Ihållande cytotoxiskt svar från mononukleära celler i perifert blod från ovaccinerade individer som lagts in på intensivvårdsavdelningen på grund av kritisk covid-19 är avgörande för att undvika ett dödligt resultat

Abstrakt: Huvudsyftet med denna studie var att bestämma inverkan av den cytotoxiska aktiviteten hos perifera mononukleära blodceller (PBMC) på resultatet av ovaccinerade individer med kritisk covid-19 inlagda på intensivvårdsavdelningen. Blodprover från 23 individer togs vid inläggning och sedan varannan vecka i 13 veckor fram till döden (Exitus-grupp) (n=13) eller utskrivning (överlevnadsgrupp) (n=10). Vi hittade inga signifikanta skillnader mellan grupper i sociodemografiska, kliniska eller biokemiska data som kan påverka det dödliga resultatet. Direkt cellulär cytotoxicitet hos PBMC från individer i Exitus-gruppen mot pseudotypade SARS-CoV-2-infekterade Vero E6-celler reducerades emellertid signifikant vid inläggning (−2.69-faldigt; p=0. 0234) och efter 4 veckor på ICU (−5.58-faldigt; p=0.0290), i jämförelse med individer som överlevde, och det förbättrades inte under sjukhusvistelse. In vitro återställde behandling med IL-15 av dessa celler inte effektiv cytotoxicitet vid någon tidpunkt förrän det dödliga resultatet, och ett ökat uttryck av immunutmattningsmarkörer observerades i NKT, CD4+ och CD 8+ T-celler. IL-15-behandling av PBMC från individer i överlevnadsgruppen ökade emellertid signifikant cytotoxiciteten vid vecka 4 (6.18-faldigt; p=0.0303). Följaktligen kan immunmodulerande behandlingar som kan övervinna immunutmattning och inducera ihållande, effektiv cytotoxisk aktivitet vara avgörande för överlevnad under sjukhusvistelse på grund av kritisk covid-19.

Nyckelord: SARS-CoV-2; COVID-19; immunsvar; cytotoxiskt svar; IL-15

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

1. Introduktion

Flera fall av atypisk viral lunginflammation relaterade till ett utbrott på en skaldjursmarknad i Wuhan City (Hubeiprovinsen, Kina) upptäcktes i december 2019. Ett nytt coronavirus kallat allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) snabbt sprids över världen och orsakar pandemin av coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19) [1]. Sedan dess har cirka 626 miljoner fall av covid-19 och 6,5 miljoner associerade dödsfall rapporterats runt om i världen (uppdaterat oktober 2022) [2]. Olika riskfaktorer och komorbiditeter kan påverka utvecklingen av covid-19 bland individer, vilket påverkade jämförelsen av kliniska data mellan de drabbade länderna från början av pandemin [3]. Det fastställdes dock att de kliniska manifestationerna av covid-19 kan variera från asymtomatisk infektion till akut andnödsyndrom (ARDS) [4]. Bland de olika riskfaktorer som var associerade med en högre sannolikhet att utveckla en allvarlig form av covid-19 är ålderdom, manligt kön och tidigare komorbiditeter som diabetes, högt blodtryck och/eller fetma [5,6]. Allvarlig och kritisk covid-19 har också associerats med cytopeni, mestadels av CD4+ T-lymfocyter, samt med överdriven utmattning av naturliga mördare (NK) och CD8+ T-celler, vilket resulterar i ett immunsupprimerat tillstånd som inte kan rensa infektionen, förutom utvecklingen av allvarliga komplikationer som cytokinstorm och trombotiska händelser [7]. Den främsta orsaken till att utveckla en allvarlig form av sjukdomen och dödsfall hos patienter med covid-19 har ansetts vara en överdriven inflammatorisk respons som kan främja utvecklingen av chock och/eller hypercytokinemi med multiorgandysfunktion [4]. Detta syndrom är känt som en cytokinstorm [8], och det liknar sjukdomen hemofagocytisk lymfohistiocytos (sHLH), som består av ett tillstånd av hyperinflammation utlöst av en virusinfektion [9,10]. Det kan relateras till det faktum att SARS-CoV-2 använder receptorn för angiotensinomvandlande enzym 2 (ACE2) för att infektera målcellerna. Bindningen av SARS-CoV-2 till ACE2-receptorn, som uttrycks brett av celler i olika vävnader [11], leder till en ökning av angiotensin II, vilket aktiverar nukleär faktor-KB (NF-KB). Aktiveringen av denna väsentliga transkriptionsfaktor stimulerar uttrycket av proinflammatoriska cytokiner, kemokiner och adhesionsmolekyler [12]. Trots detta överdrivna inflammatoriska svar verkar det vara ineffektivt att rensa infektionen och, på grund av T-cellsaktivering, kan det sluta i apoptos [13]. Denna cytokinstorm kan vara ansvarig för lymfopeni [12,14] och även minskade nivåer av NK- och CD8+ T-celler med en utmattad fenotyp och ett ökat uttryck av hämmande receptorer som NKG2A i NK-celler och PD{{47 }} i CD8+ T-celler [15,16]. Dessutom reduceras uttrycket av degranuleringsmarkörer som CD107a vanligtvis på ytan av dessa celler [15], vilket bevisar förekomsten av en försämring av förmågan att eliminera infekterade celler hos individer med allvarlig och kritisk covid-19 [17 ]. Trots det snabba globala svaret på att utveckla och administrera effektiva vacciner har uppkomsten av nya varianter som kan fly från det vaccininducerade immunsvaret resulterat i en snabb nedgång i skyddet mot symtomatisk sjukdom [18]. Följaktligen är det nödvändigt att fortsätta forskningen för effektiva behandlingar mot covid-19. Flera behandlingar har testats för att förbättra statusen för individer på sjukhus på grund av svår och kritisk sjukdom, men ingen har ännu visat sig vara specifik för att eliminera de infekterade cellerna eller minska infektionsfrekvensen [15,19]. Därför är stödbehandling såsom syrgas- och vätskebehandling fortfarande bland de viktigaste strategierna som tillämpas för hanteringen av dessa individer [2,4,16,20]. Ospecifika behandlingar som kortikosteroider har också varit fördelaktiga för att kontrollera och minska det överdrivna inflammatoriska svaret [21,22]. Nyligen har flera läkemedel godkänts av FDA för behandling av individer med mild till måttlig covid-19, såsom molnupiravir, nirmatrelvir och ritonavir, men endast i nödfall för de individer med hög risk att utvecklas till allvarlig sjukdom [23–26]. Molnupiravir visar en bredspektrum antiviral aktivitet på grund av dess förmåga att inducera RNA-mutagenes genom interferens med flera virala RNA-beroende RNA-polymeraser (RdRp), inklusive RdRp som används av SARS-CoV-2 för replikering och transkription av dess RNA-genom [27]. Kombinationen av nirmatrelvir och ritonavir har också visat sig kunna stoppa spridningen av infektionen i djurmodeller genom att hämma det huvudsakliga virala proteaset 3CLpro av SARS-CoV-2- 2 [28]. Dessa antivirala läkemedel måste dock administreras i samband med andra åtgärder såsom vacciner för att utlösa ett potent cytotoxiskt immunsvar som kan eliminera de infekterade cellerna. De flesta celler med cytotoxisk aktivitet, såsom CD8+ T-lymfocyter och NK- och NKT-celler, kräver närvaro av interleukin-15 (IL-15) för deras funktion och homeostatiska reglering [29]. IL-15 primerar CD8+ T-celler för deras aktivering av specifika antigener och förbättrar även NK-cellers cytotoxicitet och proliferation. Därför kan IL-15 förstärka både medfödda och adaptiva cellulära immunsvar mot de infekterade cellerna [22,25]. IL-15 förhindrar också NK- och T-celler från apoptos genom att uppreglera anti-apoptotiska faktorer som Bcl-2 och nedreglera pro-apoptotiska faktorer som GSK-3 [26], och därigenom undvika cytopeni. Följaktligen har IL-15 föreslagits som ett nytt immunmodulerande cytokin i cancerimmunterapi och har ansetts vara ett adjuvans i vaccinregimer [26,30]. Fas 1 kliniska prövningar med human bolus iv infusion IL-15 (rhIL-15) eller IL-15 superagonist N-803 har visat att detta cytokin kan inducera betydande expansion och/eller aktivering av CD4+, CD8+ och NK-effektorceller in vivo, och därför har den använts för att behandla cancer eller virusinfektioner som HIV [31–35]. Därför kan användningen av immunmodulerande medel som IL-15 som kan återställa den cytotoxiska aktiviteten hos individer på sjukhus på grund av kritisk covid{108}} vara användbar för att hjälpa till att rensa viruset från organismen. I denna observationella longitudinella studie karakteriserade vi utvecklingen av det cytotoxiska immunsvaret mot SARS-CoV-2 i perifera mononukleära blodceller (PBMC) isolerade från individer som diagnostiserats med covid{111}} som lades in på intensiven vårdenhet (ICU) på grund av allvarliga komplikationer, samt påverkan av detta svar på det slutliga resultatet i jämförelse med andra väsentliga riskfaktorer. Vi utvärderade också kapaciteten hos dessa celler att svara på behandling med IL-15 och förbättra deras cytotoxiska antivirala svar. Resultaten som erhålls i den här studien kan bidra till en bättre förståelse av rollen av det cytotoxiska svaret i det dödliga resultatet av covid-19 och till att gå vidare mot utvecklingen av effektiva immunmodulerande behandlingar som främjar virusclearance.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Material och metoder

2.1. Studieämnen

Tjugotre personer med kritisk covid-19 som lades in på ICU vid sjukhuset Universitario Ramón y Cajal (Madrid, Spanien) från oktober 2020 till april 2021 rekryterades för denna studie. Denna period täckte både den andra och tredje pandemivågen av covid-19 i Spanien (från juni till december 2020 och från december 2020 till mars 2021). Deltagarna rekryterades slumpmässigt vid sjukhusvistelse enligt följande kriterier: godkännande av informerat skriftligt eller muntligt samtycke att delta i studien, inlagd på ICU på grund av kritisk covid-19, positiv SARS-CoV-2 RT-qPCR-analys i nasofarynxutstryk utförd vid sjukhusinläggningen enligt internt validerade protokoll, äldre än 18 år och ovaccinerade mot SARS-CoV-2 vid tidpunkten för infektion. Perifera blodprover och kliniska data samlades in varannan vecka under totalt 13 veckor, och blodprover bearbetades och kryokonserverades fram till analysögonblicket. Denna period beräknades med hänsyn till att längden på sjukhusvistelsen i Spanien under de första pandemivågorna uppskattades till 35 dagar i genomsnitt [36], så vi kunde utföra minst två kompletta rekryterings- och uppföljningsronder. Efter 13 veckor delades deltagarna in i två grupper enligt det slutliga resultatet: dödligt utfall (n=13), fortsättningsvis Exitus; eller utskrivning från sjukhus (n=10), hädanefter Överlevnad.

2.2. Etiskt uttalande

Individerna som deltog i denna studie rekryterades från Hospital Universitario Ramón y Cajal (Madrid, Spanien). Alla av dem gav informerat skriftligt samtycke till att delta i studien eller bevittnade muntligt samtycke med skriftligt samtycke från en representant för att undvika att hantera kontaminerade dokument. Nuvarande spanska och europeiska dataskyddslagar säkerställde konfidentialitet och anonymitet för alla deltagare. Protokoll för denna studie (CEI PI 32_2020-v2) utarbetades i enlighet med Helsingforsdeklarationen och har tidigare granskats och godkänts av Etikkommittéerna vid Instituto de Salud Carlos III (IRB IORG0006384) och det deltagande sjukhuset.

2.3. Celler

Fem milliliter helblod samlades upp i EDTA Vacutainer-rör (Becton Dickinson, Madrid, Spanien) och bearbetades omedelbart för att isolera PMBC och plasma genom Ficoll-Hypaque (Pharmacia Corporation, North Peapack, NJ, USA) densitetsgradientcentrifugering, och sedan kryokonserverad fram till analysen. Cellviabilitet efter upptining bedömdes med optisk mikroskopi och flödescytometri. Vero E6 (afrikansk grön apa njure) cellinje (ECACC 85020206) tillhandahölls vänligen av Dr Antonio Alcami (CBM Severo Ochoa, Madrid, Spanien), och dessa celler odlades i DMEM kompletterat med 10 % FCS, 2 mM L- glutamin och 100 enheter/ml penicillin och streptomycin (Lonza, Basel, Schweiz).

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

2.4. Pseudotypad SARS-CoV-2-infektionsanalys

Cytotoxisk aktivitet mot SARS-CoV-2 av PBMC från deltagarna analyserades med hjälp av Vero E6-celler infekterade av encykel pseudotypat virus pNL4-3∆env_SARS CoV-2-S ∆19(G614)_Ren. Detta virus kodar för SARS-CoV-2 spike-glykoprotein med mutation D614G inom HIV-1-genomet, såväl som Renilla-luciferasgenen genererad som tidigare beskrivits [37,38]. Varianter av SARS-CoV-2 som innehåller D614G-mutationen i spike-proteinet (S) började cirkulera tidigt i pandemin och blev snabbt dominerande i många regioner [39,40]. Kortfattat, ett monolager av Vero E6 infekterades med pNL4-3∆env_ SARS-CoV-2-S∆19(G614)_Ren (100 ng p24 Gag/brunn ) i 48 timmar. Sedan tvättades cellerna och samodlades i 1 timme med PBMC från deltagarna (förhållande 1:1), tidigare behandlade eller inte med IL -15 (13 ng/ml) i 48 timmar. Dosen av IL-15 som användes för denna studie valdes, med hänsyn till den tidigare beskrivna dosen som orsakar den högsta effekten på NK-proliferation (10–25 ng/ml) [41] och även den preferentiella expansionen av minnescytotoxiska CD8+ T-celler (mindre än eller lika med 5 ng/ml) [42]. Den cytotoxiska aktiviteten av PBMC på monoskiktet av Vero E6 bestämdes efter avlägsnande av supernatanten med cellerna i suspension och dissociering av Vero E6-celler från plattan med trypsin-EDTA-lösning (Sigma Aldrich-Merck, Darmstadt, Tyskland) och efterföljande kvantifiering av kaspas-3-aktivitet i de fristående cellerna genom luminescens med användning av Caspase-Glo 3/7 analyssystem (Promega, Madison, WI, USA). För att bestämma vilka cytotoxiska cellpopulationer som var ansvariga för denna aktivitet, samlades PBMCs från supernatanten och analyserades sedan med flödescytometri.

2.5. Flödescytometrianalys

För färgning av cellytfenotypningsmarkörer användes följande konjugerade antikroppar: CD{{0}}PE, CD8-APC-H7, CD56-FITC och CD1{{24 }}7a-PE-Cy7, köpt från BD Biosciences (San Jose, CA, USA). För färgning av utmattningsmarkörer användes följande konjugerade antikroppar: CD3-BV510, CD8-APC-H7, CD56-FITC och PD1-BV650, köpta från BD Biosciences, såväl som CD4-PE, köpta från Immunostep SL (Salamanca, Spanien) och TIGIT-AlexaFluor700 köpta från Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Prover togs med hjälp av BD LSRFortessa X-20 flödescytometer med FACS Diva programvara v 6.0 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) och analyserades sedan med FlowJo programvara v10.0.7 (Tree Star Inc., Ashland, OR) , USA).

2.6. Detektion av SARS-CoV-2 RNAemi

Totalt RNA extraherades från plasmaprover med hjälp av QIAamp MinElute Virus Kit (Qiagen Iberia, Madrid, Spanien) i en automatisk extraktor QIAcube (Qiagen, Hilden, Tyskland). SARS-CoV-2 RNA-detektion utfördes med RT-qPCR-analys med mål i höljet (E) och nukleokapsid (N) gener, som tidigare beskrivits [43], vilket är en del av Interim Guidance of the World Health Organisation (WHO) för diagnostisk testning av SARS-CoV- 2 [44]. Prover ansågs positiva för analysen när kvantifieringscykelns (Cq) värde var under 45 cykler.

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

2.7. Statistisk analys

Alla statistiska analyser och grafik utfördes med GraphPad Prism programvara version 8.4.3 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Gruppjämförelser utfördes med Mann–Whitney U-test, Wilcoxon matchade-par signerade rangtest, envägs ANOVA och Tukeys multipla jämförelsetest. Fishers exakta test användes för att utvärdera skillnader i de kliniska egenskaperna mellan de två grupperna. Värden på p < 0.{{10}}5 (tvåsidigt) ansågs vara statistiskt signifikanta. Medelvärdet och standardavvikelsen användes för att beräkna Cohens d-statistik med hjälp av en Excel-effektstorleksräknare [45]. En effektstorlek på 0.2, 0.5, 0.8 eller större än eller lika med 1.2 var en indikation på små, medelstora, stora respektive mycket stora effektstorlekar [46].

3. Resultat

3.1. Deltagarnas egenskaper

Denna observationella longitudinella studie inkluderade 23 patienter med diagnosen covid-19 som lades in på intensivvårdsavdelningen på grund av allvarliga komplikationer. Blodprover togs varannan vecka i totalt 13 veckor eller fram till det slutliga resultatet. Ingen av deltagarna i denna studie rapporterades vara vaccinerad mot covid-19 vid tidpunkten för infektion och sjukhusvistelse. De viktigaste sociodemografiska och kliniska egenskaperna hos alla deltagare sammanfattas i tabell 1.

Tabell 1. Demografiska och kliniska data för alla deltagare från Exitus-gruppen och Survival-gruppen som rekryterades för denna studie.

Medianåldern för Exitus-gruppen var 65.0 år (IQR 62.0–69.0), medan medianåldern för överlevnadsgruppen var 63.{{7} } år (IQR 59.0–68.5). De flesta deltagare (73,9 %) var män och 65,2 % hade minst en komorbiditet. De huvudsakliga komorbiditeterna var dyslipidemi (52,2 %), hypertoni (39,1 %) och diabetes mellitus (26,1 %). De flesta patienter fick kortikoider (82,6 %), antibiotika (82,6 %) och antikoagulantia (82,6 %) som standardbehandling. De fick även andra behandlingar som tocilizumab (17,4 %) och remdesivir (8,7 %). De vanligaste tecknen och symtomen var lunginflammation (100%), hosta och upphostning (87,0%), andnöd (87,0%) och feber (87,0%). Under vistelsen på ICU behövde 12 patienter (92,3 %) från Exitus-gruppen och 10 patienter (100 %) från Survival-gruppen invasiv mekanisk ventilation. Vi hittade inga signifikanta skillnader mellan båda grupperna i sociodemografiska och kliniska data. Vi analyserade också blodbiokemidata vid baslinjen (första provet) mellan båda grupperna, och vi hittade inte heller signifikanta skillnader mellan grupperna. Mer detaljerad information om kliniska data, sjukhusvistelse och blodbiokemidata för varje deltagare visas i tilläggstabellerna S1 och S2.

3.2. Längd på sjukhusvistelse och intensivvård

Medianlängden på sjukhusvistelsen var 59.0 (IQR 36.0–100.0) dagar i Exitus-gruppen och 73. 0 (IQR 44.5–90.{{20}}) dagar i gruppen Överlevnad (Figur 1A). Medianlängden för ICU-vistelse var 49,0 (IQR 25,5–82,0) dagar i exitusgruppen och 44,0 (IQR 25,0–66,5) dagar i överlevnadsgruppen (Figur 1B). Inga signifikanta skillnader i dessa parametrar hittades mellan båda grupperna.

Figur 1. Längd på sjukhusvistelse och intensivvård. Längden på sjukhusvistelsen (A) och ICU (B) (dagar) hos individer med kritisk covid-19 som delades in i två grupper enligt slutresultatet: dödlig utgång, exitusgrupp (fyllda prickar); eller återhämtning och utskrivning från sjukhus, Överlevnadsgrupp (tomma prickar). Varje punkt motsvarar en individ, och vertikala linjer representerar medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Statistisk signifikans mellan grupperna beräknades med Mann-Whitney U-test.

3.3. Nivåer av perifera blodlymfocyter

Individer från Exitus-gruppen visade lymfopeni (<1000 cells/mm3 ) only at the time of hospitalization (t = 0), but at Week 2, all participants showed levels of lymphocytes above the threshold for lymphopenia (Figure 2). Lymphocyte count was 1.54 (p = 0.0318; Cohen's d = 1.00)- and 1.71 (p = 0.0030; Cohen's d = 3.17)-fold higher in patients from the Survival group in comparison with the Exitus group at baseline and after 4 weeks of hospitalization, respectively. Although both groups showed an increase in the levels of lymphocytes in peripheral blood during hospitalization, they remained on average 1.54-fold higher in individuals of the Survival group in comparison with the participants of the Exitus group for at least 10 weeks. In the Survival group, the lymphocyte counts steadily increased until Week 6 of hospitalization and then decreased until Week 10.

Figur 2. Antal lymfocyter i perifert blod under sjukhusvistelse på grund av kritisk covid-19. Antalet lymfocyter (celler/mm3) bestämdes varannan vecka under totalt 13 veckor eller fram till det slutliga resultatet i blodprover från deltagarna i grupperna Exitus (fyllda prickar) och Överlevnad (blanka prickar). Tröskeln för lymfopeni visas vid 1000 celler/mm3 med en prickad linje. Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes Wilcoxon U-test.

3.4. PBMC:s cytotoxiska aktivitet mot Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2

Vi utvärderade den cytotoxiska aktiviteten hos PBMC hos sjukhuspatienter i de longitudinella proverna genom att kvantifiera kaspas-3-aktivering i ett monolager av Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2 efter samodling i 1 timme ( förhållande 1:1). Den cytotoxiska kapaciteten hos PBMC isolerade från individer i Exitus-gruppen förändrades inte signifikant under sjukhusvistelsen, och den förblev stadigt låg tills det dödliga resultatet (Figur 3). Denna cytotoxiska aktivitet ökade inte signifikant när dessa celler stimulerades med IL-15 under 48 timmar. I gruppen överlevnad ökade den cytotoxiska aktiviteten hos PBMC:er 2,69-faldigt (p=0.0234; Cohens d=1.12) i basalprovet (t {{17} }) i jämförelse med Exitus-gruppen, och den ökade stadigt fram till vecka 6 av sjukhusvistelsen. Denna ökning visade statistisk signifikans i jämförelsen mellan grupper vid vecka 4 (5.58-faldig; p=0.0290; Cohen's d=1.28). Från vecka 6 och framåt minskade den cytotoxiska aktiviteten i överlevnadsgruppen fram till sjukhusutskrivning, vilket var i enlighet med sönderfallet av lymfocytantalet under samma vecka av sjukhusvistelsen (se figur 2). Behandling med IL-15 ökade i genomsnitt 2.30-den cytotoxiska aktiviteten hos PBMC hos individer från överlevnadsgruppen i alla prover under uppföljningen. Efter 4 veckors sjukhusvistelse ökade IL-15-inducerad cytotoxisk aktivitet 6.18-faldigt (p=0.0303; Cohens d=1.05) i PBMC:erna i individer från gruppen överlevnad.

Figur 3. Direkt cellulär cytotoxicitet hos PBMC isolerade från sjukhuspatienter med kritisk covid-19. Den cytotoxiska kapaciteten hos PBMC från individer från Exitus (fyllda prickar) och Survival (tomma prickar)-grupper mättes genom att kvantifiera kaspas-3-aktivitet i ett monolager av Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2 efter samodling (1:1) i 1 timme i basala förhållanden (grå linjer) eller efter behandling med IL-15 i 48 timmar (svarta linjer). Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes Wilcoxon U-test.

3.5. Nivåer av NK- och NKT-celler

Nivåerna av celler med cytotoxiska fenotyper analyserades i PBMC:er som samodlades med Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2. Vi hittade inga signifikanta skillnader mellan nivåerna av celler med NK-fenotyp (CD3-CD56+) mellan båda grupperna av individer, även efter behandling med IL-15 (Figur 4A). Expressionen av degranuleringsmarkören CD107a på ytan av dessa celler förblev oförändrad hos individerna från Exitus-gruppen. Även om detta uttryck stadigt ökade från vecka 4 till sjukhusutskrivning i överlevnadsgruppen, uppnådde inte denna skillnad statistisk signifikans i jämförelsen med exitusgruppen (Figur 4B). Behandling med IL-15 modifierade inte signifikant uttrycket av CD107a i dessa celler. Från vecka 4 visade PBMC från individer i båda grupperna en ökning av nivåerna av celler med NKT-fenotyp (CD3+CD56+) som var 4.17-faldigt högre i PBMC från individerna i Exitus-gruppen vid vecka 6, även om denna skillnad inte uppnådde signifikans (p=0.0571; Cohen's d=3.15) (Figur 5A). Denna ökning var något högre när celler behandlades med IL-15 i båda grupperna, även om data inte heller nådde statistisk signifikans (Figur 5A). Uttrycket av CD107a förändrades inte signifikant mellan båda grupperna eller efter behandling med IL -15 (Figur 5B).

Figur 4. Nivåer av NK-celler i PBMC från individer på sjukhus med kritisk covid-19. (A) Totala nivåer av NK-celler (CD3-CD56+) och (B) uttryck av degranuleringsmarkören CD107a i dessa celler utvärderades i PBMC:er under basala förhållanden (grå linjer) eller efter behandling med IL-15 i 48 timmar (svarta linjer) efter samodling (1:1) med Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2 i 1 timme. Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes Wilcoxon U-test.

Figur 5. Nivåer av NKT-celler i PBMC från individer inlagda på sjukhus med kritisk covid-19. Totala nivåer av NKT-celler (CD3+CD56+) (A) och uttryck av degranuleringsmarkören CD107a i dessa celler (B) utvärderades under basala förhållanden (grå linjer) eller efter behandling med IL{ {5}} i 48 timmar (svarta linjer) efter samodling (1:1) i 1 timme med Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2. Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes Wilcoxon U-test.

3.6. Nivåer av CD8+ T-celler

CD8-antalet ökades 2,07-faldigt (p=0.0409; Cohens d=0.94) i basalprovet (t=0) i Exitus-gruppen i jämförelse med överlevnadsgruppen, och dessa nivåer förblev stabila tills det dödliga resultatet (Figur 6A). IL-15 gav inte en signifikant fördelaktig effekt på nivåerna av denna cellpopulation. I gruppen överlevnad reducerades CD8+ T-celler 1,51-faldigt i genomsnitt jämfört med exitusgruppen (Figur 6A). Uttrycket av CD107a minskade 1.53-faldigt (p=0.0313) vid vecka 4 i CD8+ T-celler från individerna i Exitus-gruppen, och det förblev oförändrat tills den dödliga resultat. Behandling med IL-15 visade en liten fördel i uttrycket av denna degranuleringsmarkör, men denna skillnad var inte signifikant (Figur 6B). I överlevnadsgruppen var det också en minskning av uttrycket av CD107a i CD8+ T-celler vid vecka 4, och sedan skedde en ökning framåt, men ingen betydelse uppnåddes före eller efter behandling med IL{{26 }} (Figur 6B).

Figur 6. Nivåer av CD8+ T-celler i PBMC från individer på sjukhus med kritisk covid-19. (A) Totala nivåer av CD8+ T-celler (CD3+CD8+) och (B) uttryck av degranuleringsmarkören CD107a i dessa celler utvärderades i PBMC:er under basala förhållanden (grå) linjer) eller efter behandling med IL-15 i 48 timmar (svarta linjer) efter samodling (1:1) med Vero E6-celler infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2 i 1 timme. Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes Wilcoxon U-test.

3.7. Nivåer av utmattningsmarkörer

Expressionsnivåerna för immunutmattningsmarkörerna PD-1 (Programmerat celldödsprotein) och TIGIT (T-cellsimmunoreceptor med Ig- och ITIM-domäner) analyserades med flödescytometri i CD4+ T-celler och cytotoxiska celler från alla deltagare. Prover som tagits vid tidpunkten för sjukhusinläggning (t=0) fram till vecka 6 av sjukhusvistelsen analyserades, på grund av bristen på prover tillgängliga efter denna tidpunkt. CD4+ och CD8+ T-celler från individer i Exitus-gruppen visade nivåer av PD-1 som ökade signifikant med 1,72 (p=0.0095; Cohens d {{ 11}}.87)- och 2.92-faldigt (p=0.0317; Cohen's d=2.07) efter 4 veckors sjukhusvistelse, respektive, i jämförelse med individer från Överlevnadsgrupp (Figur 7A, B, vänster grafer). I NKT-celler ökade nivåerna av TIGIT signifikant från tidpunkten för sjukhusinläggning till 6 veckors sjukhusvistelse hos individer från Exitus-gruppen, och dessa nivåer ökades 1,76-faldigt (p=0.0357 ; Cohen's d=0.33) efter 2 veckors sjukhusvistelse, i jämförelse med överlevnadsgruppen (Figur 7C, höger graf).

Inga signifikanta skillnader mellan grupper observerades i uttrycksnivåerna för dessa utmattningsmarkörer i NK-celler (Figur 7D).

Figur 7. Uttrycksnivåer av utmattningsmarkörer i PBMC från individer inlagda på sjukhus med kritisk covid-19. Uttrycksnivåer av PD-1 och TIGIT i CD4+ T-celler (A), CD8+ T-celler (B), NKT-celler (C) och NK-celler (D). Varje punkt motsvarar medelvärdet av data, och vertikala linjer representerar SEM. Statistisk signifikans mellan grupper beräknades med Mann-Whitney U-test, och inom grupper användes ANOVA.

3.8. Kvantifiering av SARS-CoV-2 RNAemi i plasma

Förekomsten av RNA från SARS-CoV-2 analyserades i plasma från alla individer i basalprovet (t=0), och inga positiva resultat erhölls hos någon deltagare, med Cq-värden under gränsen positiv detektering av 45 cykler.

4. Diskussion

SARS-CoV-2-infektion kan orsaka flera kliniska presentationer av covid-19 som sträcker sig från asymtomatisk infektion till allvarlig, kritisk eller till och med dödlig sjukdom [4]. Även om den allmänna vaccinationen av befolkningen avsevärt har minskat de allvarliga formerna av sjukdomen, ökar uppkomsten av nya varianter av SARS-CoV-2 antalet individer som utvecklar kritisk covid-19 och måste sjukhusvård på grund av genombrottsinfektioner [47,48]. Därför är det fortfarande en prioritet att utveckla förebyggande och terapeutiska strategier som kan undvika utvecklingen av kritiska former av covid-19 och dödliga utfall hos inlagda patienter. Det har beskrivits att äldre personer med samsjuklighet utgör en högre risk att utveckla allvarlig och kritisk covid{{1{{30}}}} [49]. I Spanien är de viktigaste oberoende prediktorerna för dödsfall på grund av covid-19 män över 50 år gamla med tillhörande komorbiditeter som högt blodtryck och diabetes [36]. I vår studie presenterade de flesta av deltagarna i båda grupperna dessa egenskaper, utan signifikanta skillnader mellan dem i sociodemografiska, kliniska eller biokemiska data som kan påverka sjukdomens svårighetsgrad eller det dödliga resultatet. Faktum är att båda grupperna visade ökade nivåer av biokemiska parametrar som har associerats med en högre risk för ett dåligt utfall av covid-19, såsom C-reaktivt protein (CRP) och laktatdehydrogenas (LDH) [50–56 ]. Å andra sidan, även om det har rapporterats att individer med svår covid-19 kan ha detekterbar SARS-CoV-2 RNAnemi [54], vilket har varit relaterat till en ökad risk för dödlighet [55], ingen av deltagarna i vår studie presenterade detekterbart RNA i serum, så vi kunde inte fastställa en korrelation mellan detekterbar viremi och ett dödligt utfall. Slutligen visar covid-19 en längre sjukhusvistelse och dödlighet jämfört med andra infektionssjukdomar som kräver inläggningar på intensivvårdsavdelningen, såsom community-acquired pneumonia (CAP) eller sepsis [56], och det uppskattades i 35 dagar i genomsnitt för de individer som var inlagda på sjukhus i Spanien under de första pandemivågorna [36]. I vår studie var medianlängden på sjukhusvistelsen likartad mellan både exitus- och överlevnadsgrupperna (59,0 respektive 73,0 dagar), och 50 % av alla deltagare stannade mer än 40 dagar på ICU. Därför måste andra differentiella faktorer beaktas för att förklara det dödliga resultatet i exitusgruppen och återhämtningen i överlevnadsgruppen.

Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret

Lymfopeni anses också vara en riskfaktor för sjukdomens svårighetsgrad som har varit relaterad till en längre sjukhusvistelse [57]. I vår studie visade 73,9% av deltagarna i både Exitus- och Survival-grupperna låga lymfocytantal. Nivån av totala lymfocyter var dock högre i genomsnitt hos deltagarna i Survival-gruppen, jämfört med Exitus-gruppen. Detta är i enlighet med den tidigare observationen att de individer som dog på grund av covid-19 utvecklar en svårare lymfopeni över tid jämfört med de som överlever [58] och att dessa lymfocyter vanligtvis uppvisar en utmattad fenotyp, vilket resulterar i en gradvis immunbrist [15,16]. Eftersom ett effektivt cytotoxiskt antiviralt svar är avgörande för kontroll av virusinfektioner, inklusive SARS-CoV-2 [17], är immunrekonstitutionen avgörande för återhämtningen från covid-19. Accelerationen av denna immunrekonstitution beror i hög grad på den homeostatiska perifera expansionen av lymfocyter, vilket kan vara en bra strategi för att förbättra resultatet för individer som är inlagda på sjukhus på grund av allvarlig covid-19 [58]. IL-15 är ett cytokin som är nödvändigt för funktionen och homeostasen av CD8+ T-celler, NK- och NKT-celler [29], och det har föreslagits som en ny immunmodulerande behandling för flera sjukdomar som cancer och HIV-infektion [26,30,35,59]. I den här studien utvärderade vi därför om behandling in vitro med IL-15 kunde förbättra det cytotoxiska svaret i PBMC hos sjukhusinlagda individer med allvarlig och kritisk covid-19 allt eftersom infektionen fortskred, för att fastställa dess giltighet som en kandidat för att stimulera immunrekonstitutionen under covid-19. Med den analyserade dosen observerade vi en total ökning av det cytotoxiska svaret mot målceller infekterade med pseudotypad SARS-CoV-2 i PBMC:erna hos de individer som överlevde COVID-19 efter 44 dagar i genomsnitt efter sjukhusvistelse kl. ICU. Detta cytotoxiska svar ökade effektivt 2,3-faldigt i genomsnitt vid behandling med IL-15 i alla prover som samlades in under uppföljningen, med vecka 6 av sjukhusvistelsen som vändpunkten från vilken både lymfocyträkningen och den cytotoxiska aktiviteten började minska fram till sjukhusutskrivning. Trots att de delar liknande sociodemografiska, kliniska och biokemiska egenskaper och har varit inlagd på sjukhus under nästan samma tid (totalt 59 dagar, varav 49 dagar på ICU), gruppen individer som inte överlevde covid{{34} } visade PBMC:er som inte svarade i närvaro av de infekterade målcellerna, även när de stimulerades med IL-15. De totala nivåerna av lymfocyter var över tröskeln för lymfopeni hos individer från denna grupp sedan vecka 2 av sjukhusvistelsen. Dessa nivåer ökade dock inte signifikant under tiden för sjukhusvistelse, och inget effektivt antiviralt svar detekterades, även i närvaro av IL-15 vid den analyserade dosen. Frånvaron av svar på IL-15 har beskrivits för andra kroniska infektioner såsom humant immunbristvirus (HIV), hepatit C-virus (HCV), hepatit B-virus (HBV) och humant T-lymfotropiskt virus (HTLV), där immunutmattningen kan påverka uttrycket av den specifika receptorn för IL-15, CD122, i CD8+ T-celler [60], vilket gör att de inte svarar på denna homeostatiska stimulans. Den immunutmattning som är karakteristisk för COVID-19 har inte bara observerats i CD8+ T-celler utan även i andra cytotoxiska celltyper som NK- och NKT-celler [15,16]. Därför kan frånvaron av svar på IL-15 i PBMC från Exitus-gruppen vara relaterat till ökad immunutmattning som inte kunde övervinnas med IL-15-behandling enbart vid den analyserade dosen. Detta har också observerats i kliniska fas I-prövningar där monoterapi med IL-15 var ineffektiv trots den enorma expansionen av cytotoxiska celler [31,32]. Följaktligen skulle andra samstimulerande behandlingar vara nödvändiga för att inducera ett effektivt svar hos dessa individer, såsom immunologiska kontrollpunktshämmare eller monoklonala antikroppar som riktar in sig på de infekterade cellerna, för att förstärka den antikroppsberoende cellulära cytotoxiciteten (ADCC).

Vi bestämde också vilka celltyper som huvudsakligen var involverade i utvecklingen av detta förstärkta cellgiftssvar i gruppen individer som överlevde COVID-19. Det har visats att närvaron av funktionella CD8+ T-celler är avgörande för att skydda djurmodeller från utvecklingen av allvarlig covid-19 [61,62]. Dessutom har frånvaron av ett effektivt CD8-förmedlat cytotoxiskt svar utsetts till en väsentlig faktor för äldre människors ökade mottaglighet för att utveckla allvarlig eller kritisk covid-19 [63]. Överraskande nog var nivåerna av CD8+ T-celler 2,07-faldigt (p=0.0409) högre i Exitus-gruppen vid tidpunkten för sjukhusvistelsen (t=0) , och de förblev förbättrade tills det dödliga resultatet, i jämförelse med överlevnadsgruppen. Även om individerna från Exitus-gruppen visade lymfocytantal något över tröskeln för lymfopeni, förblev dessa nivåer nästan oförändrade under hela tiden de var inlagda på sjukhus. Dessutom har det beskrivits att lymfopeni kan leda till ett mönster av samexisterande suppression och aktivering där det finns en perifer förlust av T-celler samtidigt med den intensiva proliferationen av CD8+ T-cellpoolen [64,65]. Detta skulle förklara de något ökade nivåerna av CD8+ T-celler som observerats i PBMC hos deltagarna från Exitus-gruppen sedan vecka 6 av sjukhusvistelsen och framåt, trots att de totala nivåerna av lymfocyter förblir oförändrade och över tröskeln för lymfopeni, vilket också indikerar en potentiell minskning av CD4+ T-celler. Dessa CD8+ T-celler visade emellertid låg cytotoxisk aktivitet, vilket bestämdes av det låga uttrycket av degranuleringsmarkören CD107a på cellytan, medan uttrycket av denna markör ökade i CD8+ T-celler från deltagarna i Överlevnadsgruppen från vecka 4 och framåt. Uttrycket av CD107a anses vara en biomarkör för att utvärdera den cytotoxiska kapaciteten [66], och den har beskrivits vara reducerad i ytan av celler isolerade från individer med covid-19 i jämförelse med oinfekterade, friska donatorer [15 ].

Därför kan det ökade uttrycket av CD107a på ytan av CD8+ T-celler åtminstone delvis förklara dessa cellers bidrag till den ökade cytotoxiska aktiviteten som observerats i PBMC hos deltagarna från Survival-gruppen. Dessutom observerade vi ett ökat uttryck av utmattningsmarkören PD-1 i både CD4+ och CD8+ T-celler från individer i Exitus-gruppen, vilket också kan bidra till minskad cellgift aktivitet och svar på IL-15 av dessa celler. Andra cellpopulationer kan vara involverade i den cytotoxiska aktiviteten mot de pseudotypade SARS-CoV-2-infekterade cellerna, såsom NK- och NKT-celler. Som med andra allvarliga akuta infektioner kan NK-celler rekryteras till infektionsplatsen med SARS-CoV -2 [67], vilket skulle förklara det minskade antalet cirkulerande NK-celler som observerades hos alla deltagare. Dessutom kan cytokinstormen som utvecklas under svår och kritisk covid-19 resultera i en dysfunktionell status för NK-celler som skulle uttrycka höga nivåer av hämmande kontrollpunktsreceptorer som NKG2A eller PD-1 [68]. I vår studie var nivåerna av NK-celler likartade mellan båda grupperna fram till vecka 6, där deltagarna i Survival-gruppen visade en progressiv ökning fram till sjukhusutskrivning. Detta korrelerade med ett ökat uttryck av CD107a, som har associerats i NK-celler med en ökad cytokinutsöndring och förbättrad lysis av målceller [7,69], även om andelen NK-celler som uttrycker aktiveringsmarkörer som CD107a har beskrivits vara lägre hos individer med covid-19 jämfört med friska kontroller [70]. Omvänt, även om nivåerna av NKT-celler var kraftigt förhöjda i överlevnadsgruppen från vecka 6 och framåt, förblev uttrycket av CD107a nästan oförändrat, medan de visade ökade nivåer av utmattningsmarkören TIGIT på cellytan som stadigt ökade fram till vecka 6 av sjukhusvistelse . En av de viktigaste begränsningarna i vår studie var den minskade urvalsstorleken. Ändå uppnåddes statistisk signifikans mellan grupper i flera väsentliga parametrar som också visade en stor eller mycket stor effektstorlek när de sammanslagna skillnaderna mellan grupperna beräknades.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis är det viktigaste bidraget från denna studie till kampen mot immunopatologin orsakad av SARS-CoV-2-infektion bekräftelsen på att den försämrade antivirala kapaciteten hos PBMC verkade vara en kritisk faktor i utvecklingen till dödlig covid{ {2}}, även över andra sociodemografiska, kliniska och biokemiska faktorer. Därför kan användningen av immunmodulerande behandlingar som kan öka cytotoxiciteten bidra till ett positivt resultat under sjukhusvistelse på grund av kritisk covid-19. Den ökade cytotoxiska aktiviteten medierad av IL-15 hos individer från överlevnadsgruppen berodde sannolikt inte på ökade nivåer av cytotoxiska celler utan på dessa cellers immunkompetens att svara på sådan stimulans. Därför kan övervakningen av uttrycket av utmattningsmarkörer och känsligheten för homeostatiska stimuli såsom IL-15 av dessa cellpopulationer hos inlagda individer vara användbar som en prediktor för ett dödligt utfall för att initiera ytterligare åtgärder för att förhindra Det. Följaktligen är denna observationsstudie ett bevis på att användningen av IL-15 hos individer som är inlagda på sjukhus med covid-19 skulle kunna förbättra det antivirala immunsvaret, även om denna stimulans ensam inte skulle vara effektiv hos de individer som inte svarar celler på grund av immunutmattning eller försämrad IL-15R-signalväg, vilket är väsentligt för att förhindra utmattning [71], även när de visar lymfocytantal över tröskeln för lymfopeni. Fler studier med en större population är nödvändiga för att utvärdera kombinationer av ökande doser av IL-15 med andra immunmodulerande medel som immunkontrollpunktshämmare eller monoklonala antikroppar som riktar sig mot de infekterade cellerna för att hjälpa till att återställa och förstärka det antivirala svaret under kritiska former av covid -19.

Referenser

1. Atzrodt, CL; Maknojia, I.; McCarthy, RDP; Oldfield, TM; Po, J.; Ta, KTL; Stepp, HE; Clements, TP A Guide to COVID-19: En global pandemi orsakad av det nya coronaviruset SARS-CoV-2. FEBS J. 2020, 287, 3633–3650. [CrossRef] [PubMed]

2. Dashboard för WHO:s Coronavirus (COVID-19). Tillgänglig online: https://covid19.who.int/ (tillgänglig den 18 oktober 2022).

3. Capalbo, C.; Aceti, A.; Simmaco, M.; Bonfini, R.; Rocco, M.; Ricci, A.; Napoli, C.; Rocco, M.; Alfonsi, V.; Teggi, A.; et al. Den exponentiella fasen av covid-19-pandemin i centrala Italien: En integrerad vårdväg. Int. J. Environ. Res. 2020, 17, 3792. [CrossRef] [PubMed]

4. Huang, C.; Wang, Y.; Li, X; Ren, L.; Zhao, J.; Hu, Y.; Zhang, L.; Fan, G.; Xu, J.; Gu, X.; et al. Kliniska egenskaper hos patienter infekterade med 2019 års nya coronavirus i Wuhan, Kina. Lancet 2020, 395, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

5. Haybar, H.; Kazemnia, K.; Rahim, F. Underliggande kronisk sjukdom och covid-19-infektion: En toppmodern recension. Jundishapur J. Chronic Dis. Vård 2020, 9, e103452. [CrossRef] 6. Hamed, SM; Elkhatib, WF; Khairalla, AS; Noreddin, AM Global dynamics of SARS-CoV-2 clades and their relation to COVID{11}} epidemiology. Sci. Rep. 2021, 11, 8435. [CrossRef]

7. Erdinc, B.; Sahni, S.; Gotlieb, V. Hematologiska manifestationer och komplikationer av covid-19. Adv. Clin. Exp. Med. 2021, 30, 101–107. [CrossRef]

8. Hu, B.; Huang, S.; Yin, L. Cytokinstormen och covid-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 250–256. [CrossRef]

9. Ramos-Casals, M.; Brito-Zerón, P.; López-Guillermo, A.; Khamashta, MA; Bosch, X. Vuxen hemofagocytiskt syndrom. Lancet 2014, 383, 1503–1516. [CrossRef]

10. Mehta, P.; McAuley, DF; Brown, M.; Sanchez, E.; Tattersall, RS; Manson, JJ; på uppdrag av HLH Across Specialty Collaboration, Storbritannien. Över specialitet. COVID-19: Överväg cytokinstormssyndrom och immunsuppression. Lancet 2020, 395, 1033–1034. [CrossRef]

11. Li, M.-Y.; Li, L.; Zhang, Y.; Wang, X.-S. Uttryck av SARS-CoV-2-cellreceptorgenen ACE2 i en mängd olika mänskliga vävnader. Infektera. Dis. Fattigdom 2020, 9, 45. [CrossRef]

12. Jiang, Y.; Rubin, L.; Peng, T.; Liu, L.; Xing, X; Lazarovici, P.; Zheng, W. Cytokinstorm i COVID-19: Från virusinfektion till immunsvar, diagnos och terapi. Int. J. Biol. Sci. 2022, 18, 459–472. [CrossRef] [PubMed]

13. Zhan, Y.; Carrington, EM; Zhang, Y.; Heinzel, S.; Lew, AM Liv och död för aktiverade T-celler: Hur skiljer de sig från naiva T-celler? Främre. Immunol. 2017, 8, 1809. [CrossRef] [PubMed]

14. Huang, I.; Pranata, R. Lymphopenia in severe coronavirus disease-2019 (COVID-19): Systematisk granskning och metaanalys. J. Intensivvård 2020, 8, 36. [CrossRef] [PubMed]

15. Zheng, M.; Gao, Y.; Wang, G.; Song, G.; Liu, S.; Sun, D.; Xu, Y.; Tian, ​​Z. Funktionell utmattning av antivirala lymfocyter hos covid-19-patienter. Cell. Mol. Immunol. 2020, 17, 533–535. [CrossRef]

16. Rha, M.-S.; Jeong, HW; Ko, J.-H.; Choi, SJ; Seo, I.-H.; Lee, JS; Sa, M.; Kim, AR; Joo, E.-J.; Ahn, JY; et al. PD-1-uttrycker SARS-CoV-2-specifika CD8+ T-celler är inte utmattade, men funktionella hos patienter med covid-19. Immunitet 2021, 54, 44–52. [CrossRef]

17. Vigón, L.; Fuertes, D.; García-Pérez, J.; Torres, M.; Rodríguez-Mora, S.; Mateos, E.; Corona, M.; Saez-Marín, AJ; Malo, R.; Navarro, C.; et al. Nedsatt cytotoxiskt svar i PBMC från patienter med covid-19 inlagda på ICU: Biomarkers to Predict Disease Severity. Främre. Immunol. 2021, 12, 665329. [CrossRef]

18. VEM. Interimsuttalande om beslutsfattande överväganden för användning av variant uppdaterade covid-19-vacciner. Tillgängligt online: https://www.who.int/news/item/17-06-2022-interim-statement-on-decision-making-considerations-for-the-use-of variant-updated-covid{{15} }vaccines (tillträde den 15 augusti 2022).

19. Mishra, SK; Tripathi, T. Ett års uppdatering om covid-19-pandemin: Var är vi nu? Acta Trop. 2021, 214, 105778. [CrossRef] 20. Li, X.; Geng, M.; Peng, Y.; Meng, L.; Lu, S. Molekylär immunpatogenes och diagnos av covid-19. J. Pharm. Anal. 2020, 10, 102–108. [CrossRef]

21. TRC-gruppen. Dexametason hos inlagda patienter med covid-19. N. Engl. J. Med. 2021, 384, 693–704. [CrossRef]

22. Zhou, X.; Yu, J.; Cheng, X.; Zhao, B.; Manyam, GC; Zhang, L.; Schluns, K.; Li, P.; Wang, J.; Sun, S.-C. Deubiquitinase Otub1 styr aktiveringen av CD8+ T-celler och NK-celler genom att reglera IL-15--medierad priming. Nat. Immunol. 2019, 20, 879–889. [CrossRef]

23. Parums, DV Aktuell status för orala antivirala läkemedelsbehandlingar för SARS-CoV-2-infektion hos patienter som inte är inlagda på sjukhus. Med. Sci. Monit. 2022, 28, e935952-1. [CrossRef] [PubMed]

24. Couzin-Frankel, J. Antivirala piller kan förändra pandemins förlopp. Am. Assoc. Adv. Sci. 2021, 12, 799–800. [CrossRef] [PubMed]

25. Muntasell, A.; Ochoa, MC; Cordeiro, L.; Berraondo, P.; de Cerio, AL-D.; Cabo, M.; López-Botet, M.; Melero, I. Inriktning på NK-cellskontrollpunkter för cancerimmunterapi. Curr. Opin. Immunol. 2017, 45, 73–81. [CrossRef] [PubMed]

26. Patidar, M.; Yadav, N.; Dalai, SK Interleukin 15: Ett nyckelcytokin för immunterapi. Cytokine Growth Factor Rev. 2016, 31, 49–59. [CrossRef]

27. Kabinger, F.; Stiller, C.; Schmitzová, J.; Dienemann, C.; Kokic, G.; Hillen, HS; Höbartner, C.; Cramer, P. Mechanism of molnupiravir-induced SARS-CoV-2 mutagenes. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2021, 28, 740–746. [CrossRef] [PubMed]

28. Hung, Y.-P.; Lee, J.-C.; Chiu, C.-W.; Lee, C.-C.; Tsai, P.-J.; Hsu, I.-L.; Ko, W.-C. Oral nirmatrelvir/ritonavirterapi mot covid-19: The Dawn in the Dark? Antibiotika 2022, 11, 220. [CrossRef]

29. Guo, Y.; Luan, L.; Patil, NK; Sherwood, ER Immunbiologi av IL-15/IL-15R-komplexet som ett antitumör- och antiviralt medel. Cytokine Growth Factor Rev. 2017, 38, 10–21. [CrossRef]

30. Zhang, S.; Zhao, J.; Bai, X.; Handley, M.; Shan, F. Biologiska effekter av IL-15 på immunceller och dess potential för behandling av cancer. Int. Immunopharmacol. 2021, 91, 107318. [CrossRef]

31. Waldmann, TA; Dubois, S.; Miljkovic, MD; Conlon, KC IL-15 i kombinationsimmunterapi av cancer. Främre. Immunol. 2020, 11, 868. [CrossRef]

32. Dubois, SP; Miljkovic, MD; Fleisher, TA; Pittaluga, S.; Hsu-Albert, J.; Bryant, BR; Petrus, MN; Perera, LP; Müller, JR; Shih, JH; et al. Kortkur IL-15 givet som en kontinuerlig infusion ledde till en massiv expansion av effektiva NK-celler: Implikationer för kombinationsbehandling med antitumörantikroppar. J. Immunother. Cancer 2021, 9, e002193. [CrossRef]

33. Conlon, KC; Potter, EL; Pittaluga, S.; Lee, C.-CR; Miljkovic, MD; Fleisher, TA; Dubois, S.; Bryant, BR; Petrus, M.; Perera, LP; et al. IL15 genom kontinuerlig intravenös infusion till vuxna patienter med solida tumörer i en fas I-försöksinducerad dramatisk NK-cellsundergrupp. Clin. Cancer Res. 2019, 25, 4945–4954. [CrossRef]

34. Romee, R.; Cooley, S.; Berrien-Elliott, MM; Westervelt, P.; Verneris, MR; Wagner, JE; Weisdorf, DJ; Blazar, BR; Ustun, C.; DeFor, TE; et al. Första i människa fas 1 klinisk studie av IL-15 superagonistkomplexet ALT-803 för att behandla återfall efter transplantation. Blood Am. J. Hematol. 2018, 131, 2515–2527. [CrossRef] [PubMed]

35. Miller, JS; Davis, ZB; Helgeson, E.; Reilly, C.; Thorkelson, A.; Anderson, J.; Lima, NS; Jorstad, S.; Hart, GT; Lee, JH; et al. Säkerhet och virologisk effekt av IL-15-superagonisten N-803 hos personer som lever med HIV: En fas 1-studie. Nat. Med. 2022, 28, 392–400. [CrossRef] [PubMed]

36. Berenguer, J.; Ryan, P.; Rodríguez-Baño, J.; Jarrín, I.; Carratalà, J.; Pachón, J.; Yllescas, M.; Arriba, JR; Muñoz, EA; Gil Divasson, P.; et al. Karakteristika och förutsägelser om dödsfall bland 4035 patienter på sjukhus med covid-19 i Spanien i följd. Clin. Microbiol. Infektera. 2020, 26, 1525–1536. [CrossRef]

37. Garcia-Perez, J.; Sanchez-Palomino, S.; Perez-Olmeda, M.; Fernandez, B.; Alcami, J. En ny strategi baserad på rekombinanta virus som ett verktyg för att bedöma läkemedelskänslighet hos humant immunbristvirus typ 1. J. Med. Virol. 2007, 79, 127–137. [CrossRef] [PubMed]

38. Ou, X.; Liu, Y.; Lei, X.; Li, P.; Mitten.; Ren, L.; Guo, L.; Guo, R.; Chen, T.; Hu, J.; et al. Karakterisering av spike glykoprotein av SARS-CoV-2 vid virusinträde och dess immunkorsreaktivitet med SARS-CoV. Nat. Commun. 2020, 11, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

39. Volz, E.; Hill, V.; McCrone, JT; Pris, A.; Jorgensen, D.; O'Toole, Á.; Southgate, J.; Johnson, R.; Jackson, B.; Nascimento, FF; et al. Utvärdering av effekterna av SARS-CoV-2 spikmutation D614G på överföringsförmåga och patogenicitet. Cell 2021, 184, 64–75. [CrossRef]

40. Korber, B.; Fischer, WM; Gnanakaran, S.; Yoon, H.; Theiler, J.; Abfalterer, W.; Hengartner, N.; Giorgi, EE; Bhattacharya, T.; Foley, B.; et al. Spåra förändringar i SARS-CoV-2-spik: Bevis på att D614G ökar smittsamheten hos COVID-19-viruset. Cell 2020, 182, 812–827. [CrossRef]

41. Nandagopal, N.; Ali, AK; Komal, AK; Lee, S.-H. Den kritiska rollen för IL-15–PI3K–mTOR-vägen i naturliga mördarcellseffektorfunktioner. Främre. Immunol. 2014, 5, 187. [CrossRef]

42. Rosenthal, R.; Groeper, C.; Bracci, L.; Adamina, M.; Feder-Mengus, C.; Zajac, P.; Iezzi, G.; Bolli, M.; Weber, WP; Frey, DM; et al. Differentiell lyhördhet för IL-2, IL-7 och IL-15 Common Receptor Chain Cytokines av antigenspecifika perifert blod naiva eller minnescytotoxiska CD8+ T-celler från friska givare och Melanompatienter. J. Immunother. 2009, 32, 252–261. [CrossRef]

43. Corman, VM; Landt, O.; Kaiser, M.; Molenkamp, ​​R.; Meijer, A.; Chu, DKW; Bleicker, T.; Brünink, S.; Schneider, J.; Schmidt, ML; et al. Detektering av 2019 års nya coronavirus (2019-nCoV) genom RT-PCR i realtid. Eurosurveillance 2020, 25, 2000045. [CrossRef] [PubMed]

44. VEM. Diagnostisk testning för SARS-CoV-2: Interimsvägledning, 11 september 2020; Världshälsoorganisationen: Genève, Schweiz, 2020.

45. Becker, LA Effektstorlek (ES); University of Colorado Colorado Springs: Colorado Springs, CO, USA, 2000.

46. ​​Cohen, J. Statistical Power Analysis for the Behavioural Sciences; Routledge: Abingdon, Storbritannien, 1988. [CrossRef]

47. Moreno-Perez, O.; Ribes, I.; Boix, V.; Martinez-García, M.; Otero-Rodriguez, S.; Reus, S.; Sánchez-Martínez, R.; Ramos, JM; Chico-Sánchez, P.; Merino, E. Inlagda patienter med genombrott COVID-19: Kliniska egenskaper och dåliga resultatprediktorer. Int. J. Infect. Dis. 2022, 118, 89–94. [CrossRef] [PubMed]

48. Lee, CM; Lee, E.; Park, WB; Choe, PG; Song, K.-H.; Kim, ES; Park, S.-W. Banbrytande COVID-19-infektion under deltavariantens dominerande period: Individuell vård baserad på vaccinationsstatus behövs. J. Korean Med. Sci. 2022, 37, e252. [CrossRef] [PubMed]

49. Ejaz, H.; Alsrhani, A.; Zafar, A.; Javed, H.; Junaid, K.; Abdalla, AE; Abosalif, KO; Ahmed, Z.; Younas, S. COVID-19 och samsjukligheter: Skadlig påverkan på infekterade patienter. J. Infect. Folkhälsa 2020, 13, 1833–1839. [CrossRef] [PubMed]

50. Azevedo, RB; Botelho, BG; de Hollanda, JVG; Ferreira, LVL; de Andrade, LZJ; Oei, SSML; Mello, TDS; Muxfeldt, ES COVID-19 och det kardiovaskulära systemet: En omfattande recension. J. Hum. Hypertens. 2021, 35, 4–11. [CrossRef]

51. Zhang, JJ; Lee, KS; Ang, LW; Leo, YS; Young, BE Riskfaktorer för allvarlig sjukdom och effektivitet av behandling hos patienter infekterade med covid-19: En systematisk översikt, metaanalys och metaregressionsanalys. Clin. Infektera. Dis. 2020, 71, 2199–2206. [CrossRef]

52. Kermali, M.; Khalsa, RK; Pillai, K.; Ismail, Z.; Harky, A. Biomarkörernas roll vid diagnos av covid-19–En systematisk översikt. Life Sci. 2020, 254, 117788. [CrossRef]

53. Malik, P.; Patel, U.; Mehta, D.; Patel, N.; Kelkar, R.; Akrmah, M.; Gabrilove, JL; Sacks, H. Biomarkörer och utfall av covid-19 sjukhusvistelser: systematisk granskning och metaanalys. BMJ Evid. Baserat Med. 2021, 26, 107–108. [CrossRef]

54. Li, Y.; Schneider, AM; Mehta, A.; Sade-Feldman, M.; Kays, KR; Gentili, M.; Charland, NC; Gonye, ​​AL; Gushterova, I.; Khanna, HK; et al. SARS-CoV-2-viremi är associerad med distinkta proteomiska vägar och förutsäger utfall av covid-19. J. Clin. Undersök. 2021, 131, e148635. [CrossRef]

55. Rodríguez-Serrano, DA; Roy-Vallejo, E.; Cruz, NDZ; Ramírez, AM; Rodríguez-García, SC; Arevalillo-Fernández, N.; Galván-Román, JM; García-Rodrigo, LF; Vega-Piris, L.; Llano, MC; et al. Detektering av SARS-CoV-2-RNA i serum är associerad med ökad dödlighetsrisk hos inlagda covid{10}}-patienter. Sci. Rep. 2021, 11, 13134. [CrossRef]

56. Serafim, RB; Póvoa, P.; Souza-Dantas, V.; Kalil, AC; Salluh, JI Kliniskt förlopp och resultat av kritiskt sjuka patienter med COVID-19-infektion: En systematisk översikt. Clin. Microbiol. Infektera. 2021, 27, 47–54. [CrossRef] [PubMed]

57. Liu, X.; Zhou, H.; Zhou, Y.; Wu, X.; Zhao, Y.; Lu, Y.; Tan, W.; Yuan, M.; Ding, X.; Zou, J.; et al. Riskfaktorer förknippade med sjukdomens svårighetsgrad och längd på sjukhusvistelse hos covid-19-patienter. J. Infect. 2020, 81, e95–e97. [CrossRef]

58. Luo, XH; Zhu, Y.; Mao, J.; Du, RC T-cells immunbiologi och cytokinstorm av COVID-19. Scand. J. Immunol. 2021, 93, e12989. [CrossRef] [PubMed]

59. Harwood, O.; O'Connor, S. Terapeutisk potential för IL-15 och N-803 vid HIV/SIV-infektion. Virus 2021, 13, 1750. [CrossRef] [PubMed]

60. Shin, H.; Wherry, EJ CD8 T-celldysfunktion under kronisk virusinfektion. Curr. Opin. Immunol. 2007, 19, 408–415. [CrossRef]

61. McMahan, K.; Yu, J.; Mercado, NB; Loos, C.; Tostanoski, LH; Chandrashekar, A.; Liu, J.; Peter, L.; Atyeo, C.; Zhu, A.; et al. Korrelat av skydd mot SARS-CoV-2 hos rhesusmakaker. Nature 2021, 590, 630–634. [CrossRef]

62. Zhuang, Z.; Lai, X.; Sun, J.; Chen, Z.; Zhang, Z.; Dai, J.; Liu, D.; Li, Y.; Li, F.; Wang, Y.; et al. Kartläggning och roll för T-cellssvar i SARS-CoV-2-infekterade möss. J. Exp. Med. 2021, 218, e20202187. [CrossRef]

63. Westmeier, J.; Paniskaki, K.; Karaköse, Z.; Werner, T.; Sutter, K.; Dolff, S.; Overbeck, M.; Limmer, A.; Liu, J.; Zheng, X.; et al. Nedsatt cytotoxisk CD8+ T-cellssvar hos äldre covid-19-patienter. MBio 2020, 11, e02243-20. [CrossRef]

64. Laing, AG; Lorenc, A.; del Barrio, IDM; Das, A.; Fish, M.; Monin, L.; Muñoz-Ruiz, M.; McKenzie, DR; Hayday, TS; Francos Quijorna, I.; et al. En dynamisk covid-19-immunsignatur inkluderar associationer med dålig prognos. Nat. Med. 2020, 26, 1623–1635. [CrossRef]

65. Kuri-Cervantes, L.; Pampena, MB; Meng, W.; Rosenfeld, AM; Ittner, CAG; Weisman, AR; Agyekum, RS; Mathew, D.; Baxter, AE; Vella, LA; et al. Omfattande kartläggning av immunförändringar i samband med allvarlig covid-19. Sci. Immunol. 2020, 5, eabd7114. [CrossRef]

66. Aktas, E.; Kucuksezer, UC; Bilgic, S.; Erten, G.; Deniz, G. Förhållande mellan CD107a-uttryck och cytotoxisk aktivitet. Cell. Immunol. 2009, 254, 149–154. [CrossRef]

67. Björkström, NK; Strunz, B.; Ljunggren, H.-G. Naturliga mördarceller i antiviral immunitet. Nat. Rev. Immunol. 2022, 22, 112–123. [CrossRef] [PubMed]

68. Bi, J. NK-celldysfunktion hos patienter med covid-19. Cell. Mol. Immunol. 2022, 19, 127–129. [CrossRef] [PubMed]

69. Alter, G.; Malenfant, JM; Altfeld, M. CD107a som en funktionell markör för identifiering av naturlig mördarcellaktivitet. J. Immunol. Metoder 2004, 294, 15–22. [CrossRef] [PubMed]

70. Gustine, JN; Jones, D. Immunopathology of Hyperinflammation in COVID-19. Am. J. Clin. Patol. 2021, 191, 4–17. [CrossRef] [PubMed]

71. Han, C.; Zhou, Y.; Li, Z.; Farooq, MA; Ajmal, I.; Zhang, H.; Zhang, L.; Tao, L.; Yao, J.; Du, B.; et al. Samuttryck av IL-7 förbättrar NKG2D-baserad CAR T-cellsterapi på prostatacancer genom att öka expansionen och hämma apoptos och utmattning. Cancers 2020, 12, 1969. [CrossRef]