Genkloning, funktionell identifiering, strukturell och uttrycksanalys av sackarossyntas från Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultat och analys

1 Brytning av sackarossyntasgener i Cistanche tubulosa och kloning av CtSus-genen

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>antenn del.

Högkvalitativ Cistanche Tubulosa för mäns hälsa

Därför normaliserades uttrycksnivån FPKM-värden för de två kandidatsackarsyntasgener som erhölls i den initiala screeningen i transkriptomdata från olika delar av Cistanche tubulosa med Z-Score och differentiell analys utfördes (Figur 1A). Resultaten visade att CtSus-genen hade den högsta uttrycksnivån i haustoriet, och uttrycksnivån i den underjordiska delen var högre än den i luftdelen, vilket överensstämde med ackumuleringsmönstret av glykosidföreningar i olika delar av Cistanche tubulosa, medan expressionsnivån för CtSus1-genen i haustoriet var låg. Därför, baserat på ovanstående resultat, valdes CtSus-genen för efterföljande sekvensamplifiering, exogent uttryck och funktionell identifiering. Med användning av Cistanche tubulosa cDNA som mall erhölls en enkelbandsprodukt vid ~2500 bp efter PCR-amplifiering (Figur 1B). PCR-produkten utvanns från gel och ligerades till kloningsvektorn, och den fullängdskodande regionen av målgenen erhölls genom sekvensering. Längden på CtSus-sekvensen var 2418 bp.

Figur 1 Genutforskning och kloning av CtSus från C. tubulosa och bioinformatisk analys av dess kodade protein. A: Uttrycksnivåer av CtSus- och CtSus1-gener i olika delar av C. tubulosanormaliserades som Z-poäng baserat på deras FPKM-värden; B: Genamplifiering av CtSus; M: DNA-markör; C: Konservativ domän av CtSus-protein förutsagt av SMART; D: Multipelsekvensanpassning av CtSus och sackarossyntaser identifierade från andra växter inklusive Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum och Albuca bracteata. Sackarossyntesdomänen och sockeröverföringsdomänen representeras av röda respektive blå rutor; E: Fylogenetisk analys av CtSus och sackarossyntaser från andra växter; F: SDS-PAGE-analys av det heterologa uttrycket av CtSus med användning av pCold™ I-vektor i E. coli. Spår 1: Proteinmarkör; Spår 2: Supernatantfraktion; Bana 3: Precipitatfraktion. Den röda pilen visar CtSus-proteinet. G: Koloni-PCR av en enda klon innehållande båda två rekombinanta plasmider. M: DNA-markör; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabell 2 Aminosyrasekvenslikheter mellan CtSus och sackarossyntaser identifierade från andra växter

2.3 Filogenetisk analys

Det fylogenetiska trädet konstruerat av MEGA-mjukvaran användes för att analysera det fylogenetiska förhållandet mellan sackarossyntaset CtSus från Cistanche tubulosa och andra växthärledda sackarossyntaser. Resultaten visas i figur 1E. Växthärledda sackarossyntaser visar distinkta evolutionära grenar i tvåhjärtbladiga (region I och II) och enhjärtbladiga (region III). CtSus finns i den tvåhjärtade grenen, och de sekvenser som är närmast besläktade med CtSus är alla från Lamiaceae-växter (Cistanche tubulosa är en Lamiaceae Orobanchaceae-växt), medan den andra grenen huvudsakligen består av Solanales-växter, vilket ytterligare indikerar den höga bevarande- och homologi av växthärledda sackarossyntasgener i utvecklingen av växter i samma ordning. Bland dem är sackarossyntaset PrSus (AEN79500.1) från Phelipanche ramosa från Orobanchaceae-växten närmast släkt med CtSus.

3 Exogent uttryck och aktivitetsanalys av CtSus

3.1 Exogent uttryck av CtSus-genen pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus och pCold™ I-CtSus-plasmiderna verifierade genom sekvensering överfördes till den expressionskompetenta E. coli Transetta (DE3), och de positiva klonerna screenades med koloni-PCR för sekvenseringsverifiering. De erhållna rekombinanta expressionsstammarna inducerades av IPTG låg temperatur för proteinexpression, bakterierna samlades upp genom centrifugering och lysbufferten tillsattes för att bryta bakterierna för att erhålla supernatanten och fällningen, och SDS-PAGE utfördes för detektion. Resultaten visade att när pET-28a och pET-24b användes som expressionsvektorer uttrycktes inte CtSus i E. coli, medan när pCold™ I användes som expressionsvektor, en tydlig CtSus rekombinant proteinband detekterades i ~100 kDa-regionen, vilket överensstämde med dess teoretiskt förutspådda relativa molekylmassa på 92,2 kDa (Figur 1F).

3.2 Helcellstransformation

För att preliminärt verifiera den katalytiska funktionen av CtSus, konstruerades en co-expressionsstam av CtSus och glykosyltransferasgenen UGT71BD1. UGT71BD1 klonades och identifierades från Cistanche tubulosa och är ett UDP-glukosyltransferas som i stor utsträckning kan acceptera aromatiska föreningar som fenyletanoidglykosider, olika typer av flavonoider, stilben och kumarin som receptorer och katalyserar glukosyleringsreaktionen av substrat-hydroxyl-fenolgruppen med UGT71BD1. som sockerdonator [18]. Införandet av CtSus kan teoretiskt ge mer tillräcklig glykosyldonator UDP-glukos för glukosyleringsreaktionen som katalyseras av UGT71BD1, och därigenom främja reaktionsjämvikten att röra sig mot bildandet av glykosyleringsprodukter, och därigenom öka utbytet av glykosyleringsprodukter. pCold™ I-CtSus-plasmiden och pET-28a-UGT71BD1-plasmiden transformerades samtidigt till den expressionskompetenta E. coli Transetta (DE3). Enstaka kloner innehållande båda rekombinanta plasmiderna screenades med koloni-PCR, och positiva rekombinanta expressionsstammar erhölls genom sekvenseringsverifiering (Figur 1G). Samuttrycket med dubbel gen inducerades in vitro och pET-28aUGT71BD1 enkelgenexpressionsstammen användes som kontrollgrupp. Aktiviteten av CtSus för att katalysera genereringen av UDP-glukosdonator verifierades preliminärt genom helcellstransformation. Resultaten av HPLC och högupplöst masspektrometri visade att när helcellstransformationsreaktion utfördes med akonitin 1 och resveratrol 2 som substrat, detekterades genereringen av uppenbara glykosyleringsprodukter efter 24 timmars transformation, som visas i figur 2.

Figur 2 Helcellsbiotransformation av substrat 1 eller 2 genom rekombinant stam som hyser UGT71BD1 eller rekombinant stam som hyser UGT71BD1-koppling med CtSus, respektive. A: HPLC-kromatogram av helcellsbiotransformationen av substrat 1. Detektionsvåglängden var 360 nm; B: HRESI-MS och MS2-spektra av produkt la; C: HPLC-kromatogram av helcellsbiotransformationen av substrat 2; Detektionsvåglängden var 330 nm. D: HRESI-MS-spektra för produkterna 2a och 2b

När 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, molekylformel C9H6O4) användes som substrat, produktens kromatografiska topp 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, förutspådd molekylformel C15H16O9) detekterades vid 5,39 min, vilket överensstämde med UV absorption av substratet och kontrollprodukten. Samtidigt detekterades en fragmenttopp på m/z 179.033 4 [M+H]+ i MS2-spektrumet för 1a, vilket producerades genom att 1a förlorade en glukosmolekyl (162 Da), vilket indikerar att la var produkten av substrat 1 kopplat till en glukosmolekyl. Omvandlingshastigheten beräknades genom att integrera topparean. Det visade sig att omvandlingshastigheten för UGT71BD1-helceller som katalyserar substrat 1 för att generera glykosylerad produkt la var 71,87 %, medan tillsatsen av CtSus ökade omvandlingshastigheten för reaktionen till 95,84 %, 1,3 gånger den för kontrollgruppen. När substratet var förening 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, molekylformel C14H12O3), var produktens kromatografiska toppar 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, förutsagd molekylär formel C20H22O8) och 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, förutspådd molekylformel C26H32O13) i överensstämmelse med den karakteristiska UV-absorptionen av substratet och kontrollprodukten detekterades vid 10,32 respektive 6,52 min. . En fragmenttopp detekterades vid 3 [MH]-, som genererades genom förlust av en glukosmolekyl (162 Da), vilket indikerar att 2a var produkten av substrat 2 kopplat till en glukosmolekyl. Genom att jämföra med data i litteraturen [18] och masspektrometriförutsägelseinformationen, bestämdes det att produkt 2b var produkten av substrat 2 kopplat till två glukosmolekyler. Omvandlingshastigheten beräknades med hjälp av den integrerade topparean. Det visade sig att tillsatsen av CtSus kunde öka omvandlingshastigheten för glykosyleringsreaktionen av substrat 2 från 64,01 % till 78,51 %, bland vilka utbytet av monosackaridprodukt 2a ökade från 45,09 % till 63,58 %, och utbytet av disackaridprodukt 2b ändrades från 18,92 % till 14,93 %.

3.3 Rening av CtSus rekombinant protein och identifiering av enzymatisk aktivitet in vitro

Resultaten av helcellstransformationsexperimentet tyder på att CtSus har aktiviteten att katalysera produktionen av aktiv glukosdonator UDP-glukos. För att ytterligare direkt verifiera denna katalytiska aktivitet genom enzymatisk katalytisk reaktion in vitro, separerades fusionsproteinet från CtSus-genen i pCold™-expressionssystem och renades genom affinitetskromatografi. Resultaten visade att när pCold™ I användes som expressionsvektor, uttrycktes det rekombinanta proteinet i stora mängder, men mestadels i fällningen. När pCold™ TF användes som expressionsvektor, uttrycktes CtSus-genen i stora mängder i E. coli (Figur 3A). Fusionsproteinet renades genom HisTrap FF-affinitetskromatografi och utsattes för enzymatisk katalytisk reaktion in vitro. Resultaten visas i figur 3B. När sackaros och UDP användes som substrat, jämfört med den negativa kontrollgruppen, detekterades en ny produkttopp vid 10,32 min. Dess retentionstid och UV-absorption överensstämde med UDP-glukos. Produkten visade sig vara UDP-glukos vid jämförelse med standarden. Men eftersom fusionsproteinet uttryckt av pCold™ TF-expressionsvektorn innehåller en stor triggerfaktorlöslig tag (taggproteinstorleken är 48 kDa), kommer det att ha en stor inverkan på proteinets katalytiska aktivitet. Därför skars taggen av fusionsproteinet ytterligare av faktor Xa-enzym, och CtSus-proteinet utan exogena taggar renades (Figur 3A). Proteinet utsattes för enzymatisk katalys in vitro och resultaten visade att utbytet av UDP-glukos ökade från 3,53 % till 10,66 %

(Figur 3B). Ovanstående resultat bekräftade aktiviteten av CtSus för att katalysera produktionen av UDP-glukos genom in vitro enzymatisk katalys, och visade också att närvaron av en stor affinitetsmärkning bidrar till det lösliga uttrycket av CtSus, men det kommer också att signifikant påverka enzymets katalytiska aktivitet vitro.

Figur 3 Heterologt uttryck och funktionell identifiering av CtSus. A: SDS-PAGE-analys av CtSus-proteiner. Spår 1: Proteinmarkör; Bana 2: Rekombinant CtSus med triggerfaktor; Bana 3: Trigga faktortaggklyvning med faktor Xa-proteas för att ge CtSus-proteinet märkt med den röda pilen. B: Enzymatiska invitroanalyser med användning av fusionsprotein och triggfaktorfria CtSus-proteiner för att katalysera syntesen av UDP-glukos i närvaro av sackaros respektive UDP med referensstandard UDP-glukos. Kokt protein användes som kontrollgrupp under samma betingelser. Detektionsvåglängden var 260 nm