Studie om de terapeutiska effekterna och mekanismerna av Cistanche Deserticola-extrakt på dexametason-inducerad sarkopeni hos möss

Abstrakt:Denna studie utforskadeterapeutisk effekt av Cistanche deserticola extrakt (CdE)på dexametason (Dex)-inducerad sarkopeni hos möss och den möjliga verkningsmekanismen. För det första studerades de farmakodynamiska komponenterna och viktiga mål av Cistanche med nätverksfarmakologi, och vägarna berikades för att förutsäga verkningsmekanismen för CdE. I djurförsök delades 50 KM möss slumpmässigt in i 5 grupper (kontrollgrupp, Dex-modellgrupp, CdE-högdosgrupp, CdE-medeldosgrupp och CdE-lågdosgrupp). Förutom kontrollgruppen injicerades de andra grupperna subkutant för att inducera sarkopeni efter 42 dagar, och de tre behandlingsgrupperna fick olika doser av CdE oralt samtidigt. Under experimentet testades djurets vikt, träningskapacitet och kroppssammansättning regelbundet. Efter att djuren hade avlivats beräknades muskelkoefficienten för bakbenen och histologi och relaterade genuttryckstester utfördes. Nätverksfarmakologiska resultat visar att CdE kan behandla sarkopeni genom att uppreglera IGF-1-relaterade signalvägar. Resultaten från djurförsök visar att CdE signifikant reverserar minskningen av magert kötthalt och muskelkoefficient orsakad av Dex, förbättrar träningskapaciteten, minskar fetthalten, förbättrar den histologiska statusen hos musklerna, uppreglerade IGF-1, MyoD och MyoG, och nedreglerade uttrycket av Atrogin-1 och MuRF-1. CdE har en terapeutisk effekt på Dex-inducerad muskelatrofi och kan förbättra muskelhistologisk morfologi, och dess verkningsmekanism kan vara aktiveringen av IGF-1 signalvägen.

Nyckelord: Cistanche deserticola extrakt; dexametason; sarkopeni; nätverksfarmakologi; IGF-1 väg

 

 

echinacoside fördel

 

1. Material och metoder

1.1 Reagens

Följande reagens användes i denna studie:

Dexametasonnatriumfosfatinjektion(Batch nr. 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Normal koksaltlösning(Batchnr. L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Vattenfri etanol, xylen, paraformaldehyd, ochglutaraldehyd– China National Pharmaceutical Group

Saltsyra(CAS: 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Hematoxylinfärgningslösning– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Eosin färglösning– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

812 epoxiharts inbäddningssats, uranylacetat– SPI Company

Molpure® RNA Extraction Kit, PrimeScript RT Kit, TB Green™ Premix Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology and Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 aktiva ingredienser av cistanche

 

1.2 Instrument

Huvudsaklig utrustning som används:

NK-10 analog push-pull-mätare– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

QMR06-060H kroppssammansättningsanalysator– Niumag Corporation

BA 210 digitalt trinokulärt mikroskop– Motic Group

JEM-1400 FLASH-transmissionselektronmikroskop– JEOL, Japan

QuantStudio™ 3 PCR-system i realtid– ThermoFisher Scientific

 

1.3 Nätverksfarmakologianalys

För att undersöka de aktiva föreningarna och potentiella mekanismer förCistanche tubulosavid behandling avsarkopeni, a nätverksfarmakologitillvägagångssätt användes:

Aktiva föreningaravCistanche tubulosascreenades med hjälp avTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP), med trösklar på:

Oral biotillgänglighet (OB) större än eller lika med 30 %

Läkemedelslikhet (DL) Större än eller lika med 0,18

Ytterligare förening ochmålinformationhämtades från:

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Sjukdomsrelaterade gener för sarkopenierhölls från:

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

GeneCards(https://www.genecards.org)

Analys av protein–proteininteraktion (PPI).utfördes viaSTRING databas(https://string-db.org).

A förening–mål–gen interaktionsnätverkbyggdes med hjälp avCytoscape 3.2.1.

Funktionell berikninggenomfördes med hjälp av:

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) förGenontologi (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) för väganalys

Resultaten visualiserades viaBioinformatik onlineverktyg(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubulosa

1.4 Förberedelse avCistanche tubulosaExtrahera (CdE)

DeCistanche tubulosaextraktet framställdes enligt följande:

Rå örtskivor (batchnr Y221217) köptes frånSichuan TCM Decoction Pieces Co., Ltd., och autentiserats av Prof. Yang Wenyu från Xihua University.

1 kg torkadCistanche tubulosapulveriserades och passerades genom en40-mesh sil.

A 1:20 material-till-vätska-förhållandeanvändes med50 % etanol-vattenlösning.

Blandningen varblötlagd i 30 min, följt avultraljudsextraktionpå55 grader, 250 W, för40 min.

Extrakt varcentrifugerades, filtrerades och koncentrerades under reducerat tryckvid 60 grader till en tjock pasta (densitet 1,2) med hjälp av en rotationsindunstare.

Det koncentrerade extraktet varfrystorkas under vakuum, vilket ger en finalextraktionseffektivitet på 40 %.

 

1.5 Djurexperimentell design

Totalt50 SPF-klassade KM-möss av hankön, 6 veckor gammal och vägande(22 ± 2) g, användes i denna studie (Animal License No.SCXK [Chuan] 2023-030). Alla djurförsök följdeFöreskrifter om administration av försöksdjurutfärdat av ministeriet för vetenskap och teknik i Folkrepubliken Kina och vargodkänd av djuretiska kommittén vid Xihua University(Godkännande nr: XH-2023-02-01).

Boendeförhållanden:Temperatur (26 ± 1 grad), luftfuktighet (50 ± 10%), 12 h ljus/mörker cykel, fri tillgång till mat och vatten.

Efter 7 dagars acklimatisering var mössenslumpmässigt indelade i 5 grupperbaserat på kroppsvikt.

Kroppsvikten registrerades dagligen och allmänna hälsotillstånd som beteende, pälskondition och matintag övervakades.

Behandlingsgrupper och doseringarär detaljerade iTabell 1.

Pådagar 40–42, motoriska funktionstester(greppstyrka och simning) genomfördes.

Pådag 43, efter 12 timmars fasta, registrerades kroppsvikt och kroppssammansättning. Möss bedövades sedan med eter och avlivades. Bilaterala bakbensskelettmuskler dissekerades snabbt och vägdes.

Devänster gastrocnemiuskapades längsgående och fixerades in3% glutaraldehydoch4% paraformaldehyd, respektive.

Dehöger gastrocnemiusfrystes vid -80 grader förqPCR-analys.

SEO-sökord:djurmodell av sarkopeni, KM-möss, muskelatrofiexperiment, muskelfunktionsbedömning, etisk djurforskning

akteosidfördelar

1.6 Kroppssammansättning och muskelindexmätning

Kroppsviktregistrerades dagligen under hela experimentet.

Innan offer,kroppssammansättning(mager massa och fettmassa) mättesdubbelt, ochmedelvärdespelades in.

Efter offer,bakbenets skelettmuskelvägdes.

Demuskelmassaindexberäknades med hjälp avCuadros formel [11]:

Muskelindex (%)=Muskelmassa/kroppsvikt × 100
(Ekvation 1)

SEO-sökord:mager kroppsmassa hos möss, muskelindexberäkning, kroppssammansättningsanalysator, sarkopenibiomarkörer

 

1.7 Motorns funktionstester

Att utvärderamuskelfunktion, utfördes följande tester mellan dag 40 och 42:

Simprov:

Varje mus varvägde, och enbelastning (5 % kroppsvikt i blyfolie)var fixerad till den distala tredjedelen av svansen.

Möss placerades i enbehållare med 25 graders vatten, på ett djup som är större än eller lika med 30 cm.

Simtidspelades in från inträde tills musen inte längre kunde flyta och började sjunka.

Varje mus testades en gång dagligen för3 dagar i följd, ochgenomsnitttogs som slutresultat.

Gripstyrketest:

Utförs med hjälp av enmanuell push-pull mätare.

Varje mus testadesfem gånger, med en150 sekunders vilamellan proven.

Degreppstyrka koefficientberäknades normalisera för kroppsvikt:

Grip Strength Coefficient=Grip Force / Kroppsvikt (N/kg)
(Ekvation 2)

SEO-sökord:simuthållighetstest, greppstyrka hos gnagare, muskelprestandamått, sarkopenimusmodell

 

1.8 Histologisk analys

Att bedömamorfologiska förändringar i muskelvävnadefter behandling medCistanche tubulosaextrakt (CdE):

Hematoxylin & Eosin (H&E) färgningutfördes på vävnad fixerad i4% paraformaldehyd.

Sektioner observerades under aljusmikroskop, ochmuskelfibers tvärsnittsareaanalyserades med hjälp avImageJprogramvara.

Förultrastrukturell analys, muskler fixerade i3% glutaraldehydefterfixades in1% osmiumtetroxid, uttorkad i aceton och inbäddad iEp812 harts.

Semitunna sektionervar färgade medtoluidinblåttför positionering.

Ultratunna sektionervar färgade meduranylacetat och blycitrat, och observerade med enJEM-1400FLASH transmissionselektronmikroskop.

Muskelfiberbreddmättes med hjälp av ImageJ.

SEO-sökord:skelettmuskelhistologi, HE-färgningsprotokoll, elektronmikroskopi i muskelforskning, muskelfibermorfologianalys

cistanche förmånslista

1.9 Analys av genuttryck

För att undersökamolekylära mekanismerav CdE i sarkopeni:

Frusna muskelvävnaderbröts mekaniskt under flytande kväve.

Totalt RNA extraherades med användning avTRIpure reagensenligt tillverkarens instruktioner.

cDNA syntetiserades med enomvänd transkriptionssats, ochqPCRutfördes med hjälp av enThermo Scientific PikoRealsystem.

GAPDHanvändes som en intern referensgen.

Primersekvenser förmuskelrelaterade generär listade iTabell 2.

SEO-sökord:qPCR för muskelatrofigener, GAPDH-referensgen, RNA-extraktion från muskel, genuttryck vid sarkopeni

 

1.10 Statistisk analys

Experimentella data analyserades med användning avenkelriktad ANOVA, följt avDunnetts multipla jämförelsetest.

A P-värde < 0,05ansågs statistiskt signifikant.

Alla statistiska analyser utfördes med användning avSPSS 23.0.

Histomorfometriska dataanalyserades med hjälp avImageJprogramvara.

SEO-sökord:statistisk analys i farmakologiska studier, SPSS i biomedicinsk forskning, ANOVA i djurstudier, ImageJ muskelanalys