dialys mot destillerat vatten under två dagar vid 4 grader. BSA-AGE-nivåer bestämdes med fluorescensspektrofotometri (Ex370/Em 440 nm; modell LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Storbritannien)[32]. Glykeringen av BSA-protein genom reducerande sockerarter och MGO var en positiv kontroll (BSA glycated), medan inkubationen av BSA glycated med aminoguanidin (1 mg/ml) användes som negativ kontroll (BSA glycated-AG). Analyserna utfördes i triplikat.
2.2.2. Fruktosaminanalys
Fruktosaminnivån bestämdes med nitroblått tetrazolium (NBT)-analysen [33], som är baserad på fruktosamins förmåga att reducera NBT och bilda formazan, en färgad slutprodukt under alkaliska förhållanden. Tio mikroliter av någon av kontrollerna eller glykerade BSA-inkuberade SME-koncentrationer (BSA-SME) sattes till 90 μL NBT vid 2,5 mM, framställd i en karbonatbuffert (0,1 M; pH 10,3); alla inkuberades vid 37 grader C under 30 min. Absorbansen vid 530 nm mättes. Fruktosaminkoncentrationer (nmol/mg) beräknades enligt en standardkurva för formazan.
2.2.3. Bestämning av bildning av karbonylgrupper och utarmning av tiolgrupper i BSA-AGE
Koncentrationen av karbonylgrupper mättes i BSA-SME och kontrollprover, enligt Levine et al. [34]. En lösning av 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH;10 mM) i 400 μL 2,5 M HCl sattes till 100 μL varje prov och inkuberades i mörker i 60 minuter vid rumstemperatur.cistanche benefíciosSedan tillsattes 500 μL triklorättiksyra (20 % w/v) och hölls på is i 5 minuter. Proverna centrifugerades vid 4 000 rpm i 15 minuter och proteinpelleten tvättades tre gånger med etylacetat/etanol (1:1 v/v). Efteråt suspenderades proverna i 250 μL guanidinhydroklorid till 6 M. Koncentrationen av karbonylgrupper (nmol/mg protein) beräknades genom spektrofotometri vid 370 nm absorbans (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) med användning av absorptionskoefficient för DNPH (22 000 M-1 cm-1).
Enligt Ellmans metod utfördes bestämningen av tiolgruppsutarmning i BSA-SME och kontrollprover. Kortfattat inkuberades 10 μL 5,5'-disulfandiylbis（2-nitrobensoesyra）（DNTB;10 mM, framställt i PBS） med 50 μL glykerade prover i 15 minuter vid rumstemperatur, sedan mättes absorbansen vid 410 nm. Nivån av fria tiolgrupper beräknades med hjälp av en standardkurva av L-cystein (0.4-11 μM) och uttryckt i nmol/mg protein [34].
2.3. Effekt av små och medelstora företag på näthinnan hos diabetesråttor 2.3.1. Diabetesinduktion hos råttor
Wistar-hanråttor som vägde 250±10 gr(N=40) fastade i 8 timmar användes. En intraperitoneal dos av streptozotocin (60 mg/kg) i citratbuffert (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) administrerades [35]. Tre dagar senare mättes glukosnivån (glukometer; ACCU-CHEK aktiv; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland) genom att ta en droppe av ett blodprov från svansen. Djur med glykemiska nivåer högre än 350 mg/dL rekryterades för studien. Glukosen i blodet mättes varje vecka under 12 veckor.
2.3.2. Experimentell design
De streptozotocininducerade diabetiska råttorna (STZ) delades slumpmässigt in i följande grupper (n =10): STZ behandlad intragastriskt med 2 ml dricksvatten (STZ); STZ behandlad med SME vid 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykemiska råttor (NG); och STZ behandlad med 50 mg/kg aminoguanidin (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG användes som en anti-AGE referensgrupp. De tilldelade doserna administrerades var 24:e timme (09:00) under 12 veckor. Den glykemiska nivån i alla grupper övervakades varje vecka. SME-doseringsregimen vid 400 mg/kg baserades på följande: 7 g SME erhålls från 100 g färsk spenat (data visas ej). Denna mängd motsvarar den dagliga konsumtionen av en genomsnittlig person på 70 kg i den amerikanska kosten [36], vilket motsvarar 100 mg extrakt/kg kroppsvikt.Cistanche Extrakt Anti StrålningÅ andra sidan, på grund av skillnaden i den accelererade metabolismen hos råttor, rekommenderas det att öka konsumtionen av något naturligt extrakt upp till 6,4 gånger för jämförelsestudier med människor [37]. Dosen på 400 mg/kg som vi använde baserades huvudsakligen på resultaten erhållna i en modell av myokardnekros inducerad hos Wistar-råttor, som visade att den antiinflammatoriska effekten av SME är mer signifikant vid 300 mg/kg [12].
2.3.3. Histologiska och immunhistokemiska utvärderingar
Enucleated ögon fixerades i neutralt formalin och dehydratiserades sedan i graderade alkoholer och inbäddades i paraffin. Histologiska sektioner på 2 μm monterades på elektroladdade objektglas, avvaxade och rehydrerades upp till antigenåtervinningslösning (K035; 10 × citratbuffert, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Ett polymerbaserat immunodetektionssystem (PolyVuemous/kanin DAB-detektionssystem, Diagnostic BioSystems) användes. Följande primära antikroppar användes: gliafibrillärt surt protein (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); vaskulär endoteltillväxt faktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kalciumbindande protein B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, Storbritannien) , och nukleär faktor kappa-lättkedjeförstärkare av aktiverade B-celler (anti-NF-kB p65;sc-8008). Alla spädningar var vid 1:200 och inkuberades över natten vid 4 grader. En sekundär antikropp (Mouse/Rabbit PolyVueTM) tillsattes enligt leverantörens instruktioner.cistanche herbaSektioner färgades med DAB plus/kromogensubstrat och hematoxylin. Histologiska observationer och infångning av bilder utfördes i ett Carl Zeiss-mikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).
För immunfluorescensfärgning inkuberades objektglasen över natten vid 4 grader C med följande primära antikroppar: karboximetyllysin (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, Storbritannien), AGE-receptor (anti-RAGE; sc-365154), NADPH-oxidas 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosin (anti-NT; ab110282) och kväveoxidsyntas (inducerbar)(anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Därefter användes följande sekundära antikroppar: för anti-RAGE, get-anti-mus-IgG(FITC)-konjugerad (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); för anti-CML och anti-NT, mus anti-kanin IgG-PE (SC-3753); och för anti-iNOS och anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Alla inkuberades vid rumstemperatur under 60 min. Därefter monterades sektioner i ett medium innehållande 4',6-Diamidine-2'-fenylindoldihydroklorid (DAPI). Anti-CML- och anti-RAGE-antikroppar samhybridiserades i samma objektglas. FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA) användes för fluorescensbilder.
2.3.4. Apoptosutvärdering
Apoptos av retinala celler detekterades enligt manualen som beskrivs av terminal deoxinukleotidyltransferas(TdT)-medierad deoxiuridintrifosfat (dUTP) nick-end-märkning (TUNEL) analys med användning av In Situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamine{{ 3}}dUTP) röd, version 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Kortfattat rehydrerades de avvaxade objektglasen och sköljdes två gånger med PBS. Sedan inkuberades de med TUNEL-reaktionsblandningen i en fuktad atmosfär i 60 minuter vid 37 C. Därefter monterades sektioner med DAPI och observerades i fluorescensmikroskopi (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD för TUNEL beräknades för näthinneskikt.
2.3.5. Lipidperoxidationsanalys
För utvärdering av malondialdehydnivåer (MDA) i näthinnevävnaden homogeniserades cirka 3 mg färsk vävnad (n=3) och bearbetades som tidigare rapporterats [38]. MDA-nivåer kvantifierades enligt kitleverantörens instruktioner (OXItek-TBARS analyskit, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).
2.4.Statistisk analys
För statistisk analys togs alla näthinnemikrofotografier med en magnitud av 200× vid 100 μm bortom synnerven. Ungefär 40 bilder per grupp av djur (n=7) analyserades. Bildanalys utfördes med programvaran Image-Pro Premier version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Vi använde GraphPad Prism programvara (La Jolla, CA, USA; version 8.0). Figurerna visar värden grafiska i ruta-och-whisker-diagram (median, första-tredje kvartilen, lägsta-maximivärde) för ganglioncellskiktet (GCL), inre kärnskiktet (INL) och yttre kärnskiktet (ONL). Medelvärdet och standardavvikelsen (medelvärde ± SD) visas i Appendix A (tabell A1-A3). I samtliga fall utfördes ett envägs ANOVA-test följt av Tukeys test. sid<0.05 was="" considered="" statistically="">
