Liang Qingsong 1,2,4, Pan Yingjie 2,4, Chen Ziying 2,4, Zhang Ying 1,3, Wu Menghua 1,3, Cao Hui 1,3, Ma Zhiguo 1,3*

(1. School of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong; 2. Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd., Foshan 528244, Guangdong; 3. Lingnan Traditional Chinese Medicine Research Center, Jinan University, Guangzhou 510632, 4 Guangdong. Key Laboratory of Guangdong Traditional Chinese Medicine Formula Granules Enterprise, Foshan 528244, Guangdong)

Abstrakt: Mål Att förbereda cistanche deserticola standardavkok och tillhandahålla en pålitlig metod för dess kvalitetskontroll. Metoder Enligt beredningskraven för standardavkoket bereddes 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok. Innehållet av echinasid och pilosid i standardavkoket bestämdes med HPLC, överföringshastigheten beräknades, extraktionshastigheten och pH-värdet för avkoket mättes och UPLC-fingeravtrycket för Cistanche deserticola standardavkok fastställdes. Resultat Den genomsnittliga överföringshastigheten för echinasid och pilosid i 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok var 22,99 procent respektive 17,{{20}}9 procent. Extraktionshastigheten varierade från 25,1 procent till 56,6 procent, och pH-värdet varierade från 4,30 till 5,15. Det finns 6 vanliga toppar i fingeravtrycket, och bland dem identifieras topp nr 1 som echinacea-glykosid, topp nr 3 identifieras som angiocyanin A, topp nr 4 identifieras som pilosid och nr 5 toppen identifieras som isopilosid. Likheten mellan 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok utvärderades, och likheten varierade från 0,789 till 0,999. Slutsats Beredningen av Cistanche deserticola standardavkok är standardiserat, med god övergripande homogenitet, kontrollerbar kvalitet, god noggrannhet, stabilitet och repeterbarhet av bestämningsmetoden och hög fingeravtryckslikhet, vilket kan ge en referens för kvalitetskontrollen av Cistanche deserticola standardavkok .

Nyckelord: Cistanche deserticola; Standard avkok;Echinacoside; Pilosid; Fingeravtryck; Kvalitetsutvärdering

"Cistanche deserticola är en torr, fjällande, köttig stam av släktet Cistanche i Orobaceae eller Cistanche tubulosa ma. Den har effekterna att tonifiera njurens yang, gynna blodessens, fukta tarmarna och lindra förstoppning. Det används ofta vid impotens. , infertilitet, ömhet i midjan och knäna, muskel- och skelettsvaghet, och tarmtorrhet och förstoppning."

cistanche pulver hälsofördelar—tonifierande njure

Klicka här för att se produkter från Cistanche for Kidney disease

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Den innehåller huvudsakligen fenyletanoidglykosider, bensylalkoholglykosider, iridoider och deras glykosider, lignin och dess glykosider och andra föreningar. Bland dem,fenyletanoidglykosideranses vara de viktigaste effektiva komponenterna i Cistanche deserticola ma.

Fenyletanolglykosid är den huvudsakliga aktiva komponenten i Cistanche deserticola

Standardavkoket av traditionell kinesisk medicinskivor (dvs standardavkoket) är ett enda avkok av traditionella kinesiska medicinskivor framställda genom standardiserade processer, vägledd av teorin om traditionell kinesisk medicin och baserat på klinisk tillämpning, med hänvisning till moderna extraktionsmetoder. På grund av det faktum att standardavkoket inte har någon hjälpämnesinterferens och inte genomgår en torkningsprocess, överensstämmer det med traditionellt avkok för klinisk användning, och det är lätt att testa olika ideala koncentrationer genom beredning av skivor eller extrakt. Därför är standardavkoket av traditionell kinesisk medicinskivor, som kvalitetsstandard för klassiska Ming Fang-preparat och standardreferens för att mäta traditionell kinesisk medicinformelpartiklar, för närvarande en effektiv form för att säkerställa säkerheten, effektiviteten och stabiliteten hos traditionell kinesisk medicin för att uppnå konsekvens i klinisk effekt. För närvarande finns det inga litteraturrapporter om studiet av standardavkok av Cistanche deserticola avkok.Detta experiment förberedde motsvarande standardavkok för 14 partier Cistanche deserticola och genomförde forskning om standardavkoket för Cistanche deserticola, i syfte att upprätta kärnprover av kvalitetsmarkörer för Cistanche deserticola, vilket ger en experimentell grund för utvecklingen av Cistanche deserticola-formelgranulat .

Cistanche pulver

1.Apparater och material

1.1 Instrument och utrustning

Waterse2695 högpresterande vätskekromatografi (vatten); ME204E 1/10000 balans (Mettler Toledo); XP26 miljonte skala (Mettler Toledo); WatersAcquire UPLC Ultra High-Performance Liquid Chromatography (WATSCH); KQ-500E Ultrasonic Cleaner (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.).

1.2 Reagens och material

Echinacosidereferensämne (batchnummer: S-003-190403),antocyaninEtt referensämne (batchnummer: G-066-181216),Akteosidreferensämne (batchnummer: M-011-181106), ochisopilosidreferensämne (batchnummer: Y{{0}}) köptes alla från Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd., med en renhet på mer än 98,0 procent. Kromatografisk ren myrsyra, Tianjin Kemio Chemical Reagent Co., Ltd; Kromatografisk ren metanol, Merck Co., Ltd; Det experimentella vattnet är ett laboratoriesystem för ultrarent vatten, Merck Co., Ltd; Andra reagens är analytiskt rena. I denna studie samlades totalt 14 partier av beredda bitar av Cistanche deserticola från marknaden och identifierades av professor Ma Zhiguo vid Jinan University som de torkade, fjällande, köttiga stjälkarna av släktet Cistanche deserticola eller Cistanche tubulosa, en växt av släktet Cistanche i familjen Orobaceae. Exempelinformation (se tabell 1).

Echinoside, den huvudsakliga kemiska komponenten i Cistanche deserticola

2 .Metoder och resultat

2.1 Beredning av standardavkok och testlösning

2.1.1 Beredning av Cistanche deserticola standardavkok:

Ta 100 g av de beredda skivorna av Cistanche deserticola enligt bestämmelserna om hantering av avkoksrum för traditionell kinesisk medicin i medicinska institutioner, tekniska krav för kvalitetskontroll och standardformulering av granulat av traditionell kinesisk medicinformler och standardsoppa för traditionell kinesisk medicin , lägg dem i en elektrisk keramikgryta, tillsätt vatten för att avkoka två gånger, tillsätt 9 gånger vattnet för första gången, blötlägg i 30 minuter, värm och koka med Wuhuo (500W), håll dem lätt kokande under mild värme (200W), fortsätt avkoka i 60 min, och filtrera den avkokta vätskan genom en 350 mesh sikt medan den är varm. Tillsätt 7 gånger mängden vatten för andra gången, värm det över en varm eld och låt det koka upp. Byt till låg värme och håll det lite kokande. Fortsätt koka i 40 minuter. Filtrera avkoket med en 350 mesh sil medan det är varmt, och kombinera de två avkokarna. Överför avkoket till en 2000 ml rundbottnad kolv, använd en rotationsindunstare för att minska trycket och koncentrera vid låg temperatur (temperatur: 60 grader; vakuumgrad: - 0.10 MPa) till en konstant volym på 500 ml och skaka väl. .

Tabell 1 Provinformation om Herba Cistanche

2.1.2 Beredning av testlösningen av Cistanche deserticola avkoksbitar:

Ta cirka 1 g av pulvret av Cistanche deserticola (siktat genom en fjärde sikt), väg det noggrant, placera det i en 100mL brun mätkolv, tillsätt noggrant 50mL 50 procent metanol, stäng locket, skaka väl , väg vikten, blötlägg i 30min, ultraljudsbehandling i 40min (effekt: 250W, frekvens: 35kHz), kyl den, väg vikten igen, tillsätt 50 procent metanol för att kompensera den förlorade vikten, skaka ordentligt, låt den stå, ta supernatanten, och späd den med 0,22 μM mikroporös membranfiltrering, erhållen.

2.1.3 Beredning av testlösningen av Cistanche deserticola standardavkok:

Ta standardcistanchesoppan, skaka väl, mät noggrant upp 5mL till 50mL i en mätkolv, tillsätt vattenfri etanol för att späda ut till skalan, skaka väl och späd med 0,22 μM mikroporös membranfiltrering.

2.1.4 Beredning av referenslösning:

Ta en lämplig mängd echinacea-glykosidkontrollprov och poolsidekontrollprov, väg dem noggrant, placera dem i en 10 ml brun mätkolv, lös upp dem med 50 procent metanol och späd till vågen, skaka väl och förbered en lösning med koncentrationerna 0,0200 och 0,02100 mg · ml - 1 för de två ovanstående komponenterna respektive för att erhålla en blandad kontrolllösning.

Acteosid, den huvudsakliga kemiska komponenten i Cistanche deserticola

2.2 Innehåll i Echinosid- och Pilosidkomponenter

Innehållsbestämningsmetoden för Cistanche deserticola i volym I av den kinesiska farmakopén (2015 upplagan) utfördes med hjälp av Agilent ZORBAXB-C18 kromatografikolonn (4,6 × 150mm,5 μm) med användning av metanol som den mobila fasen A och 0,1 procent myrsyralösning som den mobila fasen B, utfördes gradienteluering (0 till 17 min, 26,5 procent A; 17 till 20 min, 26,5 procent → 29,5 procent A; 20 till 27 min, 29,5 procent A); Flödeshastighet: 1,0mL · min-1; Kolumntemperatur: 30 grader ; Detektionsvåglängd: 330 nm; Antalet teoretiska plattor beräknat baserat på toppen av echinacea bör inte vara mindre än 3000. Innehållet av echinacea-glykosid och poolside i de preparerade bitarna av Cistanche deserticola och deras standardavkok bestämdes, och resultaten visades i tabell 2.

2.3 Bestämning av utvärderingskarakteristiska parametrar för standardavkok av Cistanche deserticola avkoksbitar

Tabell 2 Kvalitetsanalysresultat av Herba Cistanche och dess standardavkok (n=2)

2.3.1 Klistras avkastning:

Skaka standardsoppan Cistanche deserticola beredd under 2.1.1 väl, sug noggrant 100 ml, lägg den i en förångningsskål med konstant vikt (vikt: m1), indunsta den i ett vattenbad, torka den i en ugn vid 105 grader i 3 timmar, ta den, placera den i en torktumlare för att svalna och torka i 30 minuter, väg den, anteckna dess vikt som m2 och vikten av det medicinska materialet som M. Enligt formeln "Gräddutbyte=(m2 m1 )" × 500/(100 × M) × Beräkna pastahastigheten med "100 procent " och ta medelvärdet efter 2 parallella kopior av varje prov. Resultat (se tabell 2).

2.3.2 Överföringshastighet:

Baserat på ovanstående mätresultat av innehållet av echinacea-glykosider och -pilosider, beräknades överföringshastigheterna för echinacea-glykosider och -pilosider enligt formeln för överföringshastighet (överföringshastighet=kvalitet på indikatorkomponenter i Cistanche deserticola standardavkok/kvalitet av indikatorkomponenter i avkoksbitar × 100 procent), 2 parallella kopior för varje prov. Resultat (se tabell 2).

2.3.3 pH-värde:

Skaka Cistanche deserticola standardavkok som framställts enligt 2.1.1 jämnt, ta en lämplig mängd, mät pH-värdet med en pH-mätare och ta ett medelvärde. Varje prov är uppdelat i två delar parallellt. Resultat (se tabell 2).

2.4 Etablering av UPLC-fingeravtryck av Cistanche deserticola standardavkok

2.4.1 Kromatografiska förhållanden:

Använda en WatersHSST3-kolonn (2,1 × 100mm,1,8 μm); Med användning av metanol som mobil fas A och 0,1 procent myrsyralösning som mobil fas B, utfördes gradienteluering (0 till 4 min, 34 procent A; 4 till 10 min, 34 procent → 40 procent A; 10 till 15 min, 40 procent → 46 procent A; 15 till 17 min, 46 procent → 34 procent A; 17 till 20 min, 34 procent A); Flödeshastighet: 0,3mL · min-1; Kolumntemperatur: 30 grader ; Detektionsvåglängd: 330 nm; Injektionsvolym referenslösning 1 μ 50. Injektionsmängd av testlösning 0,4 μ L.

2.4.2 Beredning av referenslösning:

Ta en lämplig mängd av kontrollämnena Echinacetin, Angiosid A, Piloside och Isopilosid, väg dem noggrant, placera dem i en 10mL brun mätkolv, lös upp dem med 50 procent metanol, späd ut dem till skalan, skaka väl och förbered lösningar med koncentrationerna av ovanstående fyra komponenter av 0.196, 0.234, 0.228 respektive 0.213 mg · ml - 1, för att erhålla en blandad kontrolllösning.

2.4.3 Beredningen av testlösningen är densamma som i punkt 2.1.3.

2.4.4 Precisionstest:

Ta testlösningen av samma sats av Cistanche deserticola standardavkok (GH{{0}}) och injicera den sex gånger kontinuerligt enligt de kromatografiska förhållandena i 2.4.1. Använd poolside (topp 4) som referenstopp, beräkna att RSD för den relativa retentionstiden för varje gemensam topp är mindre än 0,2 procent och RSD för den relativa topparean är mindre än 5,0 procent, indikerar att instrumentet har god precision.

Experimentell studie på Cistanche deserticola

2.4.5 Stabilitetstest:

Ta testlösningen av samma sats av Cistanche deserticola standardavkok (GH{{0}}) och injicera den vid 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 och 28 timmar efter beredning enligt de kromatografiska förhållandena i 2.4.1. Använd poolside (topp 4) som referenstopp, beräkna att RSD för den relativa retentionstiden för varje gemensam topp är mindre än 0,3 procent och RSD för den relativa topparean är mindre än 4,8 procent, vilket indikerar att testlösningen har bra stabilitet inom 28 timmar.

2.4.6 Repeterbarhetstest:

Ta samma sats av Cistanche deserticola standardavkok (GH{{0}}), förbered 6 delar av lösningen parallellt enligt metoden i punkt 2.1.3, analysera enligt de kromatografiska förhållandena i punkt 2.4. 1, spela in kromatogrammet och beräkna att RSD för den relativa retentionstiden för varje gemensam topp är mindre än 0,2 procent och RSD för den relativa topparean är mindre än 3,8 procent. Resultaten visar att metodens repeterbarhet är god.

2.4.7 Fastställande av fingeravtryck:

Bered testlösningen av 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok enligt punkt 2.1.3 och injicera provet för bestämning enligt de kromatografiska förhållandena i punkt 2.4.1 för att erhålla UPLC-fingeravtrycket av 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok. UPLC-fingeravtryckskromatogrammen för 14 satser av testlösningen importerades till programvaran "Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System" (version 2{{10}}12), med SI som referenskromatogram, toppmatchning var utfördes med en tidsbredd på 0.1, och medianmetoden användes för att generera referensfingeravtrycket R för Cistanche deserticola standardsoppa (se figur 1). Samtidigt beräknades likheten och resultaten (se tabell 3) erhölls. Från den matchande kartan kan man se att det finns 6 vanliga toppar i standardavkoket av Cistanche deserticola. Enligt topparean och retentionstiden för de sex vanliga topparna, beräknades den relativa retentionstiden (topptalet (genomsnittlig relativ retentionstid) som topp 1 (0.434), topp 2 (0 .643), topp 3 ({{40}}.919), topp 4 (1.000), topp 5 (1.635) respektive topp 6 (1.858); Relativ topp områden, [topptal (genomsnittlig relativ topparea)] var topp 1 (6,340), topp 2 (0.890), topp 3 (0,295), topp 4 ( 1.000), topp 5 (0,674) respektive topp 6 (0,0190). Bland dem identifierades topp 1 som echinacea-glykosid, topp 3 identifierades som antocyanin A, topp 4 identifierades som poolside, och topp 5 identifierades som isopilosid; Likhetsanalysen visade att likheten mellan de 14 satserna av standardavkok och kontrollkartan var mellan 0,789 och 0,999 (se figur 2).

Tabell 3    14 Likhet mellan UPLC-fingeravtryck av sats Cistanche deserticola standardavkok

Figur 1 UPLC-kromatogram av blandad referenslösning (A), cistanche deserticola standardavkok (B) och cistanche tubulosa standardavkok (C)

1. Echinosid; 3. Antocyanin A; 4. Physalis-glykosider; 5. Isopilosid

Figur 2    14 UPLC-fingeravtryck av satsen Cistanche deserticola standardavkok

3 .Diskussion

3.1 Beredning av standardavkok

Som kvalitetsstandard standardiserar standardavkoket av traditionella kinesiska medicinskivor olika kliniska medicineringsformer, vilket för närvarande är en av forskningshotspots inom området traditionell kinesisk medicin. Förberedelsen av standardavkok kräver att källan till avkoksbitarna är äkta och representativ. Därför inkluderar den kinesiska farmakopén 9 satser av beredd Cistanche deserticola och 5 satser beredd Cistanche deserticola. Före beredningen testades de beredda skivorna och alla uppfyllde kraven i 2015 års upplaga av den kinesiska farmakopén.

3.2 Undersökning av injektionsmängden av testlösningen

I innehållsbestämningstestet av indexkomponenterna i standardavkoket var provinjektionsmängden av testartikeln 10 μ. Vid L fanns det ingen topp vid poolen i standardavkokskromatogrammet för Cistanche deserticola, förutom för echinacea glykosid. Även om både echinacea-glykosid och poolside förekom i standardavkokskromatogrammet för Cistanche deserticola, var toppareorna för både echinacea-glykosid och poolside små, och det visade sig att en hög topp uppträdde vid lösningsmedelstopppositionen i kromatogrammet för testartikeln. Anledningen till analysen är att den konstanta volymen av testprovet är vattenfri etanol utan vatten, och den är oförenlig med beredningslösningsmedlet för kontrollprovet, 50 procent metanol, vilket resulterar i en signifikant lösningsmedelseffekt, vilket resulterar i att echinacea inte kvarhålls. och vid poolen. Vissa prover har toppar av echinacea och ger på grund av deras relativt höga innehåll och partiella retention. Justera testartikelns injektionsmängd till 5 respektive 3 μ L. Undersök elimineringseffekten av lösningsmedelseffekten, och resultatet visar att provinjektionsmängden för testartikeln är 3 μ. Vid L kan lösningsmedelseffekten elimineras, och toppen av echinacea kan vara normal, så provinjektionsmängden för testartikeln är inställd på 3 μ L. På samma sätt eliminerades lösningsmedelseffekten som genererades under fingeravtrycksbestämningen av standardavkoket genom att undersöka injektionsmängden av testlösningen, och den optimala injektionsmängden bestämdes till 0,4 μL.

3.3 Orsaker till den låga likheten mellan fingeravtryck av Cistanche deserticola standardavkok

Likheten mellan fingeravtryck från 14 partier av Cistanche deserticola och Cistanche tubulosa standardavkok varierade från 0.789 till 0.999. Den lägsta likhetsbatchen var RCR-9 med en standardsoppa på 0.789. Likheten mellan andra partier är över 0.98. Jämfört med andra prover är den övergripande likheten mellan RCR-9-standardsoppan inte hög. Från fingeravtryckskromatogrammet för RCR-9 standardsoppan kan det ses att den har två uppenbara toppar jämfört med andra prover vid retentionstider på 12.278 och 15.466. På grund av de komplexa kemiska komponenterna i traditionell kinesisk medicin leder skillnader i tillväxtmiljö, skördetid, bearbetningsmetoder etc. till olika materialansamling och komponentinnehåll i beredda skivor. Den låga likheten mellan RCR-9 standardsoppa kan bero på olika faktorer som gör att materialansamlingen i denna sats av beredda skivor skiljer sig från andra satser.

3.4 Kvalitetskontroll av Cistanche deserticola standardavkok

Detta experiment analyserade extraktionshastigheten, pH-värdet och överföringshastigheterna för echinacoside och poolside av 14 satser av cistanche deserticola standardavkok. Extraktionshastigheten för 14 partier av Cistanche deserticola standardavkok varierade från 25,1 procent till 56,6 procent. På grund av den låga sockerhalten i de beredda bitarna av Cistanche deserticola jämfört med de beredda bitarna av Cistanche deserticola, var extraktionshastigheten för standardavkoket av Cistanche deserticola deserticola lägre än den för standardavkoket av Cistanche deserticola. pH-värdet för 14 satser av Cistanche deserticola standardavkok varierade från 4,30 till 5,15, vilket indikerar att pH-värdet för Cistanche deserticola standardavkok var relativt stabilt. Den genomsnittliga överföringshastigheten av Echinacetin i 14 satser av Cistanche deserticola och Cistanche deserticola standardavkok var 22,99 procent, och den genomsnittliga överföringshastigheten för poolen var 17,09 procent. Bland dem var överföringshastigheten för indexkomponenter i standardavkoket som framställts av Cistanche deserticola-dekoktbitar relativt stabil, medan överföringshastigheten för indexkomponenter i standardavkoket som framställts av Cistanche deserticola-dekoktbitar var relativt stor bland satser.

4.Slutsats

I denna studie användes UPLC-metoden för att fastställa fingeravtrycket för Cistanche deserticola standardavkok, vilket på ett heltäckande sätt kan återspegla och utvärdera den interna kvaliteten hos Cistanche deserticola standardavkok. Resultaten av extraktionshastigheten, indexkomponentöverföringshastigheten och fingeravtrycksanalysen av standardcistanche-avkoket visade att den övergripande homogeniteten för de 14 satserna av cistanche-standardavkok som framställts var god, beredningsmetoden överensstämde med klinisk praxis och kvaliteten var kontrollerbar. Detta hjälper till att standardisera de olika formerna av cistanche-medicinering, säkerställa konsistensen av läkemedels kliniska effekt och lösa de kvalitetsskillnader som orsakas av olika produktionsprocesser och beredningsmetoder.

Stålmannen örter cistanche

referens

〔1〕Redigerad av National Pharmacopoeia Commission. Kinesisk farmakopé (del I) [S]. Peking: China Pharmaceutical Science and Technology Press, 2015135

〔2〕Li Chenghua, Liu Jinghui, Xu Zhenxia, ​​et al. Samtidig bestämning av fyra fenyletanolglykosider i Cistanche tubulosa med RP-HPLC. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2010, 30 (06): 1003-1006

〔3〕Ding Yan, Zhang Kaimei, Cang Xiaoxin, et al. Forskningsframsteg om kemiska beståndsdelar och biologiska aktiviteter av Cistanche L. Journal of Dalian University of Technology, 2016, 35 (06): 395-402

〔4〕Gao Yan, Guo Linong, Ma Shuangcheng, et al. Jämförande studie av tre arter av cistanche deserticola baserat på UPLC-karaktäristisk karta och huvudkomponentinnehåll ［ J ］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2019, 44 (17): 3749-3757

〔5〕Chen Shilin, Liu An, Li Qi, et al. Forskningsstrategi för standardavkok av traditionell kinesisk medicinskivor ［ J ］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41 (08): 1367-1375