Studie av den östrogenliknande mekanismen för glykosider i Cistanche med hjälp av metabolomics

Introduktion

Östrogener spelar en viktig roll i många utvecklingsmässiga, fysiologiska och relaterade processer, inklusive livmoderns utveckling.1–3 Långvarig användning av östrogen kan dock ha många biverkningar, som att öka risken för bröstcancer, endometriecancer och andra gynekologiska tumörer.4,5 Därför har forskare förbundit sig att söka östrogensubstitut som kan undvika dessa biverkningar, kända som selektiva östrogenreceptormodulatorer, av vilka fytoöstrogener utgör en viktig kategori.6 Fytoöstrogenföreningar förekommer naturligt i växter med östrogen styrka och kan binda till östrogenreceptorer för att utöva sin aktivitet. Därför kan fytoöstrogener stimulera livmoderns tillväxt genom att kombineras med de rikliga östrogenreceptorerna i livmodern, vilket innebär att den uterotrofiska analysen kan användas för preliminär screening och utvärdering av fytoöstrogener.

Cistanchedeserticola (CD), känd som Rou Cong-Rong i Kina, påstås vara effektiv för reproduktion, utveckling och fertilitetsfunktioner och har använts som tonic i mer än 1800 år.8,9 Nyligen har farmakologiska studier visat att detta tonic har breda medicinska funktioner, som t.exhormonreglering, aperient, immunmodulerande, antioxidativ, anti-apoptotisk, neuroprotektiv, antinociceptiv, antiinflammatorisk, anti-trötthets- och östrogena aktiviteter.10 Glykosider av cistanche (GC) extraherade från CD är bland de huvudsakliga aktiva komponenterna och uppvisar olika biologiska aktiviteter.11 Även om de aktiva beståndsdelarna i CD har klarlagts tidigare,12 har den östrogenliknande mekanismen för GC aldrig undersökts.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖREBYGGANDE AV BENSKONTROLL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I denna fortsatta studie syftade vi till att bekräfta den möjliga användningen av GCs som fytoöstrogener och utföra en metabolomisk analys för att utforska den östrogenliknande mekanismen hos GC. Först användes en uterotrofisk analys och histologisk analys för att bekräfta den östrogena aktiviteten hos GC. Viktigast av allt fokuserade vi på de metaboliska förändringarna i råttserum och urin med hjälp av UPLC-MS/MS-baserad metabolomikanalys. På grund av bristerna hos icke-målinriktad metabolomik, såsom repeterbarhet och komplicerad matrispåverkan, användes en MRM-lägesbaserad pseudometod för att specifikt övervaka metaboliterna och index (inklusive energimetabolism, oxidativ stress, lipidmetabolism och aminometabolism) relaterade till östrogena effekter, tillväxt och utveckling valdes ut som biomarkörer för detektion. Våra resultat belyser den östrogenliknande mekanismen hos GC, vilket kommer att hjälpa utvecklingen och användningen av GC.

Experimentell

Reagens

L-Leucin, L-kynurenin, L-tryptofan, 5-HTP, cholsyra, Nfenylacetylglycin, 5-HT, glutation (GSH) och 2,4-dinitrofenylhydrazin (99 USD,{{ 8}} %, HPLC) köptes från Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Kina). N-etylmaleimid ($98%, HPLC), L-glutationoxiderad (GSSG, $98%, HPLC) och 1,1,3,3-tetraetoxipropan (TEP) köptes från Sigma (Madrid, Spanien). L-fenylalanin (Ring-D5, 98 %, DLM-1258-5) köptes från Cambridge isotoplaboratorier (MA, USA). Metanol och acetonitril av MS-kvalitet köptes från ACS (Houston, USA). Dietylstilbestrol (renhet, $99.0%), myrsyra, isättika och hematoxylin och eosin (H&E) köptes från Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Naringenin (renhet, $98% (HPLC)) köptes från Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, Kina). GCs bereddes i vårt laboratorium och deras renhet bestämdes till 60% genom ultraviolett spektrofotometri med användning av akteosid som en markör för bestämning.

Förberedelse av GC

Briey,cistanche pulver(100 g) blötlades i 75 % etanol (1000 ml) i 1 timme, och extraherades sedan på nytt under 2,5 timmar tre gånger. Supernatanten koncentrerades under vakuum för att erhållacistancheextrakt(23,3 g). Extraktet späddes med vatten till en koncentration av 0,5 g ml- 1 (löslighet bestämd med råläkemedel). Efter adsorption med AB-8 makroporöst harts under 8 timmar, eluerades kolonnen sekventiellt med vatten och 85 % etanol. Elueringsmedlet med 85 % etanol koncentrerades för att erhålla etanolextrakt (8,4 g). Etanolextrakt (0.02 g) vägdes noggrant och löstes i 50% metanol (10 ml). En 1 ml alikvot av lösningen späddes till 100 ml med metanol i en volymetrisk ask. Slutligen mättes den utspädda lösningen vid 330 nm med ultraviolett spektrofotometri. Den ultravioletta absorptionen var 0,341, och det linjära förhållandet för akteosid genom UV var y ¼ 24,905X + 0.0426 (R2 ¼ 0,9982). När den innehöll 5,04 g GCs var reningshastigheten 60 % (akteosid användes som en markör för GC-bestämning). Fingeravtrycksutvärdering av GCs visas i ESI Fig. S1.

Djurförsök och provtagning

SD-honråttor med sexuell omognad (45–60 g) och sexuell mognad (320–380 g) tillhandahölls av Animal Center of Harbin Medical University, laboratoriedjurslicens, SCXK- (Army): 2013-001. Djuren hölls under SPF-laboratorieförhållanden och försågs med ett standardlaboratoriedietförändrat kranvatten ad libitum. Alla djurförsök godkändes av Heilongjiang Provincial Animal Welfare and Care Guidelines och utfördes enligt National Institute of Healths riktlinjer angående principerna för djurvård (2004). Alla råttor som användes i detta experiment acklimatiserades till ovanstående miljö under en vecka.

De sexuellt omogna SD-råttorna delades slumpmässigt in i tre grupper om 10-råttor: blankgrupp, dietylstilbestrolgrupp och GC-grupp. Under tiden valdes 10 SD-råttor av sexuell mognad ut som kontrollgrupp. Dietylstilbestrolgruppen administrerades ig med dietylstilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), GC-gruppen administrerades ig med GC-lösningen (30 g kg- 1, 1 ml/100 g ) och den blanka gruppen och kontrollgruppen fick destillerat vatten med samma volym två gånger om dagen (morgon och kväll) under 3 dagar. På den tredje dagen hölls råttorna i metaboliska burar efter administreringen, och urinprover samlades kontinuerligt under 24 timmar. Råttorna bedövades med användning av pentobarbital och blodprover togs och samlades in från bukaortan och centrifugerades vid 3000 x g (15 min, 4 °C) för att erhålla serum. Alla prover lagrades på - 20. C. Vidare separerades livmodern, vägdes och undersöktes med användning av 10 % formalin.

Histologisk analys

Seriella 5 mm tjocka vävnader skars ut från livmodern. Vävnadssnitten bäddades sedan in i paraffin, färgades med H&E med rutinmetoder och observerades med ett optiskt mikroskop (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japan). Höjden på livmoderepitelceller mättes med en mikrometer under mikroskopet.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FRÄMJA BRÖSTVÄXT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomics

Beredning av aktivt kol-strippat serum

Speciellt blankserum framställdes från råttserum som hade strippats från endogena material med användning av aktivt kolpulver. Aktivt kolpulver (6 g) sattes till råttserumet (100 ml) som skakades i 2 timmar vid rumstemperatur och centrifugerades vid 4 °C. C och 13 500 rpm i 20 min. Supernatanten förändrades med användning av Millipore express PES-membran (Merck Millipore, Ltd.) fästa till en 20 ml spruta i följande sekvens: 5 mm, 1,2 mm och 0,45 mm. Det "avskalade" serumet bekräftades vara fritt från biomarkörer av LC-MS/MS.

Framställning av standardlösningar

L-tryptofan (Try), L-kynurenin (Kyn), GSSG, N-fenylacetylglycin (N-Phe), 5- HTP, L-leucin (Leu), 5-HT och cholsyra ( CA) stamlösningar (1 mg ml- 1) ​​framställdes med användning av 100% metanol. GSH bereddes vid 0,5 mg mL- 1 i 10 mM NEM PBS-buffert och lagrades vid - 40. C i bruna flaskor. Kalibratorer genererades med kombinerad L-tryptofan, L-kynurenin, GSSG, N-fenylacetylglycin, 5-HTP, L-leucin, 5-HT, cholsyra och GSH-NEM som späddes i serie med destillerat vatten. IS-stamlösningen av L-fenylalanin-d5 (d5-Phe) framställdes i 100 % metanol och arbetslösningen av d5-Phe (10 ng mL- 1) framställdes i 100 % metanol och lagras vid - 40. C.

Under analysen var ett derivatiseringssteg nödvändigt för att undvika GSH-nedbrytning, vilket förbättrade stabiliteten för detektion och kvantifiering av GSH. GSH bestämdes efter reaktion med NEM.15,16 Enligt den tidigare rapporten valdes 50 mM NEM för GSH.

Provberedning

För serumprover sattes 10 mM NEM (200 ml) till provet (200 ml), följt av metanol (1000 ml innehållande IS Phe-d5 vid 10 ng ml- 1) och inkuberades i 20 minuter vid { {9}}. C. Efter centrifugering vid 4.C och 12 000 rpm under 10 minuter överfördes supernatanterna (1000 ml) till 2 ml centrituber och indunstades till torrhet. Den torkade återstoden rekonstituerades i destillerat vatten (100 ml) efter centrifugering under 15 minuter vid 4°C. C och 13 500 rpm, och en 10 ml alikvot av supernatanten injicerades för analys.

För urinprov placerades 100 ml prov i ett 2 ml rör och 1 volym PBS (m/v) innehållande 50 mM NEM sattes till varje urinprov. Sedan tillsattes metanol (1000 ml innehållande IS vid 10 ng ml- 1) och provet inkuberades vid - 20. C i 20 minuter och centrifugerades sedan vid 12 000 rpm i 10 minuter vid 4 . C. Supernatanten (1000 ml) indunstades till torrhet under en försiktig ström av kväve vid rumstemperatur, och sedan löstes återstoden i 60 ml mobil fas och virvlades i 1 min innan centrifugering vid 13 500 rpm och 4 . C i 15 min. En 10 ml alikvot supernatant injicerades för analys.

Metodvalidering

Assayvalidering utfördes enligt "Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation" (Food and Drug Administration, september 2013). Kalibratorerna genererades med hjälp av en surrogatmatris för Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe och CA från standardarbetslösningar i det "avskalade" serumet. Varje koncentrationskalibrator duplicerades. Standardkurvan beräknades genom 1/X viktad linjär regression av minsta kvadraten av standardkurvans kalibratorkoncentrationer och toppareaförhållandena för analyten till IS.

Precisions- och noggrannhetsanalys

Analysprecisionen för sammanslagna QC-prover och obehandlade QC-prover från råttserum/urin utvärderades med en intra-dag och tre inter-dag analytiska körningar. QC-proverna med tre olika koncentrationer genererades genom tillsats av L-tryptofan, L-kynurenin, GSSG, N-fenylacetylglycin, 5-HTP, L-leucin, 5-HT, cholsyra och GSH-NEM standardlösningar till "strippat" serum/PBS, som sedan bearbetades på samma sätt som in vivo-prover. Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu och CA standardstamlösningar (1 mg mL- 1) bereddes i 10 0 % metanol, förutom den för GSH, som framställdes vid 0,5 mg mL - 1 i 10 mM NEM PBS-buffert. Standardkurvor vid åtta olika koncentrationer genererades på samma sätt som QC-prover och analyserades med 1/X-viktad linjär regression av minsta kvadrater. För metodvalideringsstudien utfördes en annan QC-metod samtidigt med användning av poolat serum/urin (50 mL) från varje prov i kontroll- eller modellgrupperna för att erhålla ett QC-prov och bearbetades sedan som in vivo-prov. En serie QC-prover och standardkurvor kördes för vart 50:e djurprov.

Matriseffekter

Matrisvariation, definierad som variationen i analysnoggrannhet för olika partier av matris, utvärderades med hjälp av sex olika plotter av spikat råttserum/urin för analys och bedömning av spetsad återhämtning.17 Utvärdering av hela matriseffekten för en endogen föreningsanalys är utmanande . Ett sätt att testa om en analys har någon (övergripande) matriseffekt är att utvärdera den ökade återhämtningen. Det spetsade återvinningstestet innebär att analyten spetsas in i prover före extraktion, vilket skiljer sig från matrisfaktortestet (MF), vilket innebär att analyten spetsas in i prover efter extraktion.18 MF beräknades som topparean för analyten i närvaron av en biologisk matris jämfört med den i frånvaro av en biologisk matris. Den IS-normaliserade MF användes: MF ¼ topparea/IS-förhållande i närvaro av matris vs topparea/IS-förhållande i frånvaro av matris.

UPLC-MS/MS-analys

MS-utrustning utrustad med en Waters X BridgeTM BEH C18 analytisk kolumn XP (2,5 mm, 3,0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) användes för LC-MS /MS-analys. Q linjär gradient mobil fas bestående av 0,1 % myrsyravatten (lösningsmedel A) och metanol (lösningsmedel B) användes enligt följande gradientprogram: 0–3.0 min (0–1 % B); 3.0–10.0 min (1–3 % B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.0–18,0 min (50–95 % B); 18,0–22,0 min (95–0 % B), stopptiden är 25 min. Injektionsvolymen var 10 ml och hastigheten var 0,6 ml min- 1. Den slutliga metoden använde följande parametrar: skanningstyp, MRM; jonläge, elektrosprayjonisering (ESI) i positiva och negativa jonlägen; jonsprayspänning, ± 4500 V; gardingas, 20; temperatur, 450.C; jonkälla gas 1, 40; jonkälla gas 2, 40. Alla UPLC-MS-data erhölls med AB Analyst-programvara (version 1.6.2) och m/z 171.1–125.2 för intern standard d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) och detaljerade MS-förhållanden visas i Tabell S1.

Statistisk analys

Alla värden uttrycktes som medelvärde ± SD. Betydelsen av skillnader mellan grupper jämfördes genom ett envägs ANOVA-test följt av Dunnetts test med programmet Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Signifikanströskeln sattes till p < 0,05 i detta test.

resultat och diskussion

Effekt av GC på livmodern

Livmodervikt och histologisk analys användes för att utvärdera effekten av GC på livmodern. Livmodervikten ökade signifikant i dietylstilbestrol-, GC- och kontrollgrupperna i förhållande till den blanka gruppen (P < {{0}}.01). I den tomma gruppen var endometriepitelet lågt kolumnärt med små körtlar, ett kubiskt format körtelepitel och utan interstitella inflammatoriska celler. I dietylstilbestrolgruppen var körtelepitel och endometrium höga kolumnära och visade hyperplasi, med mycket interstitiell inflammatoriska celler. I GC-gruppen var körtelepitel och endometrium mycket kolumnärt tandade och visade hyperplasi med mycket interstitiell inflammatoriska celler och intimal förtjockning. I kontrollgruppen var endometriet högt kolumnärt och körtelepitelet låg kolumnärt, med få interstitiell inflammatoriska celler. Jämfört med den tomma gruppen ökade höjden på livmoderepitelcellerna signifikant i de andra grupperna (P < 0,01) (Fig. 1).

Metodvalidering av upptäckt biomarkör med UPLC-MS/MS

Linjäritet och kalibreringsområde

För varje mätning konstruerades en linjär kalibreringskurva med en viktfaktor på 1/X i den studerade matrisen. Kalibreringskurvorna för analyser i serum analyserades på olika dagar. Kalibreringsintervallen för analyserna fördelades längs sju kalibreringspunkter, som visas i tabell 1.

Noggrannhet och precision. Metoden visade sig vara lämplig, vad gäller noggrannhet och precision, både mellan dagar och under dygn, för alla studerade prover. Värdena för dessa parametrar var mindre än 5 % vid de inställda koncentrationerna för GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, cholsyra, 5-HT och N-fenylacetylglycin, med tre replikat av varje analyserad koncentration. Data som motsvarar inter-day- och intra-day-värdena för noggrannhet och precision visas i ESI-tabell S2.

Matriseffekter

Som visas i ESI-tabell S3,† var de spetsade återhämtningarna 92,5–118,1 % vid tillsats av 1000 ng mL- 1 GSH, 2000 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu , 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL- 1 5-HTP, 400 ng mL- 1 cholsyra av GSH, 200 ng mL- 1 GSSG, 1000 ng mL- 1 Leu, 6000 ng mL- 1 Trp, 50 ng mL- 1 Kyn, 2 ng mL{ {37}} av 5-HTP, 400 ng mL- 1 cholsyra, 8 ng mL- 1 av 5-HT, 2500 ng mL- 1 av N -fenylacetylglycin i tre olika plots av råtturin med olika baslinjenivåer. CV för uppmätta Trp- och Kyn-koncentrationer från dessa partier var #10 % (n ¼ 5). Dessa resultat indikerade att olika matriser inte signifikant påverkade analysen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR FÖREBYGGANDE AV LIVMOTORCANCER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analys av metabolitprofilering med pseudo-målinriktad metod

Den pseudotinriktade metoden utnyttjades för att undersöka serum- och urinmetaboliten MRM-proling av fyra grupper (blank, dietylstilbestrol, kontroll och GC).

För det första byggdes PCA-modellen för att uppvisa den metaboliska skillnaden mellan de fyra grupperna. Från multivariat analys fanns det uppenbara metaboliska skillnader mellan GC-grupperna (inklusive dietylstilbestrol- och kontrollgrupper) och blankgruppen. QC-proverna klungade ihop tätt i poängdiagrammet för PCA, vilket indikerade att systemstabiliteten var ackommoderande för denna metabolomikstudie (Fig. 2).

Sedan sattes det kritiska P-värdet till 0.05 för signifikant differentiella metaboliter i denna forskning. Följaktligen, som visas i tabell 2, identifierades differentiella metaboliter jämfört med blankgruppen preliminärt enligt följande: 17 i serumprover och

12 i urinprover för GC-gruppen, 15 i serumprover och 9 i urinprover för dietylstilbestrolgruppen, 12 i serumprover och 11 i urinprover för kontrollgruppen, och 11 i serumprover och 7 i urinprover som togs samtidigt närvarande i GC-, dietylstilbestrol- och kontrollgrupperna. För att ytterligare förstå de metaboliska skillnaderna mellan olika grupper genererades en klustringsvärmekarta för alla differentiella metaboliter, vilket visar den relativa ökningen (röd) eller minskning (grön) (Fig. 3).

Arton differentiella metaboliter som fanns samtidigt i GC-, dietylstilbestrol- och kontrollgrupperna beskrevs som

följer: glukos, citronsyra, prolin, betain, ornitin, N-fenylacetylglycin, fenylpyrodruvsyra, inosin, C16:0LPC, kreatinin och xantosin i serum och bensenacetylglycin, pyroglutaminsyra, och acetylkarnitin N6-acetyllysin i urin observerades vara signifikant minskad (P < 0.05); medan taurin, ornitin, a-ketoglutarsyra och spermidin i urinen ökade signifikant (P < 0.05). Dessutom ökade taurin (serum) signifikant, medan a-ketoglutarsyra (serum), C18:0LPC (serum) och betain (urin) minskade signifikant i grupperna dietylstilbestrol och GC (P < {{ 19}}.05); L-kynurenin (serum) uppreglerades i dietylstilbestrolgruppen, men nedreglerades i GC-gruppen (P < 0,05); pyroglutaminsyra (serum) och prolin (urin) nedreglerades, och citronsyra (urin) och nikotinamid (urin) ökade markant i kontroll- och GC-gruppen (P < 0,05); och fenylalanin nedreglerades i GC-gruppen (P < 0,05).

I denna studie undersöktes effekterna av GC på livmodern hos omogna råttor. Livmodern är det känsligaste organet för att analysera ER-beroende effekter av kemikalier.Herba Cistancheshar rapporterats inducera en ökning i livmodervikt genom att förbättra den lutropinfrisättande funktionen hos hypotalamus-hypofys-äggstocken20, vilket också observerades för GC i denna studie. Detta indikerade att GC har östrogenliknande aktivitet. Nyligen har rapporter huvudsakligen fokuserat på den dominerande mekanismen genom vilken östrogena effekter uttrycks genom bindning till ERs,21–23, men den metaboliska mekanismen har inte studerats på djupet. I denna studie användes en pseudometabolomisk metod för att utforska den östrogenliknande mekanismen hos GC.

Metaboliska intermediärer av en sekventiell serie av reaktioner förändrades på ett mer uttalat sätt än enzymatisk kinetik eller individualiserar.24 Sjutton metaboliter i serum, inklusive glukos, citronsyra, taurin, prolin, betain, ornitin, pyroglutaminsyra, a-ketoglutarsyra, N- fenylacetylglycin, fenylpyruvatsyra, inosin, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatinin, fenylalanin, L-kynurenin och xantosin, och 12 metaboliter i urin, inklusive bensenacetylglycin, betain, taurin, citronsyra, ornitin, pyroglutaminsyra, acetylkarnitin, N6-acetyllysin, nikotinamid, a-ketoglutarsyra, syra, spermidin och prolin, visade sig vara involverade i den östrogenliknande mekanismen hos GC. Flera förändrade metaboliter var av speciellt intresse eftersom de fanns i både serum och urin. Till exempel, citronsyra, bildad genom kondensation av acetylkoenzym A och oxaloättiksyra och spelar en viktig roll i citronsyracykeln relaterad till energimetabolism,25 nedreglerades i serumet från GC-gruppen men uppreglerades i urinen . Vidare nedreglerades a-ketoglutarsyra med en glutaminkolram, som kan upprätthålla total kvävebalans och främja proteinsyntes, och är det centrala materialet i citronsyracykeln, i serumet i GC-gruppen, men uppreglerades. i urinen.26 Citronsyracykeln är inte bara den slutliga metaboliska vägen för tre viktiga näringsämnen (kolhydrater, lipider och aminosyror), utan också länken mellan socker-, lipid- och aminosyrametabolism, och det huvudsakliga sättet att få energi för kroppen.27,28 Detta visade att den östrogenliknande mekanismen hos GC var relaterad till energimetabolism, vilket är samma sak som dietylstilbestrol. Därför fanns det ett tydligt samband mellan citronsyracykeln och ökningen av livmodervikt hos omogna råttor som behandlats med GC. Som en viktig metyldonator spelar betain en viktig roll i fostrets tillväxt och utveckling, vilket indikerar att betain är involverat i ökningen av livmodervikt.29 Intressant nog uppreglerades taurin i både serum och urin, vilket skulle kunna främja lipidmatsmältning och absorption och cellupptag och utnyttjande av glukos genom att främja glukosmetabolism. Taurinbrist har också rapporterats leda till viktminskning hos unga djur, vilket tyder på att taurin spelar en viktig roll för tillväxt och utveckling.30 Dessutom följde regleringseffekten av betain och taurin av GC samma trend med dietylstilbestrol, men med en förstärkt effekt jämfört med dietylstilbestrol.

Dessutom förändrades många aminosyror signifikant. Våra resultat antydde att GC orsakade metabola abnormiteter i aminosyror. Aminosyrametabolism skulle kunna användas för syntes av specifika proteiner, peptider och andra kvävehaltiga föreningar, eller dekarboxylering genom deaminering, transaminering, kombinerat med ammoniaknedbrytning, eller för energifrisättning genom citronsyracykeln.31,32 Därför ändras dessa föreningar kan vara involverade i de viktiga signalhändelser som utlöser ökningen av livmodervikt.

Dessutom, för en detaljerad väganalys, kategoriserades differentialmetaboliterna i flera huvudvägar inklusive citratcykeln (TCA-cykeln), glutationmetabolism,

arginin- och prolinmetabolism, D-glutamin- och D-glutamatmetabolism, biosyntes av fenylalanin, tyrosin och tryptofan, fenylalaninmetabolism och andra vägar som använder Pathway Analysis of MetaboAnalyst-programvaran (http://www.metaboanalyst.ca), som visas i Fig. 4. Den energimetabolismrelaterade vägen, inklusive TCA-cykeln och glutationmetabolism (både i serum och urin), var ett av huvudmålen för östrogena effekter. Den kritiska rollen för östrogena kemikalier i energimetabolism verifierades av ER som reglerar generna som krävs för mitokondriell funktion, TCA-cykeln och mer, enligt tidigare studier.33,34 Man kunde dra slutsatsen att den östrogenliknande mekanismen för GC var liknande till den för dietylstilbestrol, med båda relaterade, till viss del, till TCA-cykeln och glutationmetabolism, men med GC som presterar bättre än dietylstilbestrol.

Även om de möjliga mekanismerna inte kunde klargöras i denna studie, valdes vissa metaboliter ut som skulle kunna användas för att utforska andra östrogena mekanismer för GCs i livmodern i framtiden. Därför, för att bättre utforska mekanismen, kommer andra teknologier, såsom proteomik, att tillämpas i framtida forskning.

Slutsatser

För att sammanfatta, etablerades en pseudotinriktad metabolomikmetod för serum och urin baserad på UPLC-QTRAP MS för att utforska de östrogenliknande mekanismerna hos GC, vilket gav robusta och tillförlitliga resultat. Genom att använda den etablerade pseudotinriktade metoden avslöjades en holistisk syn på förändringarna i serum- och urinmetabolomiken för den östrogenliknande mekanismen (GC).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%