Studie om neuroendokrin-immun funktion hos Cistanche Deserticola och dess risvinsångande produkter i glukokortikoid-inducerad råttmodell-Ⅰ

1. Inledning

Cistanche öken, som kallas "ökenginseng," är en traditionell kinesisk medicin som har använts i århundraden som en yang-tonisk ört förstärker njuren och stärker yangen[1]. Åtta arter och en variant avCistanche Herba har spelats in i Kina och endastCistanche deserticolaYC Ma ochCistanche tubulosa(Schenk) Wight finns registrerade i den kinesiska farmakopén [2]. Farmakologiska studier visade detCistanches Herbauppvisade neuroprotektiva [3], immunmodulerande [4], hjärtskyddande [5], anti-trötthet [6], antiinflammatoriska [7], leverskyddande [8], antioxidativa [9], antibakteriella [10], laxerande [11] och antitumörer. effekter [12]. Det breda spektrumet av rapporterade biologiska aktiviteter av detta släkte har tillskrivits dess komplexa och varierade fytokemiska sammansättning.Cistanche deserticolainnehåller fenyletanolglykosider, iridoider, polysackarider [13] etc. Innehållet av fenyletanoidglykosider är högst i de ursprungliga läkemedelsmaterialen [14].

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR UPPFYRKNING AV NJUREN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bearbetning av kinesisk materia Medica (CMM) är en traditionell farmaceutisk teknik för att uppfylla de olika kraven för behandling, dispensering och framställning av preparat enligt traditionell kinesisk medicinteori. Dessa bearbetade produkter kallas avkok, som används på kliniker. Bearbetningen syftar till att förbättra effektiviteten för att minska toxiciteten hos råläkemedel. 2015 kinesiska farmakopén registrerade att Cistanche tjocka skivor (CD) och risvinsångad Cistanche (WCD) kunde användas som avkok på kliniken. Vår forskargrupp visade att den laxerande effekten lindrades, och de antiåldrande och njure-yang-upplivande effekterna förstärktes efter att Cistanche ångades med risvin [15].

Funktionen hos axeln hypotalamus-hypofys-binjure-tymus (HPAT) är störd i njure-yang-bristsyndromet [16]. Patienter med njur-yang-brist har också omfattande immunförsvar. HPA-axeldysfunktion är nära relaterad till immunbrist. Neuroendokrina-immuna nätverk (NEI) teori visar att immunsystemet och neuroendokrina systemen delar många ligander och receptorer [17], och hypotalamus anses vara pivoten för att koppla ihop det neuroendokrina med immunsystemet.

I denna studie replikerade vi njur-yang-brist hos modellråttor med exogen kortikosteroidinjektion och utforskade mekanismen för njur-yang-bristen som svar på olika bearbetade produkter av Cistanche deserticola ur perspektivet av endokrin-immun funktion.

2. Material och metoder

2.1. Material och reagens

Cistanche deserticola samlades in från Alashan Neimenggu 2019.5 och identifierades som de torkade köttiga stjälkarna av Cistanche deserticola YC Ma av Prof. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Kina). Verifikationsexemplaren bevarades i Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standardföreningar av ajugol köptes från Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kina); cistanosid F,echinakosid, cistanosid A och isoakteosidköptes från Must Company (Sichuan Kina); acteosid köptes från Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kina). Acetonitril och metanol av MS-kvalitet köptes från Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Myrsyra av HPLC-kvalitet köptes från Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland). Risvin köptes från Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kina).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, renhet > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan piller (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), råtta ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 och IL-10 ELISA-detektionskit köptes från Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Råttkortisol-ELISA-kitet tillhandahålls av BOSK Co., CD4-antikropp från råtta, CD8a-antikropp (nr 561833 och 559976), RBC-lysat (Solarbio, R1010), PBS-buffertlösning (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM och -aktin uppströms och nedströms primers tillhandahölls av Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (nr RR037A) och cDNA Synthesis Kit (nr 10000068167) tillhandahölls av Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroform, isopropanol, 75 % etanol och uretan Lösningarna var alla analytiskt rena och tillverkade av Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultrarent vatten producerades av Milli-Q-systemet (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Experimentella instrument

En enzymmarkör (Thermo, modell 3530911931), automatisk platttvätt (modell HBS- 4009), digital display push-pull kraftmätare (modell VICTOR- 50N), höghastighetsfryscentrifug (modell Sigma 3k15 ), ultramikrospektrofotometer (modell B-50Q), genförstärkare (modell L96G), kvantitativ PCR för realtidsfluorescens (modell StepOne), flödescytometer (modell AC66051710132), paraffinmikrotom (modell Laika), mikroskop (Olympus , modell BS-53) och ett instrument för rent vatten (modell F7JA36507) användes.

2.3. Beredning av prover för UPLC-Q-TOF-MS och farmakologiska experiment

WCD bearbetades från samma batch avCistanche ökeni vårt laboratorium. För framställning av WCD infunderades torra CD-bitar (5 mm tjocka) (100 g) med risvin (30 ml), ångades vid högt tryck (1,25 kPa) i 4 timmar och torkades sedan vid 55 grader.

De grova pulvren av CD och WCD blötlades i 10 gånger 95 % etanol under 0,5 timmar, återloppskokades 3 gånger varje gång under 1 timme och filtrerades, och filtraten kombinerades 3 gånger. Etanolen utvanns under reducerat tryck och extraktet erhölls för administrering. Extraktet (1 ml) sattes till 50 % metanol, vilket bringade den totala volymen till 20 ml, och lagrades vid 4 grader för innehållsanalys.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS Villkor för analys av CD- och WCD-extrakt

2.4.1. LCThMS analytiska förhållanden

UPLC-MSThMS-systemet med MassLynx 4.1 Analyst-mjukvara användes för att utföra datainsamling och bearbetning. Den analytiska kolumnen var en Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) vid en temperatur av 40 grader C. Den mobila fasen var 0,1 % myrsyravattenlösning (A) och acetonitril innehållande 0,1 % myrsyra (B). Elueringsgradienten var 0,00–1.00 min med 3 % B, 1,01–2.00 min med 3 %–11,5 % B, 2,01–3.{{29 }} min med 12 % B, 3,01–4.00 min med 15 % B, 4,01–5.00 min med 20 % B, 5,01–6.00 min med 22 % B, 6,01–8.00 min med 25 % B och 8,01–9.00 min med 10 % B. Flödeshastigheten var 0,3 mLTh min, och injektionsvolymen var 1,0 μL.

Waters triple quadruple masspektrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) utrustad med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) användes i negativ jonmod. Desolvationsgasen var kväve med en flödeshastighet på 500 LThh vid en temperatur av 250 grader. Alla detekterade föreningar mättes i multipel reaktionsövervakning (MRM)-mod; Tabell 1 visar energiparametrarna och Tabell 2 visar kalibreringskurvorna för de analyserade komponenterna.

2.4.2. Beredning av referensämnen

Tubulosid A (3.02 mg), echinakosid (3.00 mg), 2'-acetylakteosid (2,34 mg), acteosid (2,45 mg), isoacteosid (0,61 mg), cistanosid F ( 2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geniposidinsyra (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) och katalpol (2,39 mg) löstes i metanol för att framställa en stamlösning. Stamlösningen späddes med metanol för att få de lämpliga koncentrationerna för arbetsstandardlösningarna. Alla beredda lösningar förvarades vid 4 grader före användning.

2.5. Förberedelse och gruppering av djurmodeller

SD-hanråttor (180–220 g) köptes från Liaoning Changsheng Biotechnological Co., djurtillståndsnummer: SCXK (Liao) 2015–0001. Alla råttor hölls med fri tillgång till mat och vatten vid 25 grader och en relativ luftfuktighet på 30–50 %. Djuren hölls i 7 dagar före experimenten.

Hundra råttor delades slumpmässigt in i 10-grupper: blank kontrollgrupp (BC), modellkontrollgrupp (MC), positiv kontrollgrupp (PC), riskvinskontrollgrupp (WC), CD högdos (CD) -HD) grupp, CD mellandosgrupp (CD-MD), CD lågdosgrupp (CD-LD), WCD högdosgrupp (WCD-HD), WCD medeldosgrupp (WCD-MD) och WCD lågdosgrupp (WCD-LD). Doserna av CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD och CD-LDThWCD-LD var 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) respektive 1,37 gTh(kg ∙ d). Dosen för PC-gruppen var 1,646 gTh(kg ∙ d), och för WC-gruppen 1 mLTh100 g under 40 dagar. Den 6:e dagen efter administrering injicerades råttorna subkutant med kortikosteronvattensuspensionen (kortikosteron + 0,1 % dimetylsulfoxid + 0,1 % Tween-80 + 0,9 % natriumklorid) förutom för BC-gruppen [18]. Koncentrationen av kortikosteron var 5 gThL, och dosen var 0,1 mLTh100 g. Råttorna i BC-gruppen fick normal koksaltlösning + 0,1 % dimetylsulfoxid + 0,1 % Tween- 80 + 0,9 % natriumklorid genom injektion i samma dos.

2.6. Bestämning av HPA-axelfunktioner

2.6.1. Test av vikt, temperatur och hållkraft

Ett vikttest utfördes var 3:e dag, och temperaturen togs var 6:e ​​dag. under experimentet. Den 39:e dagen mättes bakbenens maximala styrka med en greppmätare. Råttorna placerades på släta plattformar, vilket fick deras bakben att ta tag i stången. Råttorna kommer instinktivt att ta tag i alla föremål för att förhindra att de rör sig bakåt när svansen dras tills dragkraften överstiger greppet. När råttan tappade greppet kunde förförstärkaren automatiskt registrera den maximala greppkraften.

2.6.2. Bestämning av nivån av T, CRH, ACTH, CORT och kortisol i serum

En timme efter den sista administreringen bedövades råttorna genom intraperitoneal injektion av en uretanlösning (20 gTh100 ml). Därefter samlades blodproverna, centrifugerades vid 3500 r i 15 minuter för att erhålla serumet och lagrades vid -20 grader. Koncentrationerna av T, CRH, ACTH, CORT och kortisol mättes med rått-ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

2.6.3. Mikroskopobservationer

Den morfologiska strukturen av binjurevävnad observerades genom HE-färgning. Binjurevävnad fixerades i 10 % paraformaldehyd, dehydrerades i etanol, gjordes genomskinlig med en xylenlösning, bäddades in med konventionella metoder, skars till 4 μm tjocka skivor, avvaxades med xylenlösning, hydratiserades med etanolgradienten och färgades sedan med hematoxylin och eosin färgningslösning. Efter att ha gjorts transparent med xylen förseglades plattan med neutralt gummi och observerades under ett mikroskop.

2.6.4. Immunhistokemisk färgning av Bax-, Bcl-2-, Caspase--3-, Fas- och FasL-proteinuttryck i binjuren

Formalinfixerade, paraffininbäddade råttbinjuresektioner avparaffinerades och rehydrerades efter att ha skurits i en tjocklek av 4 μm. För blockering av endogen peroxidasaktivitet förinkuberades sektionerna i väteperoxidblock under 1 0 min. Sektioner doppades i 0,01 M citrat (pH 6,0) och värmdes till kokning. Processen upprepades efter 5–10 min. Efter kylning tvättades sektionerna med PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 gånger, lämnades i rumstemperatur i cirka 5 minuter och tvättades med PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 gånger. Den 5% BSA-blockerande lösningen tillsattes vid rumstemperatur och överskottsvätskan på sektionen skakades av 20 minuter senare. Utspädda primära antikroppar specifika för FasTh FasL, Bcl-2ThBax och kaspas-3 (1:100 utspädd med PBS) tillsattes och inkuberades vid 37 grader i 1 timme eller 4 grader över natten. Sektionerna tvättades 2–3 gånger med PBS (pH 7,2–7,6). Sedan tillsattes biotinylerad get-anti-mus IgG och sektionerna torkades vid 20–37 grader i 20 minuter och tvättades med PBS (pH 7,2–7,6) 4 gånger i 5 minuter. Efter noggrann tvättning i PBS inkuberades sektionerna med en blandning av reagens A och B i 30 minuter, inkuberades med PBS i 45 minuter och utvecklades slutligen med DAB-substrat (DAKO) i 30 minuter innan de motfärgades något med hematoxylin, dehydrerades, och monterad.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL KÄNNELSE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Bestämning av immunfunktioner

2.7.1. Beräkning av immunorganindex

En timme efter den sista administreringen bedövades råttorna genom intraperitoneal injektion av uretanlösning (20 gTh 100 ml), och sedan avlägsnades mjälten och tymuskörteln och vägdes omedelbart i en steril huva. Viktkoefficienterna för mjälten eller tymus (%) � mjälte eller tymus vikt (mg) Kroppsvikt (g).

2.7.2. Detektion av T-lymfocytundergrupper i perifert blod

Splenocyter och hemocyter inkuberades med de monoklonala antikropparna anti-CD4 (PE) och anti-CD8 (FITC) under 30 minuter i mörker. 2 ml erytrocytlysat tillsattes och lösningen blandades genom vortexning. Lösningen lämnades i mörker i 10 minuter och centrifugerades i 5 minuter. Supernatanten kasserades och sedan tvättades lösningen 3 gånger med iskall PBS och återsuspenderades i PBS-permeabiliserande lösning. Minst 10,000 celler analyserades med flödescytometri inom 1 timme efter varje Mab-färgning.

2.7.3. Bestämning av nivån av IL-10, IL-6, IL-2, TNF- och IFN-c i serum

En timme efter den sista administreringen bedövades råttorna genom intraperitoneal injektion av uretanlösning (20 gTh 100 ml), och blod togs från den abdominala aortan. Blodet centrifugerades vid 3500 r under 15 minuter för att erhålla serumet och lagrades vid -20 grader. Koncentrationerna av IL-10, IL-6, IL-2, TNF- och IFN-c detekterades med rått-ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.

2.8. Uttryck av CaM i hypotalamus och hypofysvävnader

Totalt RNA extraherades från hypotalamus och hypofysvävnader med TRIzol. Omvänd transkription utfördes på 10 μL totalt RNA enligt tillverkarens instruktioner. Lika mängder cDNA analyserades via qPCR i närvaro av dsDNA-bindande färgämne (Promega, USA) och CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA) för att titta på de olika generna under betingelserna för initial aktivering vid 95 grader i 10 minuter, 40 cykler av denaturering vid 95 grader i 15 s, och hybridiseringsförlängning vid 60 grader i 1 min.

Primers för CaM och -aktin ges i tabell 1, och -aktin användes som en intern kontroll. Varje prov normaliserades genom att använda skillnaden i kritiska trösklar (Ct) mellan målgenen och -aktin. Följande ekvation användes för att beskriva resultatet: ΔΔCt � (Ct-målgen - Ct-aktingen) experimentell grupp - (Ct-målgen - Ct-aktingen) kontrollgrupp. mRNA-nivåerna för varje prov jämfördes sedan med användning av uttrycket 2- ΔΔCt målgen. Resultaten för varje grupp togs i medeltal (tabell 3).

2.9. Statistisk analys

All data analyserades med SPSS-programvara (version 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Skillnader mellan grupper analyserades med envägsanalys av upprepade åtgärder (ANOVA). Resultaten uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (SD) med GraphPad Prism-programvara (version 6.0, San Diego, CA, USA). Skillnader med ett P-värde mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikanta.

3. Experimentella resultat

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalys

För att uppnå den bästa separationen, toppformen och en kort analystid studerades kromatografiska förhållanden inklusive kolonn, mobil fas och gradientprogram i vårt preliminära experiment. De typiska kromatogrammen med MRM-läge presenteras i figur 1.

Från tabell 4 kan vi se att innehållet av fenyletanoidglykosider i WCD ökade jämfört med CD, särskilt för echinakosid och acteosid, medan innehållet av iridoider minskade i WCD.

3.2. Reglering för HPA-axelfunktion

3.2.1. Test av vikt, temperatur och hållkraft

Råttorna i MC-gruppen och experimentgrupperna visade njure-yang-bristsymptom gradvis efter att de fått kortikosteron. Symtomen, såsom viktminskning, hypotermi, förlust av hårglans, hängande ande, eftersläpning av svar och en signifikant minskning av vattenförbrukning och aktivitet, förbättrades avsevärt i CD- och WCD-grupperna. Figur 2(a) visar viktförändringarna. Vikten av var och en av läkemedelsgrupperna ökade, särskilt i CDHD- och WCD-HD-grupperna. Viktuppgången i MC-gruppen var lägst. Figur 2(b) visar temperaturförändringarna, som var de lägsta i MC-gruppen, och temperaturen ökade i grupperna WCD-HD, WCD-MD och WCD-LD.

Figur 2(c) visar att hållkraften ökade för BC-gruppen och var och en av experimentgrupperna, och WCD-MD-gruppen var den högsta, vilket visade att tecken på svaghet inducerade av njur-yang-brist förbättrades efter administrering.

3.2.2. Nivåer av T, CRH, ACTH, CORT och kortisol

Figur 3 visar att jämfört med BC-gruppens nivåer av T, CRH, ACTH och CORT i råttserum minskade (P < 0.01) och kortisolnivån minskade (P < 0.05) i MC-gruppen. Jämfört med de i MC-gruppen ökade nivån av T i WCD-HD- och WCD-MD-grupperna (P < 0.01), nivån av CRH i WCD-LD, WCD-MD- och WC-grupperna förbättrades (P < 0.01), innehållet av ACTH ökade i CD-HD-, WCD-MD- och WCD-HD-grupperna (P < 0.01), CORT-nivån uppgraderades i CD-MD-, WCD-MD- och WCD-HD-grupper (P < 0,01) och förstärkt i CDHD- och WCD-LD-grupperna (P < 0,05), och kortisolnivån ökade i var och en av läkemedelsgrupperna.

3.2.3. Resultat av mikroskopobservation

Binjurevävnad kan delas in i kortikala skiktet och medulla skiktet. De kortikala skikten inkluderar globulära, bunt- och retikulära skikt. Cellerna innehåller fler lipider, och märglagret består till största delen av feokromocytomceller och en liten mängd fibrös vävnad. Som visas i figur 4 fann vi att allt var normalt i BC-gruppen, medan binjurebarken i MC-gruppen hade uppenbar hyperplasi, cellulär atrofi och ökande täthet. Den lökformiga remsan tjocknade och den genomskinliga fascikulära zonen, smala zona reticularis och mindre celler visade ojämn färgning och kapillärstockning. I PC-gruppen var de kortikala och medullära gränserna synliga. Cellerna i de klotformade banden och buntbanden arrangerades jämnt och den morfologiska strukturen hade återställts. Samma bättre restaurering observerades i WCD-grupperna, och effekterna i WCD-MD-gruppen var bättre än i WCD-HD- och WCD-LD-grupperna. Binjurens morfologi i CD-grupperna var inte lika bra som i WCD-grupperna.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%