Genkloning, funktionell identifiering, strukturell och uttrycksanalys av sackarossyntas från Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Expressionsanalys av CtSus i olika delar av Cistanche tubulosa och cellkultursystem under torkastress

4.1 Expressionsanalys av CtSus i olika delar av Cistanche tubulosa

In vitro bekräftade helcellstransformationsexperiment och enzymatiska katalytiska reaktionsexperiment att proteinet som kodas av CtSus-genen kan katalysera syntesen av UDP-glukos. För att ytterligare utforska sambandet mellan denna gen och biosyntesen av glykosidföreningar i Cistanche tubulosa analyserades uttrycksnivån för denna gen i olika delar av Cistanche tubulosa.

CISTANCHE HERBA AV HÖG KVALITET MED 10-98 % ECHINACOSIDE

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>antenn del; bland dem är halten av echinakosid i haustoria högst.

Realtidsfluorescenskvantitativ PCR utfördes med cDNA från olika delar av Cistanche tubulosa som mallar, och resultaten analyserades med 2-ΔΔCT-metoden och differentiell analys utfördes. Resultaten visas i figur 4A. Expressionsnivån för CtSus-genen i haustoria var den högsta, 1,5 gånger den för luftdelen, och uttrycksnivån i den underjordiska delen var signifikant högre än den i luftdelen, vilket överensstämmer med ackumuleringsmönstret av fenyletanoidglykosider representeras av echinacoside i olika delar av Cistanche tubulosa.

Figur 4 Relativa uttrycksnivåer av CtSus i olika delar av C. tubulosa och suspensionsceller behandlade med PEG6000. A: Relativ uttrycksnivå av CtSus i olika delar av C. tubulosa; B: Relativ uttrycksnivå av CtSus i C. tubulosa suspensionsceller behandlade med PEG6000 vid olika tidpunkter. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 Expressionsanalys av CtSus i Cistanche deserticola suspensionsceller under torkastressförhållanden

Preliminär forskning om projektet visade att torkstress inducerad av PEG6000 avsevärt kan öka ackumuleringen av fenyletanolglykosider i Cistanche deserticola suspensionsceller. Från 3 till 9 dagar efter induktion ökade echinaceasidehalten signifikant. Från den 12:e till den 15:e dagen avtog tillväxthastigheten för echinakosidinnehållet och nådde maxvärdet på den 15:e dagen. Sedan, när odlingstiden ökade, ökade echinakosidhalten avsevärt. Innehållet av fruktosid minskade gradvis [24]. Baserat på denna forskning använde denna artikel cDNA från obehandlade Cistanche deserticola-suspensionsceller och PEG6000--inducerade Cistanche deserticola-suspensionsceller som mallar för att utföra kvantitativ PCR-detektion i realtid för att undersöka CtSus-genen i Cistanche deserticola-suspensionsceller under torkstressförhållanden. Förändringar i uttrycksnivåer. Resultaten visas i figur 4B. I Cistanche deserticola-suspensionsceller inducerade av PEG6000 ökade uttrycket av CtSus signifikant på den 6:e dagen efter induktion, nådde det högsta värdet på den 9:e dagen och föll sedan tillbaka till samma nivå som kontrollen. Grupper på samma nivå. Ovanstående resultat visar att torkstress avsevärt kan öka uttrycket av CtSus-genen i Cistanche deserticola-suspensionscellinjen, vilket överensstämmer med ackumuleringsmönstret av echinaceaside under torkstress. Emellertid uppträder topputtrycket av CtSus-genen tidigare än toppen av echinaceasidinnehållet, eftersom den aktiva glykosyldonatorn som syntetiseras genom CtSus-katalys är en viktig prekursor som krävs för flerstegsglykosyleringsreaktionen i den efterföljande biosyntetiska vägen för echinaceaside. , spekuleras det att organismer efter att ha utsatts för torkstress i första hand kommer att mobilisera gener relaterade till primär metabolism för att uppnå ackumulering av aktiva donatorer, och sedan uppnå viktig sekundär metabolismackumulering av metaboliska produkter.

5 Studie av den tredimensionella strukturen av CtSus-protein och analys av viktiga aktiva platser

Baserat på funktionen av CtSus för att katalysera produktionen av glykosyldonator UDP-glukos, studerades den strukturella grunden för CtSus katalytiska aktivitet ytterligare. Onlineverktyget SOPMA användes för att förutsäga proteinets sekundära struktur. Resultaten visade att den sekundära strukturen av CtSus innehöll 55,28% -helixar, 25,47% slumpmässiga spolar, 12,80% förlängda strängar och 6,46% -varv (Figur 5A), vilket indikerar att -helixar är de viktigaste sekundära strukturella enheterna i CtSus-protein, följt av slumpmässiga spolar, som också står för en stor del av proteinet. Förlängda strängar och -varv är fördelade över hela proteinet. Enligt befintliga studier finns sackarossyntas vanligtvis i form av en tetramer, vilket anses vara dess aktiva form. Därför använde detta dokument ytterligare AlphaFold2 för att förutsäga strukturen av CtSus-protein och erhöll dess tredimensionella struktur av proteintetramerer. PDB (Protein Data Bank) databasjämförelse fann att sekvenslikheten mellan Arabidopsis thaliana sackarossyntas AtSus1 (PDBID 3S28) och CtSus kan nå 77,93%. Den förutspådda CtSus-strukturen jämfördes med den tredimensionella AtSus1-strukturen, och värdet för rotmedelkvadratavvikelse (RMSD) efter proteinsuperposition var 1,11 Å, vilket indikerar att de rumsliga strukturerna för de två är mycket konsekventa (Figur 5B).

Figur 5 Strukturell undersökning av CtSus. A: Förutspådd sekundär struktur av CtSus med hjälp av SOPMA.Blue: helix; Lila: Slumpmässig spole; Röd: Förlängd sträng; Grön: ark. B: Tredimensionell strukturanpassning av AtSus1 (i blå färg) och CtSus (i grön färg). Båda visades som en tetramer.C: Nyckelrester i substratbindningsfickan hos AtSus1 (i blå färg) och CtSus (i grön färg med märkta rester); D: Bindande konformationsanpassning av UDP och fruktos i AtSus1 (i blåfärg) och CtSus (i grön färg); E: Interaktioner mellan UDP och CtSus visas i 2D-diagram analyserat av Discovery Studio Client

Den rapporterade protein-ligandkristallkomplexstrukturen för Arabidopsis AtSus1 med UDP och fruktos (PDBID3S29) användes som mall [16] för att analysera bindningssättet för CtSus med UDP och fruktos. De molekylära dockningsresultaten visas i figur 5C. Det kan observeras att de substratbindande fickorna hos AtSus1 och CtSus är mycket lika vad gäller aminosyratyp, rumslig fördelning och konfiguration, och överlappningen är hög, vilket bevisar att sekvensen av sackarossyntas är mycket konserverad i växter. Konformationerna av de två liganderna, UDP och fruktos, i proteinsubstratbindningsfickan visas i figur 5D. Den mest fördelaktiga konformationen för molekylär dockning av UDP och CtSus överlappar väl med konformationen av UDP i AtSus1-UDP-kristallkomplexet, vilket bevisar noggrannheten hos de molekylära dockningsresultaten. Interaktionen mellan UDP och nyckelaminosyraresterna i proteinsubstratbindningsfickan visas i figur 5E. UDP och CtSus är huvudsakligen sammanbundna av vätebindningar och hydrofoba interaktioner. Nyckelaminosyraresterna i substratbindningsfickan inkluderar Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 och Glu681.

Diskussion

Glykosyleringsmodifiering är ett av de viktiga sätten att förbättra de fysiska egenskaperna och biologiska aktiviteterna hos naturliga produkter eller läkemedelsprekursorer. Jämfört med traditionella kemiska metoder har enzymatisk glykosyleringsmodifiering fördelarna med milda reaktionsförhållanden, stark selektivitet och miljövänlighet. Emellertid kräver glykosyleringsreaktionen av glykosyltransferas en stor mängd UDP-sockerdonatorer, vilka är dyra och svåra att erhålla, vilket resulterar i det faktum att glykosyltransferaser inte kan användas i stor utsträckning i industriell produktion. Sackarossyntas kan katalysera den reversibla reaktionen: sackaros + UDP ⇌ UDP-glukos + fruktos och kan bilda en förnybar UDP-glukoscykel genom en kopplingsreaktion med glykosyltransferas. Cistanche tubulosa är rik på en mängd olika glykosidföreningar av olika strukturella typer, representerade av fenyletanolglykosidföreningar, vilket tyder på att den aktiva glykosyldonatorsyntesvägen i dess kropp som involverar sackarossyntas har en stark metabolism, men det relevanta sackarossyntaset från Cistanche-växter har inte rapporterats. I denna studie klonades en sackarossyntasgen CtSus från Cistanche tubulosa för första gången. Proteinet som kodas av denna gen innehåller den konserverade domänen av växtsackarossyntas. Genom att jämföra sekvensen av sackarossyntaser från andra växter fann man att aminosyrasekvenslikheten mellan den och sackarossyntaser från växter av samma ordning var mer än 90 %, vilket indikerar en hög grad av sekvenskonservering av sackarossyntaser från växter. Molekylär evolutionsanalys visade att CtSus tillhör den tvåhjärtbladiga växtens sackarossyntasgren och är närmast besläktad med sackarossyntaset PrSus från P. ramosa av familjen Orobanchaceae.

För att utforska den katalytiska aktiviteten av CtSus kombinerade denna studie glykosyltransferaset UGT71BD1, vars aktivitet tidigare har verifierats av forskargruppen, för att konstruera ett dubbelplasmid-samuttryckssystem. Genom helcellskatalytiska experiment uppnåddes villkoren utan att lägga till ytterligare UDP-sockerdonatorer. Glykosyleringsreaktion av kumarinförening kanel och stilbenförening resveratrol. Jämfört med kontrollgruppen ökade tillsatsen av CtSus signifikant omvandlingshastigheten för UGT71BD1-katalyserade glykosyleringsreaktioner. På grundval av detta konstruerade denna studie ytterligare en CtSus rekombinant expressionsplasmid och uppnådde lösligt uttryck av det rekombinanta proteinet i E. coli. In vitro visar enzymatiska katalytiska reaktioner att i närvaro av sackaros och UDP kan CtSus katalysera genereringen av UDP-glukos, och efter att triggerfaktoraffinitetstaggen som finns i det rekombinanta proteinet har tagits bort, katalyserar produkten av CtSus genereringen av UDP -glukos erhålls. Priset har förbättrats avsevärt. Helcellstransformation och in vitro enzymatisk katalytisk reaktionsresultat bekräftade aktiviteten av CtSus som en sackarossyntas katalytiskt aktiv sockerdonator UDP-glukos. För att ytterligare utforska korrelationen mellan CtSus-genen och biosyntesen av glykosider i Cistanche tuberosum analyserades uttrycket av CtSus i olika delar av Cistanche tuberosum genom kvantitativa PCR-experiment med fluorescens i realtid. Resultaten visade att genen uttrycktes i haustoria av Cistanche tuberosum. Den högsta uttrycksnivån. Cistanche deserticola är en parasitisk växt och kan inte få de näringsämnen som krävs för tillväxt och utveckling genom fotosyntes. Därför måste den vara parasitisk på värdväxtens rötter och förlita sig på värdväxten för att få näringsämnen för att upprätthålla tillväxten. I växter ger sackaros främst energi och kolkällor [12]. Sackaros kan dock inte användas direkt av celler och måste sönderdelas ytterligare. Haustoria är bron som förbinder Cistanche deserticola och värdväxten och spelar en viktig roll i dess tillväxtprocess. avgörande

[25], därför är det höga uttrycket av sackarossyntas i haustoria av Cistanche deserticola rimligt. Det höga uttrycket av CtSus i haustorian överensstämmer också med det stora ackumuleringsmönstret av fenyletanoidglykosider i haustoria. Dessutom, genom fluorescenskvantitativ PCR-analys av förändringar i CtSus-genexpressionsnivåer i Cistanche deserticola suspensionsceller vid olika tidpunkter under torkastress, fann man att torkstress avsevärt kan öka uttrycket av CtSus-gener i suspensionscellinjen, vilket är överensstämmer med echinaceaside. Ackumuleringsmönstret i suspensionscellinjer under torkastress är konsekvent. Ovanstående resultat tyder på att CtSus är involverad i den biosyntetiska vägen för fenyletanoidglykosider representerade av echinacea i Cistanche tulipis in vivo. Det är en av många biosyntetiska vägar. Första stegets glykosyleringsreaktion ger den aktiva glykosyldonatorn UDP-glukos. Kort sagt, denna studie

Studien identifierade en ny sackarossyntasgen i Cistanche deserticola, som möjliggjorde in vitro enzymatisk syntes av aktiva glykosyldonatorer och gav nya genetiska element för konstruktionen av tekniska bakterier för biosyntesen av Cistanche deserticola-glykosider.

Författarbidrag: Tian Weisheng var ansvarig för bioinformatikanalys, uttrycksanalys, enzymaktivitetsanalys och skrivning av det första utkastet av CtSus-genen; Yan Yaru var ansvarig för genscreening och kloning; Cui Xiaoxue och Huang Wenqian deltog i bioinformatikanalys och uttrycksanalys; Wang Yingxia och Zhao Saijing deltog i vektorkonstruktion och enzymaktivitetsanalys; Li Jun och Shi Shepo ledde huvudsakligen enzymaktivitetsanalys och expressionsanalys; Tu Pengfei och Liu Xiao var ansvariga för pappersidédesignen, vägleda experiment och skriva och revidera uppsatsen. Alla författare deltog i revideringen av uppsatsen.

Referenser

[1] Song ZH, Lei L, Tu PF. Framsteg inom forskning om farmakologisk aktivitet i växter av CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Ketomjämförelse mellan odlad och vild Cistanchetubulosa med hjälp av ¹H-NMR-spektroskopi [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, från en utrotningshotad art till ett stort märke av kinesisk medicin [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Cistanche deserticola polysackarider skyddar PC12-celler mot OGD/RP-inducerad skada [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolution av växtnukleotid-socker-interkonversionsenzymer [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Växtnukleotidsockerbildning, interkonversion och räddning genom sockeråtervinning [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Biokemisk karakterisering av UDP-GlcNAc/Glc4-epimeras från Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Identifiering av UDP-N-acetylglukosamin4-epimeras som är involverat i exosporiumproteinglykosylering i Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Transkriptomomfattande identifiering av sackarossyntasgener i Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sackarossyntas: ett unikt glykosyltransferas för utveckling av biokatalytisk glykosyleringsprocess [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosyntesen av sackaros [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.