Strukturell karakterisering av cistanche deserticola polysackarid och dess skyddande effekt på hög glukosinducerad HK -2 Cellskada

1.2.5.8 Detektion av mitokondriell membranpotential

HK -2 Celler ympades i 6- brunnsplattor och odlades. Efter motsvarande stimulering sugs odlingsmediet i 6- brunnplattorna och en stark positiv kontrollgrupp (POS) tillsattes till gruppen under "1.2.5.6". Skölj en gång med PBS, tillsätt 1 ml cellodlingsmedium och 1 ml JC -1 färgning av arbetslösningen blandades noggrant och placerades i en cellkulturinkubator i mörkret under 20 minuter. Cellerna tvättades två gånger med JC -1 färgningsbuffert (1 x) och bilder samlades med användning av ett fluorescensmikroskop.

 

 

 

 

Cistanche -fördelar

 

1.2.5.9 Hoechst33258 Metod för att upptäcka cellapoptos

Cellglaserna placerades i 6- brunnsplattor, och hk -2 celler i den logaritmiska tillväxtfasen ympades i 6- brunnsplattor vid en celltäthet av 1 × 105 celler/brunn. Efter motsvarande läkemedelsintervention användes HOECHST33258 -färgningssatsen för färgning. Cellapoptos detekterades och bilder samlades med användning av ett fluorescensmikroskop.

 

1.2.5.10 Western blotting för att upptäcka

Uttrycket av proteiner relaterade till TLR4/NF-KB-signalvägen analyserades genom gruppering och behandling av cellerna enligt metoden under "1.2.5.6". Därefter extraherades det totala proteinet i cellerna enligt instruktionerna från proteinekstraktionssatsen. Proteinkvantifiering utfördes med användning av Bicinchoninic Acid (BCA) proteinkvantifieringsmetod, och proteinet denaturerades och lagrades i ett kylskåp i ett -20.
10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), polyvinylidenfluorid (PVDF) membranöverföring, lägg membranet i Tris-innehållande Tween -20 buffert
Cellerna inkuberades i en Tris -buffrad saltlösning med Tween -20 (TBST) kammare och blockerades vid rumstemperatur. Primära antikroppar mot TLR4, NF-KB p65, p-NF-kB p65 och -aktin var vana vidupptäcka njurvävnaden(Antikroppar utspäddes till TBST -lösning vid ett volymförhållande av 1: 2000) vid 4 grader över natten. Tbst
Membranet späddes med sekundär antikropp (antikropp och TBST -lösning utspäddes vid ett volymförhållande av 1: 2000) och inkuberades vid rumstemperatur under 1 timme. Efter tvätt av membranet 3 gånger med TBST tillsattes ECL -självlysande reagens för detektion, och proteinuttryck detekterades genom gelavbildning. Image J -programvara användes för att analysera proteinet gråskalavärde, med -aktin som den interna referensen.

1.3 Databehandling

SPSS 23. 0 och GraphPad Prism 6.01 Programvara användes för dataanalys. Shapiro-Wilk-test användes för att testa normaliteten i provdata, och Brown-Forsythe eller Bartletts test användes för att testa homogeniteten i variansen i provdata. Mätdata med normalfördelning och homogenitet av varians uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse. (x ± s) indikerar beskrivning, envägs ANOVA användes för testning och Dunnetts metod användes för parvis jämförelse om statistiskt signifikant.
För parvis jämförelser efter hoc användes ojämlika variationer användes Dunnetts T3 -metod, med p <0. 0 5 indikerar en statistiskt signifikant skillnad, och p <0,01 indikerar en signifikant skillnad mellan de två grupperna.

2 resultat och analys

2.1 Bestämning av totalt socker, uronsyra och proteininnehåll i CDP: er

Den linjära regressionsekvationen för polysackaridinnehåll var: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Experimentet visade att mellan 7 och 70 ug/ml fanns det ett bra linjärt samband mellan standardglukoskoncentrationen (X) och absorbansvärdet (Y). Den beräknade andelen polysackaridinnehåll i provet är: 81,02%.
Den linjära regressionsekvationen för standard uronsyra är: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Experimentet visade att mellan 20 och 100 ug/ml fanns det ett bra linjärt samband mellan standardtonsyrakoncentrationen (X) och absorbansvärdet (Y). Uronsyrainnehållet i provet är: 4,43%.
Standardproteinlinjär regressionsekvation är: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Experimentet visade att mellan 20 och 1 00 µg/ml fanns det ett bra linjärt samband mellan standardproteinkoncentrationen (X) och absorbansvärdet (Y). Proteininnehållet i provet är: 4,00%.

 

2.2 Molekylviktsfördelning av CDP: er

Molekylvikten för CDP: er bestämdes av högpresterande gelgenomträngande kromatografi tandemkolonndetektering. Med RT som (x) och lgmp som (y) beräknades ekvationen för LGMP-RT-kalibreringskurva som: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; Rt är (x), lgmw är (y), LGMW-RT-kalibreringskurvan är: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; Rt är (x), lgmn är (y), lgmn-rt-kalibreringskurvan Ekvationen är: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Baserat på standardkurvan erhålls beräkningsformeln för att beräkna molekylvikten för varje prov. Provets molekylviktspektrum är som följer, och beräkningsresultaten visas i tabell 2. Resultaten visade att CDP: er hade flera elueringstoppar, och molekylvikten för polysackarider fördelades huvudsakligen mellan 3 och 8 kDa, vilket var en heterogen liten molekylvikt heteropolysackarid. Som visas i figur 1.

 

 

2.3 CDPS monosackaridkomposition

CDP: er analyserades med jonkromatografi, och kromatogrammet visas i figur 2. Resultaten visade att jämfört med retentionstiden för 16 monosackaridstandarder detekterades 5 monosackarider i CDP: er. Genom att jämföra spektra med de för monosackaridstandarder, bestod CDP: er huvudsakligen av glukos, galaktos, rhamnos, mannos och sackaros. , Arabinose. Molförhållandet är 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178. Från det molförhållandet kan man se att CDP: er huvudsakligen består av glukos, galaktos och rhamnos. Bland dem står glukos för 73,405%, galaktos står för 5,381%och rhamnos står för 5,02%.

 

OBS: MAN.MANNOSE, GLC N.Glukosaminhydroklorid, RHA.RHAMNOSE, GLC-UA.Glukuronsyra, Gal-UA.galakturonsyra, Gal N.galaktosaminhydroklorid, Glc.glucose, Gal.galactose, xyl.xylos, ara. Arabinose, fuc.fucose.

2.4 CDP: er Fourier infraröd analys

The peak near 3246 cm-1 is caused by the OH stretching vibration of the hydroxyl group, the absorption peak near 2900 cm-1 is the CH stretching vibration peak of -CH3, and the absorption peak at 1594 cm-1 is the C=O stretching vibration peak, indicating that CDPs Presence of uronic Syra, 1374,31 cm -1: Denna absorptionstopp kan vara relaterad till deformationsvibration av CH-bindningar, särskilt i metylen (-CH3) eller metylen (-h 2-) grupper av polysackarider. Absorptionstoppen vid 1018,38 cm -1 kan vara relaterad till den sträckande vibrationen av CO -bindningen, som vanligtvis finns i eterbindningarna eller esterbindningarna av polysackarider. Tre svaga absorptionstoppar i området 1200-1000 cm -1 indikerar närvaron av pyranos i CDP: er. Absorptionstopparna vid 870 och 930 cm -1 indikerar att -typ glykosidbindningar kan existera i CDP: er. Se figur 3.

 

2.5 Toxiska effekter av CDP på ​​normal HK -2 Celler

Jämfört med CON, 24 timmar efter administrering, började cellviabiliteten minska avsevärt efter att CDPS -koncentrationen nådde 1000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Diskussion och slutsats

Polysackariderär polymerer med hög molekylvikt bestående av mer än 10 monosackarider. Det har rapporterats att polysackarider harImmunmodulerande, antioxidant, antiinflammatoriska och hypoglykemiska effekter[15]. Som ett av de viktigaste farmakologiskt aktiva ämnena i Cistanche Deserticola har CDP: er betydande medicinskt värde. Denna studie kännetecknade preliminärt strukturen hos CDP: er och fann att de kan förbättra skadorna på HK -2 celler inducerade av högsockermiljö.

 

Den komplexa strukturen för polysackarider är nära besläktad med deras biologiska aktivitet, bland vilken typen och andelen monosackarider, den relativa molekylmassan av polysackarider och typen av glykosidbindningar är viktiga påverkande faktorer [16]. Den måttliga relativa molekylmassan ger polysackarider mer aktiva platser och kan uppvisa starkare biologisk aktivitet.
Emellertid kommer stor molekylvikt att öka transmembranresistensen, hindra polysackaridabsorption och påverka aktiviteten. Omvänt kanske små molekylvikt polysackarider kanske inte kan bilda effektiva aktiva strukturer, vilket resulterar i minskad aktivitet [17]. När man undersöker den biologiska aktiviteten hos polysackarider är det nödvändigt att omfatta monosackaridkompositionen, relativ molekylmassa och glykosidisk bindningstyp [18]. I denna studie bestämde jonkromatografi att CDP: er huvudsakligen bestod av glukos, galaktos och rhamnos, vilket är förenligt med rapporten från Xu et al. [19]. Viktgenomsnittet molekylvikter hos CDP: er mätt med högpresterande flytande gelkromatografi var 3444, 4198 respektive 8031 ​​kDa. Molekylvikterna hos tre cistanche-polysackarider från fyra läkemedel av cistanche-typ mätt av Yang et al. [20] var liknande. CDP: er kan innehålla -typ glykosidbindningar och kan innehålla -glukos eller -mannos. Polysackarider sammansatta av -glukos eller -mannos erkänns lättare av avgiftsliknande receptor 4 (TLR4) eller TLR2 [21].
DN är en av de mest allvarliga mikrovaskulära komplikationerna av diabetes, och dess patogenes är nära besläktad med oxidativ stress, mitokondriell dysfunktion och cellapoptos [22]. Denna studie undersökte den skyddande effekten av CDP: er på hög glukosinducerad HK -2 celler genom att reglera TLR4/NF-KB-signalvägen och dess molekylmekanism.

Under höga glukosförhållanden uppvisar HK -2 celler betydande oxidativ stress [23]. Studier har funnit att höga sockernivåer signifikant ökar produktionen av intracellulär ROS. Denna överdrivna mängd ROS kan direkt skada cellmembranlipider, vilket kan leda till en ökning av innehållet i lipidperoxidationsprodukt MDA [24]. Samtidigt minskades aktiviteterna för SOD och GSH-PX, viktiga antioxidantförsvarssystem signifikant, vilket indikerade att antioxidantkapaciteten hos celler skadades allvarligt [25]. Denna obalans i oxidation-antioxidationssystemet främjar ytterligare uttrycket och aktiveringen av TLR4 [26]. Tidigare studier har visat att överdriven ROS kan erkännas av TLR4 som farassocierade molekylmönster (DAMP), som bildar en positiv återkopplingsslinga [27]. I denna studie minskade CDPS-förbehandling signifikant ROS-nivåer, ökade SOD- och GSH-PX-aktiviteter och minskat MDA-innehåll. Denna omfattande antioxidanteffekt antyder att CDP: er kan reglera oxidativa stressrespons genom flera mål.
I TLR4/NF-KB-signalvägen främjar aktiverad TLR4 aktiveringen av IKK-komplexet genom att rekrytera nedströms adapterproteiner, vilket i sin tur leder till fosforylering och nedbrytning av IKB [28]. Den nuvarande studien observerade att hög glukos signifikant ökade fosforyleringsnivån för IKB, vilket ledde till translokation av NF-KB p65 från cytoplasma till kärnan. Studier har visat att kärntranslokation av p65 inte bara förvärrar oxidativ stress utan också påverkar mitokondriell funktion [29].
Det observerades av JC -1 att den höga glukosbehandlingen orsakade en signifikant minskning av mitokondriell membranpotential, vilket visade en övergång från röd fluorescens till grön fluorescens, vilket indikerar att protongradienten mellan det inre och yttre membranen av mitokondrier stördes. Mitokondriell dysfunktion förvärrar ytterligare produktionen av ROS och bildar en ond cykel [30]. CDPS-förbehandling kan bibehålla stabiliteten i mitokondriell membranpotential, och denna skyddande effekt kan uppnås genom att hämma uttrycket av TLR4 och aktiveringen av NF-KB.
Mitokondriell dysfunktion och ihållande oxidativ stress leder i slutändan till cellapoptos [31]. Hoechst -färgning avslöjade att cellkärnorna i gruppen med hög glukos visade uppenbara typiska apoptotiska morfologiska förändringar såsom kondensation, kondensation och fragmentering [32]. Dessa förändringar är nära besläktade med den mitokondriella medierade intrinsiska apoptosvägen: förlusten av mitokondriell membranpotential leder till frisättning av cytokrom C, aktivering av kaspaskaskaden och slutligen cellapoptos [33]. Kärnmorfologin hos celler i CDPS -förbehandlingsgruppen var i princip normal och färgningen var enhetlig, vilket tyder på att CDP: er förhindrade cellapoptos genom att upprätthålla mitokondriell funktion och hämma oxidativ stress.
In summary, this study systematically detected oxidative stress indicators (ROS, MDA, SOD, GSH-Px), mitochondrial function (JC-1) and cell apoptosis (Hoechst), combined with TLR4/NF-κB signaling pathway Key molecules that elucidate the mechanism of action of CDPs: CDPs
Först genom att förbättra antioxidantkapaciteten hos celler, minska nivån på ROS och minska aktiveringen av TLR4; för det andra genom att hämma uttrycket av TLR4 och fosforylering av IKB, blockera kärntranslokationen av NF-KB; Slutligen, genom att förbättra mitokondriell funktion, hämma cellapoptos. Döden, därmed spelar en skyddande roll mot DN. Denna synergistiska effekt med flera mål gör att CDP: er visar goda tillämpningsmöjligheter vid behandlingen av DN. I efterföljande studier kommer polysackaridstrukturen att bestämmas ytterligare genom röntgendiffraktion, kärnmagnetisk resonansspektroskopi och gaskromatografimasspektrometri. Dessutom visar de genomsnittliga molekylviktsresultaten att CDP: er är heterogena polysackarider. Därefter kommer vi att separera och rena homogena polysackarider, upptäcka polysackaridstrukturen och biologisk aktivitet och klargöra struktur-aktivitetsförhållandet.